التعرف على مصدر البروتينات المفرزة في الكلى عن طريق حقن بريفيلدين أ

يعد تحديد نوع الخلية المسؤولة عن إفراز السيتوكينات أمرا ضروريا لفهم البيولوجيا المرضية لأمراض الكلى. هنا ، نصف طريقة لتلطيخ أنسجة الكلى كميا للسيتوكينات التي تنتجها الخلايا الظهارية أو الخلالية الكلوية باستخدام بريفيلدين أ ، مثبط إفراز ، وعلامات خاصة بنوع الخلية.

يعد مرض الكلى المزمن (CKD) أحد الأسباب العشرة الرئيسية للوفاة في الولايات المتحدة الأمريكية. إصابة الكلى الحادة (AKI) ، على الرغم من أنها غالبا ما تكون قابلة للشفاء ، إلا أنها تهيئ المرضى للإصابة بمرض الكلى المزمن في وقت لاحق من الحياة. تم تحديد الخلايا الظهارية للكلى على أنها عقد إشارات رئيسية في كل من AKI و CKD ، حيث يمكن للخلايا تحديد مسار المرض من خلال إفراز السيتوكينات والبروتينات الأخرى. في مرض الكلى المزمن على وجه الخصوص ، أظهرت عدة خطوط من الأدلة أن الخلايا الأنبوبية التي تم إصلاحها بشكل غير قادر على التكيف تدفع تطور المرض من خلال إفراز عامل النمو المحول بيتا (TGF-β) ، وعامل نمو النسيج الضام (CTGF) ، والسيتوكينات الليفية الأخرى. ومع ذلك ، فإن تحديد المصدر والعدد النسبي للبروتينات المفرزة من أنواع مختلفة من الخلايا في الجسم الحي لا يزال يمثل تحديا.

تصف هذه الورقة تقنية باستخدام بريفيلدين أ (BFA) لمنع إفراز السيتوكينات ، مما يتيح تلطيخ السيتوكينات في أنسجة الكلى باستخدام تقنيات الفلورسنت المناعي القياسية. يمنع BFA نقل الشبكة الإندوبلازمية (ER) إلى جهاز جولجي ، وهو أمر ضروري لإفراز السيتوكينات والبروتينات الأخرى. يؤدي حقن BFA قبل 6 ساعات من التضحية إلى تراكم TGF-β و PDGF و CTGF داخل خلايا النبيبات القريبة (PTCs) في نموذج سيسبلاتين الفأر من AKI و TGF-β في نموذج حمض أريستولوتشيك الفأر (AA) من CKD. كشف التحليل أن BFA + cisplatin أو BFA + AA زادت من إشارة TGF-β الإيجابية بشكل ملحوظ مقارنة ب BFA + محلول ملحي أو سيسبلاتين أو AA وحده. تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام BFA لتحديد نوع الخلية التي تنتج سيتوكينات معينة وتحديد الكميات النسبية و / أو الأنواع المختلفة من السيتوكينات المنتجة.

تشير التقديرات إلى أن >10٪ من سكان العالم يعانون من شكل من أشكال أمراض^{الكلى 1}. يتم تحديده من خلال ظهوره السريع ، AKI قابل للشفاء إلى حد كبير. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي نوبة AKI إلى تهيئة المرضى للإصابة بمرض الكلى المزمن في وقت لاحق من الحياة^2،3. على عكس AKI ، يتميز مرض الكلى المزمن بالتليف التدريجي وتدهور وظائف الكلى ، مما يؤدي إلى مرض كلوي في المرحلة النهائية يتطلب علاجا باستبدال الكلى. تستهدف معظم إصابات الكلى الخلايا الظهارية المتخصصة ، مثل الخلايا البودية أو خلايا النبيبات القريبة ، التي تشكل النيفرون^4،5. بعد الإصابة ، تساعد الخلايا الظهارية الباقية على تنسيق استجابة الإصلاح من خلال إفراز السيتوكينات والبروتينات الأخرى. بهذه الطريقة ، يمكن للخلايا الباقية تعديل الاستجابة المناعية ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية المباشرة ، والمساعدة في تعافي الأعضاء.

السيتوكينات هي بروتينات صغيرة مفرزة ضرورية لتعديل نضوج الكائنات متعددة الخلايا ونموها واستجابتها^6،7. تعمل كرسل إشارة بين أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك الخلايا المناعية^{والظهارية 8}. على الرغم من أنه يعتقد أن السيتوكينات تفرز بشكل أساسي بواسطة الخلايا المناعية ، فقد أظهرت الأبحاث طويلة الأمد أن الخلايا الظهارية والخلالية في الكلى تفرز أيضا السيتوكينات كإشارات لخلايا الكلى المقيمة الأخرى ، مثل الخلايا الأنبوبية والخلايا الخلالية والخلايا المناعية^9،10. تلعب PTCs ، على وجه الخصوص ، دورا مهما في مرحلة البدء والتعافي بعد AKI¹¹. ومع ذلك ، من المعروف أن PTCs التي تم إصلاحها بشكل غير قادر على التكيف تفرز السيتوكينات الليفية مثل تحويل عامل النمو β (TGF-β) ، وعامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - D (PDGF-D) ، وعامل نمو النسيج الضام (CTGF) ، مما يساهم في تطور مرض الكلى^{المزمن 12}. وبالتالي ، تستخدم الخلايا الظهارية في الكلى السيتوكينات المفرزة لتعديل إصابة الكلى.

في حين أنه من المعروف أن الخلايا الظهارية في الكلى تفرز السيتوكينات ، إلا أنه كان من الصعب تحديد المصدر الدقيق والمساهمة النسبية لكل نوع من الخلايا بسبب التحديات التقنية لدراسة البروتينات المفرزة¹³. يعد قياس التدفق الخلوي ، وهو نهج شائع يستخدم لقياس السيتوكينات ، أمرا صعبا في إجراؤه على الكلى المصابة ، خاصة في الكلى شديدة التليف. مع Cre recombinase مدفوعا بمحفز السيتوكين ، غالبا ما تستخدم الفئران المراسلة السيتوكين لتحديد نوع الخلية التي تعبر عن سيتوكين معين. ومع ذلك ، فإن استخدام الفئران المراسلة محدود بسبب الحاجة إلى عبور الفئران المراسلة إلى خلفيات خروج المغلوب المختلفة ، وعدم وجود مراسلين مناسبين ، وحقيقة أنه يمكن تحليل سيتوكين واحد فقط في كل مرة. وبالتالي ، من الضروري تطوير تقنية بسيطة ومتعددة الاستخدامات وبأسعار معقولة للكشف عن خلايا الكلى التي تطلق السيتوكينات.

افترضنا أن حقن BFA ، وهو مثبط إفراز يمنع نقل الشبكة الإندوبلازمية - جولجي في الجسم الحي سيسمح بتلوين البروتينات المفرزة في أنسجة الكلى (الشكل 1 أ ، ب) ، كما هو موضح في المقايسات القائمة على قياس التدفق^{الخلوي 14،15}. جنبا إلى جنب مع الصانعين الخاصين بنوع الخلية ، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد المصدر والمساهمة النسبية للخلايا المنتجة للسيتوكينات في الكلى المصابة. على عكس عينات قياس التدفق الخلوي ، يمكن الاحتفاظ بالأنسجة الثابتة على المدى الطويل مع الحفاظ على البروتينات والهياكل الخلوية ، مما يسمح بإجراء فحص أكثر شمولا للخلايا الإفرازية. لاختبار هذه الفرضية ، أصيبت كلى الفئران بنموذج AKI (سيسبلاتين) ونموذج من CKD (اعتلال الكلية بالحمض الأريستولوتشيك (AAN)) ، تم حقنها ب BFA ، وتلطيخها باستخدام تقنيات الفلورسنت المناعي القياسية.

تم إجراء جميع التجارب على وفقا لبروتوكول استخدام المعتمد من قبل لجنة رعاية المؤسسية والمستخدم في المركز الطبي بجامعة فاندربيلت.

1.

1. استخدم ذكور BALB / c البالغة من العمر 8-12 أسبوعا (وزن الجسم: حوالي 25 جم) لاعتلال الكلية الناجم عن حمض السيسبلاتين أو الحمض الأريستولوتشيك.
2. تأكد من أن الفئران تتمتع بصحة جيدة وليس لديها علامات واضحة على الضيق أو الجروح الناتجة عن القتال.
   ملاحظة: يمكن أن تتداخل الجروح ، خاصة في الذيل ، مع البروتوكول الموضح هنا. تم اختيار الفئران BALB / c لأنه من الأسهل تصور وريد الذيل للحقن في هذه الفئران. يعمل البروتوكول الموصوف هنا مع سلالات الفئران الأخرى. ومع ذلك ، قد تختلف جرعة سيسبلاتين أو حمض الأريستولوتشيك من سلالة إلى أخرى.

2. حقن سيسبلاتين

1. قم بإذابة السيسبلاتين في محلول ملحي معقم إلى تركيز نهائي يبلغ 1 مجم / مل.
   ملاحظة: لن يذوب سيسبلاتين تماما في درجة حرارة الغرفة. يجب التعامل معها في غطاء الدخان.
2. قم بتسخين محلول السيسبلاتين في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ودوامة بشكل متكرر حتى يذوب السيسبلاتين تماما.
3. قم بوزن الفئران وحساب حجم محلول سيسبلاتين اللازم لحقن 20 مجم / كجم من وزن الجسم (وزن الجسم).
4. تطهير جلد البطن باستخدام مسحات بوفيدون اليود (7.5٪) والكحول (70٪) بالتناوب 3 مرات لكل منهما.
5. باستخدام حقنة الأنسولين بإبرة 25 جم ، قم بحقن محلول السيسبلاتين داخل الصفاق.
6. انتقل إلى القسم 4 في اليوم 3 بعد الحقن.

3. حقن حمض الأريستولوتشيك (AA)

1. قم بإذابة حمض الأريستولوتشيك-I في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بتركيز نهائي يبلغ 0.5 مجم / مل.
   ملاحظة: يجب التعامل مع AA في غطاء الدخان. يجب استخدام AA-I لأنه الشكل السائد الذي يسبب إصابة الكلى.
2. قم بتسخين محلول AA في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ودوامة بشكل متكرر حتى يذوب تماما.
3. قم بوزن الفئران واحسب حجم محلول AA لحقن 5 مجم / كجم من وزن الجسم.
4. تطهير جلد البطن باستخدام بوفيدون اليود (7.5٪) والكحول (70٪) مسحة 3x.
5. باستخدام حقنة الأنسولين بإبرة 25 جم ، قم بحقن محلول AA داخل الصفاق
6. حقن AA كل يومين لما مجموعه 3 حقن.
7. انتقل إلى القسم 4 في اليوم 42 بعد الحقن الأخير.

4. تحضير محلول BFA

1. قم بإذابة BFA في ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيز 10 مجم / مل لعمل محلول مخزون.
2. قم بتخزين محلول المخزون عند -20 درجة مئوية.
3. تمييع محلول مخزون BFA باستخدام PBS معقم عند تركيز العمل النهائي البالغ 1.25 مجم / مل
   ملاحظة: قم بإعداد محلول عمل جديد في كل مرة مباشرة قبل الحقن.

5. حقن الوريد الذيل من BFA

1. قبل الحقن ، ضع نصف القفص ، ونصفه من وسادة التدفئة لمدة 10 دقائق للتأكد من دفء الفئران لمنع انخفاض درجة حرارة الجسم ، مما قد يتسبب في تضيق الأوعية الدموية في الذيل والتداخل مع الحقن.
   ملاحظة: ضع القفص على وسادات التدفئة بحيث يكون نصف القفص على الوسادة بينما لا يكون النصف كذلك. بهذه الطريقة ، عندما تشعر الفئران بالدفء ، يمكنها الانتقال إلى الجانب الآخر من القفص والعكس صحيح.
2. كبح جماح الفئران باستخدام أجهزة التقييد المتاحة تجاريا بالحجم المناسب.
3. تطهير الذيل باستخدام بوفيدون اليود ومسحة الكحول ثلاث مرات كما هو موضح أعلاه.
4. أمسك الذيل أفقيا وتصور عروق الذيل الجانبية (الشكل 1 ج). استخدم مصدر ضوء أسفل الذيل للمساعدة في تصور الأوردة.
5. أدخل إبرة 28 جم ، مع الحفاظ على الإبرة والحقنة موازية للوريد باتجاه الرأس.
6. حقن 200 ميكرولتر من محلول BFA 1.25 ملغم/مل (0.25 مجم BFA). انتظر حتى يصبح الوريد واضحا حيث يتم استبدال الدم بمحلول الحقن ، مما يشير إلى نجاح الحقن.
7. قم بإزالة الإبرة واضغط على الذيل برفق حتى يتوقف النزيف.
8. أعد الفئران إلى القفص وراقبها بحثا عن نزيف إضافي أو علامات الضيق.

6. التضحية وحصاد الكلى

1. قتل الفئران بجرعة زائدة من الأيزوفلوران متبوعا بخلع عنق الرحم بعد 6 ساعات من حقن BFA.
   ملاحظة: تم اختيار النقطة الزمنية التي تبلغ 6 ساعات بناء على الأدبيات التي توضح أن 6 ساعات من علاج BFA في الأعضاء الأخرى تسمح بتراكم كاف من السيتوكينات داخل الخلايا لتصورها عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي¹⁶.
2. مباشرة بعد التضحية ، قم بتعريض بطن وقلب الفأر عن طريق شق خط الوسط البطني.
3. اجمع 100-500 ميكرولتر من الدم لفحص نيتروجين اليوريا في الدم (BUN) عن طريق ثقب القلب. استخدم إبر 25 جم مع محاقن الأنسولين سعة 1 مل لجمع الدم. لمنع التخثر ، أضف 5 ميكرولتر من محلول الهيبارين (100 مجم / 15 مل من dH₂O) إلى كل عينة.
   ملاحظة: هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 20 ميكرولتر من الدم لاختبار BUN. ومع ذلك ، يمكن جمع ما يقرب من 500 ميكرولتر عن طريق ثقب القلب بعد القتل الرحيم ، والذي يمكن أن يكون مفيدا للمقايسات الأخرى. اجمع أكبر قدر ممكن من الدم.
4. قم بتخزين عينات الدم على الثلج حتى يتم جمع الكلى في القسم 7 أدناه.
   1. الطرد المركزي لعينات الدم عند 1,300 × جم لمدة 10 دقائق.
   2. اعزل البلازما برفق وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لإجراء اختبار BUN في القسم 17 أدناه. بدلا من ذلك ، قم بتخزين عينات البلازما لمقايسات الكرياتينين.

7. نضح وإزالة الكلى

1. قم ببث الماوس ب 10-20 مل من PBS من خلال البطين الأيسر باستخدام حقنة سعة 20 مل بمعدل تدفق 2-4 مل / دقيقة حتى يصبح الإنفوز واضحا.
2. قم بإزالة الكلى عن طريق إمساك الشريان الكلوي والوريد بالملقط بالقرب من الحليمة وقطع الأوعية على الجانب بعيدا عن الكلى.
3. قم بإزالة كبسولة الكلى برفق عن طريق تقشيرها يدويا أو باستخدام ملقط ناعم ومعقم.
4. اعتمادا على الجسم المضاد ، انتقل إلى القسم 8 لتحضير الأنسجة الثابتة المضمنة في البارافين أو القسم 10 لتحضير الأنسجة المجمدة الثابتة.
   ملاحظة: ستحتاج معالجة الأنسجة إلى الأمثل لكل جسم مضاد لاستخدامه في التلوين.

8. الأنسجة المدمجة في البارافين لتلوين TGF-β و PDGF-D

1. قم بتقسيم الكلية عن طريق وضعها على شريحة زجاجية نظيفة وقطعها أفقيا بشفرة حلاقة جديدة. ضع نصفا في 10 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS لمدة 24 ساعة على دوار طرف على طرف بسرعة 10 دورات في الدقيقة (دورة في الدقيقة).
   ملاحظة: الكلية بأكملها ليست ضرورية للتقسيم. يمكن تخزين نصف الكلى أو استخدامها في فحوصات أخرى.
2. استبدل PFA بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. أرسل نصف الكلى للمعالجة وتضمين البارافين في هذه المرحلة ثم قم بتقسيم أنسجة الكلى المضمنة في البارافين عند 4-6 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم وقم بتثبيتها على شرائح مشحونة ونظيفة^{مسبقا 17،18}.
   ملاحظة: تمت معالجة الكلى ودمجها في البارافين بواسطة المورد المشترك لعلم الأمراض الانتقالي التابع للمركز الطبي بجامعة فاندربيلت وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.

9. إزالة البارافين والإماهة

1. ضع الشرائح في رف تلطيخ منزلق واغمسها في بئر تلطيخ يحتوي على D-limonene لمدة 5 دقائق ، مع التأكد من غمر الأنسجة بالكامل. كرر في بئر يحتوي على D-Limonene الطازج.
2. أعد ترطيب الأنسجة عن طريق غمس الشرائح في تخفيفات متسلسلة من الإيثانول 100٪ (2x) و 95٪ و 90٪ و 70٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما.
3. اغسل الشرائح في dH₂O المتدفق لمدة 5 دقائق.
4. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق احتضان الأقسام في عازلة السترات (درجة الحموضة 6.0) في قدر الضغط عند 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 45 دقيقة.
5. اغسل الشرائح في درجة حرارة_{متدفقة 2}درجة حرارة لمدة 20 دقيقة.
6. انتقل إلى القسم 12.

10. تحضير الأنسجة المجمدة لتلوين CTGF

1. قم بتقسيم الكلية على طول المحور الأفقي باستخدام شفرة حلاقة جديدة.
   ملاحظة: الكلية بأكملها ليست ضرورية للتقسيم. يمكن تخزين نصف الكلى أو استخدامها في فحوصات أخرى.
2. ضع نصف الكلى في 10 مل من 0.5٪ PFA في أنبوب 15 مل على دوار لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية بسرعة 10 دورة في الدقيقة.
3. صب PFA في وعاء للتخلص منه بشكل صحيح وأضف 10 مل من 0.1 M glycine في PBS لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية بسرعة 10 دورة في الدقيقة.
4. صب الجلايسين ، وأضف 10 مل من السكروز المذاب بنسبة 15٪ في PBS ، وضع الأنبوب على دوار طوال الليل عند 4 درجات مئوية و 10 دورات في الدقيقة.
5. صب السكروز بنسبة 15٪ واستبدلها ب 10 مل من السكروز المذاب بنسبة 30٪ في PBS لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية و 10 دورات في الدقيقة.
6. املأ قالب التضمين بمركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) وقم بتضمين نصف الكلية من الخطوة 10.5 بحيث يكون السطح المقطوع للكلية متجها لأسفل.
7. ضع القالب الذي يحتوي على نصف الكلية و OCT بعناية في بركة من النيتروجين السائل لتجميده.
   ملاحظة: لا تدع النيتروجين السائل يتصل مباشرة ب OCT لأن هذا قد يؤدي إلى تكوين فقاعة. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند استخدام النيتروجين السائل ، مثل النظارات الواقية / واقي الوجه والقفازات المبردة ومعطف المختبر. من الأفضل استخدام ملقط طويل ~ 25 سم لوضع القوالب في النيتروجين السائل.
8. بمجرد تجميده صلبا ، قم بتخزين القالب عند -80 درجة مئوية.

11. التقسيم المجمد

1. تأكد من أن ناظم البرد عند -20 درجة مئوية.
2. قم بتخزين القوالب التي تحتوي على عينات في OCT في ناظم البرد عند -20 درجة مئوية لمدة ساعتين لموازنة درجة الحرارة.
3. قم بإزالة القالب عن طريق الضغط على الألسنة والضغط من الأسفل.
4. ضع OCT الطازج على حامل العينة وضع كتلة العينة المجمدة في الأعلى ، بحيث يكون جانب الأنسجة متجها بعيدا عن حامل العينة.
5. ضع حامل العينة والعينة على رف التجميد.
6. ضع مستخرج حراري مرجح أعلى الكتلة لتسطيح السطح. احتفظ بغطاء ناظم البرد مغلقا عند عدم استخدامه لمنع تقلبات درجات الحرارة.
7. بمجرد تجميد OCT الطازج بين كتلة العينة وحامل العينة ، تحقق للتأكد من أن الاتصال آمن.
8. قم بتثبيت حامل العينة على رأس ناظم الكريوستات.
9. ابدأ في التقسيم حتى يصبح النسيج مرئيا في كتلة العينة.
10. قم بتقسيم أنسجة الكلى عند 4-6 ميكرومتر والتقط الأقسام على شريحة مشحونة بدرجة حرارة^{الغرفة 19}.
11. بمجرد التقاط المنديل ، قم بتخزين الشريحة عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتلطيخ. لا تدعه يذوب حتى يصبح جاهزا لبدء تلطيخه.
12. قبل التلوين ، قم بإزالة الشريحة (الشريحة) من التخزين واتركها دافئة إلى درجة حرارة الغرفة. لا تدع الأقسام تجف.
13. بمجرد وصولك إلى درجة حرارة الغرفة ، اغسل الأقسام على الفور باستخدام PBS لمدة 5 دقائق مرتين في درجة حرارة الغرفة للتخلص من مركب OCT.
14. انتقل إلى القسم 12.

12. تلطيخ التألق المناعي

1. حدد أقسام الأنسجة بقلم تحديد حاجز مسعور. حافظ على مسافة لا تقل عن 5 مم من الأنسجة إلى مخطط الحاجز الكارهة للماء.
2. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على مصل الحمير 3٪ و 0.1٪ تريتون في 1٪ من الألبومين البقري / محلول ملحي مخزن (TBS) أعلى القسم واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
3. تمييع الأجسام المضادة الأولية باستخدام PBS بالتركيز المناسب. للكشف عن السيتوكينات ، استخدم 50 ميكرولتر من محاليل الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد TGF-β1 (1: 200) و PDGF-D (1: 400) و CTGF (1: 200). لوضع العلامات على الخلايا الليفية العضلية ، استخدم 50 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي الموجه ضد أكتين العضلات الملساء ألفا (α-SMA) المقترن ب Cy3 عند 1: 200.
4. قم بإزالة محلول الانسداد وإضافة الأجسام المضادة الأولية إلى القسم ، مع التأكد من عدم تسربه من المخطط الدائري الكارهة للماء واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة. أعد تطبيق الحاجز الكارهة للماء في حالة حدوث تسرب.
5. اغسل 3 مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق.
6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة عند 1: 200 باستخدام PBS.
7. احتضان العينات ب 50 ميكرولتر من محاليل الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
8. يغسل مع PBS لمدة 5 دقائق.
9. مخفف اللوتس رباعي اللوتس (LTL) مترافق مع الفلورسين في PBS مع Ca²⁺ و Mg²⁺ بتركيز 10 ميكروغرام / مل.
   ملاحظة: Ca²⁺ و Mg²⁺ ضروريان لربط LTL.
10. احتضان الأنسجة ب 50 ميكرولتر من محلول LTL لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
11. يغسل باستخدام PBS مع Ca²⁺ و Mg²⁺ لمدة 5 دقائق.
12. احتضن مع 50 ميكرولتر من 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، 5 ميكروغرام / مل في الماء) لتلطيخ الحمض النووي / النوى لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
13. قم بتركيب الغطاء عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من كاشف التثبيت المضاد للبهتان على المنديل ووضع الغطاء ببطء. انتظر لمدة 24 ساعة حتى يتجمد الكاشف المضاد للبهتان قبل التصوير.
    ملاحظة: يمكن أن يتحلل ربط الليكتين بمرور الوقت ، مما يؤدي إلى فقدان الإشارة. من الأفضل تصوير عينات ملطخة بالليكتين بعد فترة وجيزة من إعداد كاشف التثبيت. إذا لوحظ فقدان الإشارة ، يمكن إضافة Ca²⁺ و Mg²⁺ إلى كاشف التثبيت للحفاظ على التلوين.

13. الحصول على الصور

1. قم بتشغيل المجهر المقلوب (انظر جدول المواد) باستخدام مرحلة XY الآلية.
2. حدد هدف 20x.
3. افتح برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد).
4. انقر فوق Live لفتح نافذة العرض المباشر.
5. ابحث عن قسم المناديل وتأكد من تركيزه.
6. انقر فوق قائمة Acquisition وحدد Scan Large Image.
7. في نافذة Scan Large Image (مسح الصورة الكبيرة )، قم بإعداد المنطقة المراد مسحها ضوئيا عن طريق تحريك المسرح باستخدام عصا التحكم إلى الجزء الموجود في أقصى اليسار من قسم الأنسجة والنقر فوق السهم الأيسر. كرر ذلك لأجزاء الأنسجة العلوية واليمينية والسفلية.
8. انقر فوق قائمة الاستحواذ .
9. تأكد من تحديد خانة الاختيار الخاصة بالصورة الكبيرة.
   1. إذا كنت تلتقط صورا متعددة القنوات ، فانقر فوق علامة التبويب Lambda .
   2. انقر فوق كل قناة واضبط وقت التعرض على مستوى يكون فيه التلوين واضحا دون تشبع أي جزء من الصورة.
      ملاحظة: يجب أن تكون هذه الإعدادات متسقة داخل مجموعة تجريبية واحدة. سيؤدي تغيير إعدادات الاكتساب بين العينات إلى نتائج غير دقيقة.
   3. كرر الخطوة 9.2 لكل قناة سيتم جمعها.
10. انقر فوق مسح.

14. تحليل الصور

1. افتح برنامج الحصول على الصور.
2. انقر فوق ملف | افتح الصورة وحددها.
3. انقر بزر الماوس الأيمن فوق نافذة الصورة واختر منطقة الاهتمام متعددة الأضلاع (ROI).
4. حدد الخطوط العريضة لعائد الاستثمار باستخدام الأداة اليدوية . حدد الخطوط العريضة لخلايا النبيبات الإيجابية LTL أو الخلايا الخلالية الإيجابية α SMA.
5. انقر فوق علامة التبويب القياس | عتبة.
6. قم بإعداد الحدود العليا والدنيا للحد عن طريق ضبط أشرطة التمرير على جانبي منطقة الإشارة الموجبة.
7. انقر فوق علامة التبويب عائد الاستثمار .
8. انقر فوق أيقونة التصدير لحفظ القيم. استخدم برنامج جداول البيانات لحساب النسبة المئوية لمنطقة الإشارة الإيجابية / منطقة عائد الاستثمار.

15. البديل: تحليل الصور باستخدام البرمجيات الحرة (ImageJ)

1. افتح ImageJ.
2. انقر فوق ملف | افتح لعرض صورة.
3. انقر فوق التحديدات اليدوية.
4. حدد عائد الاستثمار من خلال الخطوط العريضة باستخدام الأداة اليدوية . حدد الخطوط العريضة لخلايا النبيبات الإيجابية LTL أو الخلايا الخلالية الإيجابية α SMA.
5. انقر على تعديل القائمة وحدد مسح في الخارج.
6. انقر فوق تحليل وحدد قياس لتحديد منطقة عائد الاستثمار.
7. الانتقال إلى الصورة | اللون | تقسيم القنوات.
8. اضبط الحدود العليا والسفلية للعتبة لاكتشاف منطقة الإشارة الموجبة.
9. انقر فوق تحليل وحدد قياس.
10. احفظ البيانات.
11. افتح البيانات باستخدام برنامج جداول البيانات واحسب نسبة منطقة الإشارة الإيجابية / منطقة عائد الاستثمار.

16. اختياري: التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر

ملاحظة: للحصول على صور عالية الدقة للنشر ، يوفر الفحص المجهري متحد البؤر المسح صورا أكثر وضوحا وخلفية أقل في أنسجة الكلى.

1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر (انظر جدول المواد).
2. حدد هدف 40x (راجع جدول المواد).
3. انقر فوق علامة التبويب تحديد الموقع وابحث عن الأنسجة عن طريق ضبط التركيز.
4. انتقل إلى علامة التبويب "اكتساب "، وانقر فوق القنوات، واختر 1 وحدة فلكية في إعداد الثقب.
5. اضبط شدة كسب الليزر في كل قناة بحيث تكون الإشارة الموجبة مرئية ولكنها غير مشبعة. تأكد من أن الإعدادات داخل مجموعة من العينات التجريبية تظل ثابتة.
6. انقر فوق Snap واحفظ الصورة بالتنسيق المطلوب.

17. مستوى BUN البلازما

1. قم بإزالة العينات من -20 درجة مئوية وإذابة الثلج على الجليد.
2. خفف البلازما ب dH₂O بنسبة 1:10.
3. لكل عينة ، قم بإعداد ثلاثة تفاعلات منفصلة في نسختين في صفيحة مكونة من 96 بئرا.
   1. للعينة بالإضافة إلى المعيار ، أضف 5 ميكرولتر من 200 مجم / ديسيلتر من اليوريا و 20 ميكرولتر من البلازما المخففة.
   2. للعينة وحدها ، أضف 5 ميكرولتر من dH₂O و 20 ميكرولتر من البلازما المخففة.
   3. للعينة الفارغة ، أضف 5 ميكرولتر من dH₂O و 20 ميكرولتر من البلازما المخففة.
4. امزج 85 ميكرولتر من الكاشف + 1 ميكرولتر من اليورياز لكل عينة لتحضير محلول العمل.
5. أضف 80 ميكرولتر من محلول العمل إلى آبار "العينة بالإضافة إلى المعيار" و "العينة وحدها".
6. أضف 80 ميكرولتر من الكاشف (بدون يورياز) إلى بئر "العينة الفارغة" من الخطوة 17.3 أعلاه.
7. اضغط على الطبق برفق لخلطه واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
8. اقرأ OD₅₆₀ باستخدام قارئ لوحة.
9. احسب تركيز اليوريا Eq (1) وقم بتحويله إلى BUN باستخدام المعادلة (2).
   اليوريا (ملغم/ديسيلتر) = (العينة وحدها - العينة فارغة)/(العينة القياسية وحدها) × (قياسي/4) × (عامل التخفيف) (1)
   BUN (ملغم/ديسيلتر) = تركيز اليوريا/2.14 (2)
   ملاحظة: يقيس هذا الاختبار محتوى اليوريا (الوزن الجزيئي: 60) في المصل. ومع ذلك ، يشير BUN فقط إلى محتوى النيتروجين في اليوريا (الوزن الجزيئي: 28). وبالتالي ، هناك حاجة إلى تصحيح 2.14 (60/28) لتحويل تركيز اليوريا إلى BUN.

لفحص دور الخلايا الظهارية الأنبوبية في إنتاج السيتوكين بعد AKI الناجم عن السيسبلاتين ، تم حقن السيسبلاتين بتركيز 20 مجم / كجم متبوعا بحقن وريدي 0.25 مجم من BFA في اليوم 3 بعد حقن السيسبلاتين. تم حصاد الكلى بعد 6 ساعات. تم تقطيع الكلى المضمنة في البارافين وتلطيخها ب TGF-β و PDGF-D و CTGF ، وهي السيتوكينات التمثيلية المسؤولة عن إصلاح الأنسجة في AKI. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، لوحظت حويصلات TGF-β ⁺ في PTCs المسمى ب LTL في الكلى المعالجة بالسيسبلاتين في وجود BFA. وفي الوقت نفسه ، لم يتم ملاحظة حويصلات TGF-β ⁺ في الكلى غير المصابة أو غير المعالجة ب BFA.

كشف القياس الكمي عن زيادة في منطقة TGF-β1 ⁺ مع علاج BFA في AKI الناجم عن السيسبلاتين (الشكل 2 ب). على غرار الحويصلات TGF-β أو PDGF-D ⁺ أو CTGF ⁺ المتراكمة أيضا مع علاج BFA في AKI الناجم عن السيسبلاتين (الشكل 2C والشكل 2E). أظهر القياس الكمي أن مناطق PDGF-D ⁺ و CTGF ⁺ قد زادت بشكل كبير مع BFA في LTL ⁺ PTCs (الشكل 2D والشكل 2F). لدراسة تأثير العلاج BFA على وظائف الكلى ، تم قياس مستويات BUN في البلازما في اليوم 3 بعد حقن السيسبلاتين. كما هو موضح في الشكل 2G ، لم يؤدي حقن BFA إلى زيادة مستويات BUN في البلازما بشكل كبير.

بعد ذلك ، للتحقق من السيتوكينات التي تفرزها الخلايا الخلالية في AKI الناجم عن السيسبلاتين ، تم تلطيخ الكلى ل TGF-β أو CTGF ، وتم تصنيف الخلايا الليفية العضلية الخلالية بواسطة α-SMA. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، لوحظت حويصلات TGF-β ⁺ في الخلايا الخلالية المسماة α-SMA في سيسبلاتين-AKI مع علاج BFA (الشكل 3 أ). لتحديد الإشارة داخل خلايا α-SMA ⁺ ، تم تحديد منطقة α-SMA ⁺ وتم تحديد إشارات السيتوكين الإيجابية و α-SMA داخل المنطقة. كشف القياس الكمي أن منطقة TGF-β ⁺ في منطقة α-SMA ⁺ قد زادت بشكل كبير مع علاج BFA في سيسبلاتين AKI (الشكل 3 ب). زادت حويصلات CTGF ⁺ أيضا مع علاج BFA (الشكل 3C) ، وأظهر القياس الكمي أن علاج BFA عزز نسبة منطقة CTGF ⁺ / منطقة α-SMA ⁺ في AKI الناجم عن السيسبلاتين (الشكل 3 د).

لتحديد ما إذا كان يمكن استخدام علاج BFA في نماذج إصابات الكلى المزمنة ، تم إحداث إصابة الكلى عن طريق ثلاث جرعات من AA ، والتي تحفز AKI التي تتطور إلى إصابة مزمنة مع التليف الكلوي الناضج وذات صلة سريريا بمرض الكلى المزمن البشري. تم حقن BFA في اليوم 42 بعد حقن AA ، وتم حصاد الكلى بعد 6 ساعات. بالمقارنة مع الإصابة الناجمة عن السيسبلاتين ، كانت حويصلات TGF-β ⁺ في PTCs أصغر بكثير في المرحلة المزمنة من AA. كان هناك الحد الأدنى من التلوين الإيجابي في LTL ⁺ PTCs. ومع ذلك ، تمت زيادة شدة إشارة TGF-β في جزيء إصابة الكلى -1 إيجابي (KIM-1 ⁺) PTCs مع علاج BFA (الشكل 3E). كان متوسط مستوى شدة TGF-β أعلى 3 مرات مع حقن BFA مقارنة ب BFA (الشكل 3F). تشير هذه النتيجة إلى أنه يمكن استخدام حقن BFA في الجسم الحي لتلوين التألق المناعي وبالاشتراك مع علامات أخرى لتقييم إنتاج السيتوكين بطريقة خاصة بنوع الخلية.

الشكل 1: التمثيل التخطيطي لأسلوب عمل BFA. (أ) يمنع BFA نقل ER إلى Golgi للحويصلات المحتوية على بروتينات المراد إفرازها ، مثل TGF-β. (ب) يحفز BFA تراكم السيتوكينات داخل الخلايا ، مثل TGF-β ، في الخلايا الظهارية الأنبوبية للكلى. (ج) المقطع العرضي التخطيطي لذيل الفأر. الأوردة الجانبية هي الأكثر سهولة للحقن. الاختصارات: BFA = brefeldin A; ER = الشبكة الإندوبلازمية. TGF-β = تحويل عامل النمو بيتا ؛ BFA- = BFA سلبي ؛ BFA + = إيجابي BFA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: يكتشف التألق المناعي بحقن BFA الحويصلات الغنية بالسيتوكين في الخلايا الظهارية الأنبوبية بعد إصابة الكلى الحادة الناجمة عن السيسبلاتين. (أ) صور تمثيلية لحويصلات TGF-β ⁺ في اليوم 3 بعد إعطاء السيسبلاتين (20 مجم / كجم) أو المحلول الملحي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تشير الأسهم إلى حويصلات TGF-β⁺ في PTCs. (ب) القياس الكمي ل TGF-β⁺ حويصلات / أنابيب في محلول ملحي (ن = 5) ، محلول ملحي + BFA (ن = 5) ، رابطة الدول المستقلة (ن = 5) ، رابطة الدول المستقلة + BFA (ن = 5). (ج) صور تمثيلية لحويصلات PDGF-D في اليوم 3 بعد إعطاء سيسبلاتين (20 مجم / كجم) أو المحلول الملحي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (د) القياس الكمي ل PDGF-D ⁺ الحويصلات / الأنابيب في محلول ملحي (ن = 4) ، محلول ملحي + BFA (ن = 4) ، رابطة الدول المستقلة (ن = 4) ، رابطة الدول المستقلة + BFA (ن = 4). (ه) صور تمثيلية لحويصلات CTGF ⁺ في اليوم 3 بعد إعطاء سيسبلاتين (20 مجم / كغ) أو محلول ملحي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (F) القياس الكمي ل CTGF ⁺ الحويصلات / الأنابيب في محلول ملحي (ن = 4) ، محلول ملحي + BFA (ن = 4) ، رابطة الدول المستقلة (ن = 4) ، رابطة الدول المستقلة + BFA (ن = 4). (ز) مستوى BUN في البلازما في اليوم 3 بعد إعطاء سيسبلاتين (20 مجم / كغ): سيسبلاتين (رابطة الدول المستقلة) (ن = 7) وسيسبلاتين + BFA (رابطة الدول المستقلة + BFA) (ن = 3). يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SD. * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.0001. يتم عرض المناطق التي تحدها مربعات بيضاء متقطعة في لوحة داخلية للتكبير العالي. الاختصارات: BFA = brefeldin A; TGF-β = تحويل عامل النمو بيتا ؛ رابطة الدول المستقلة = سيسبلاتين. PDGF-D = عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية D ؛ CTGF = عامل نمو النسيج الضام. BUN = نيتروجين اليوريا في الدم. LTL = لوتس رباعي اللوط ليكتين. DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; HM = تكبير عالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الحويصلات الغنية بالسيتوكينات التي لوحظت في الخلايا الليفية العضلية بعد إصابة الكلى الحادة الناجمة عن السيسبلاتين والخلايا الظهارية الأنبوبية في المرحلة المزمنة من اعتلال الكلية بحمض الأريستولوك. (أ) صور تمثيلية لحويصلات TGF-β ⁺ في اليوم 3 بعد السيسبلاتين (20 مجم / كجم) أو إعطاء محلول ملحي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تشير الأسهم إلى حويصلات TGF-β⁺ في الخلايا الخلالية a-SMA ⁺ . (ب) القياس الكمي لمنطقة TGF-β⁺ / α-SMA ⁺ في محلول ملحي (ن = 4) ، محلول ملحي + BFA (ن = 4) ، رابطة الدول المستقلة (ن = 4) ، رابطة الدول المستقلة + BFA (ن = 4). (ج) صور تمثيلية لحويصلات CTGF ⁺ في اليوم 3 بعد إعطاء سيسبلاتين (20 مجم / كغ) أو محلول ملحي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تشير الأسهم إلى حويصلات CTGF ⁺ في الخلايا الخلالية a-SMA ⁺ . (د) القياس الكمي لمنطقة CTGF ⁺ / منطقة α-SMA ⁺ في محلول ملحي (ن = 4) ، محلول ملحي + BFA (ن = 4) ، رابطة الدول المستقلة (ن = 4) ، رابطة الدول المستقلة + BFA (ن = 4). (ه) صور تمثيلية للكلى الملطخة ب TGF-β (حمراء) في اعتلال الكلية المزمن بحمض الأريستولوكي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (F) القياس الكمي لشدة إشارة TGF-β⁺ / KIM-1⁺ PTCs في AAN (n = 6) و AAN + BFA (n = 6). البيانات المعروضة كوسيلة ± SD. * ص < 0.05 ، *** ص < 0.001 ، ****p < 0.0001. يتم عرض المناطق التي تحدها مربعات بيضاء متقطعة في لوحة داخلية للتكبير العالي. الاختصارات: BFA = brefeldin A; TGF-β = تحويل عامل النمو بيتا ؛ α-SMA = أكتين العضلات الملساء ألفا. رابطة الدول المستقلة = سيسبلاتين. CTGF = عامل نمو النسيج الضام. KIM-1 = جزيء إصابة الكلى -1 ؛ LTL = لوتس رباعي اللوط ليكتين. AAN = اعتلال الكلية بالحمض الأريستولوتشيك. DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; HM = تكبير عالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

من المعروف أن PTCs الكلى تنظم AKI و CKD من خلال إفراز TGF-β و TNF-α و CTGF و PDGF وعامل نمو البطانية الوعائية ، بالإضافة إلى العديد من البروتينات الأخرى^{20،21،22،23}. وبالمثل ، تفرز الكبيبات والأنابيب البعيدة والخلايا الظهارية الأخرى للكلى ، وكذلك الخلايا الخلالية ، هذه و / أو البروتينات الأخرى أثناء الإصابة^24،25،26. يصعب توضيح المساهمة النسبية لكل نوع من هذه الخلايا في إفراز السيتوكين حيث يتم إفراز السيتوكينات بعد فترة وجيزة من إنتاجها. بينما يمكن استخدام التهجين في الموقع وتقنيات تلطيخ الحمض النووي الريبي الأخرى لتلطيخ الحمض النووي الريبي للبروتينات المفرزة ، فمن الصعب الجمع بين هذه التقنيات والتلوين للعلامات الخاصة بنوع الخلية أو علامات الإصابة. بدلا من ذلك ، تجمع العديد من الدراسات بين النتائج في الجسم الحي والتجارب المختبرية التي يتم إجراؤها في خلايا الكلى المستنبتة. في هذه الحالة ، ترتبط بيانات إصابة الكلى ببيانات إفراز السيتوكين من الخلايا المستنبتة لاستخلاص النتائج ، والتي لها قابلية محدودة للترجمة إلى حالة في الجسم الحي .

مكن ظهور تسلسل الجيل التالي و RNAseq أحادي الخلية من تصنيف أنواع الخلايا حسب التعبير الجيني وتحديد الجينات الأخرى التي يعبر عنها كل نوع خلية²⁷. في حين أن هذا يوفر تفاصيل رائعة على أساس سكاني ، إلا أنه غالبا ما يتجاهل الكثير من البيانات التشريحية والمرضية التي يمكن استخلاصها من أقسام الكلى. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يحدد تسلسل الخلية المفردة فقط أعلى 3,000-7,000 جين يتم التعبير عنه في كل خلية ، والتي قد لا توفر عمقا كافيا لفحص جميع السيتوكينات ذات الأهمية²⁸. تقدم هذه الورقة بديلا لهذه النهج. باستخدام BFA لمنع إفراز البروتين ، يمكن تلطيخ أنسجة الكلى مباشرة للسيتوكينات والبروتينات الأخرى ذات الأهمية ، بما في ذلك علامات نوع الخلية باستخدام تقنيات الفلورسنت المناعي القياسية.

تعد TGF-β و PDGF-D و CTGF من بين السيتوكينات الأكثر دراسة على نطاق واسع في إصابة الكلى. من المعروف أن الثلاثة يعملون كسيوف ذات حدين ، مما يعزز التعافي بعد AKI بينما يساهم في تطور التليف في CKD^29،30. في حين أنه من المعروف أن الخلايا الظهارية لأنابيب الكلى والخلايا الخلالية يمكن أن تفرز TGF-β و PDGF-D و CTGF في إصابة الكلى ، إلا أن تحديد نوع الخلية والإنتاج النسبي بشكل مباشر لا يزال يمثل تحديا. في الدراسة الحالية ، اخترنا تلطيخ TGF-β و PDGF-D و CTGF في الكلى أثناء AKI الناجم عن السيسبلاتين ، و TGF-β في نموذج AAN CKD ، جنبا إلى جنب مع علامة PTC LTL ، أو علامة إصابة PTC KIM-1 ، أو علامة الخلايا الليفية العضلية α-SMA. سيسمح ذلك بتحديد ما إذا كانت الخلايا الليفية العضلية أو الخلايا الليفية العضلية تنتج هذه السيتوكينات ومستويات التعبير النسبية بين المجموعات التجريبية.

في الفئران التي عولجت ب BFA وحدها ، كان هناك القليل من التلوين الإيجابي لأي من السيتوكينين. وبالمثل ، أدى علاج السيسبلاتين إلى زيادة هامشية فقط في تلطيخ السيتوكين. أدى الجمع بين إصابة السيسبلاتين وعلاج BFA لمدة 6 ساعات إلى زيادة كبيرة في الإشارات الإيجابية داخل الخلايا لجميع السيتوكينات الثلاثة ، مما يشير إلى أن هذه السيتوكينات تفرز عادة. وبالمثل ، أظهرت مجموعة cisplatin + BFA فقط زيادة كبيرة في إشارة TGF-β و CTGF في الخلايا الخلالية α-SMA ⁺ . في نموذج AAN المزمن ، حيث يرتبط TGF-β باستجابة مرضية ، تسبب حقن AA وحده في بعض تلطيخ TGF-β ، خاصة في KIM-1 ⁺ PTCs المصابة. زاد علاج BFA من الإشارة الإيجابية داخل الخلايا في KIM-1 ⁺ PTCs (PTCs هي خلايا الأنابيب الكلوية الوحيدة المعروفة بالتعبير عن KIM-1³¹). ومن المثير للاهتمام ، أن LTL ⁺ KIM-1 ⁺ أو LTL ⁺ KIM-1^- PTCs لم تظهر تلطيخا كبيرا ب TGF-β ، في حين أن LTL^- KIM-1 ⁺ PTCs لديها المزيد من إيجابية TGF-β. يشير فقدان تلطيخ LTL إلى أن PTCs التي تعبر عن مستويات أعلى من TGF-β مصابة وغير متمايزة في المرحلة المزمنة من الإصابة. من المحتمل أن يكون هذا النمط الظاهري هو الإصلاح غير القابل للتكيف الموصوف^{سابقا 32،33}. وبالتالي ، يوضح علاج BFA أن TGF-β يتم التعبير عنه في PTCs بعد AKI وأثناء CKD.

بينما تركز الدراسة الحالية على تلطيخ الفلورسنت المناعي ، من المهم ملاحظة أنه يمكن دمج علاج BFA مع فحوصات أخرى. على سبيل المثال ، إذا كانت التجربة لا تتطلب تحديد نوع الخلية التي تفرز البروتين محل الاهتمام ، فيمكن للمرء حقن BFA وإجراء لطخة مناعية أو ELISA على محللات الكلى الكاملة في مجموعات التحكم مقابل المجموعات التجريبية. اختبار آخر يمكن مراعاته هو قياس التدفق الخلوي. تم الجمع بين علاج BFA مع قياس التدفق الخلوي في الدراسات المناعية لتحديد الإنتاج النسبي للسيتوكينات في أنواع الخلايا المختلفة¹⁵. في حين أن فصل الخلايا الظهارية الكلوية عن أنسجة الكلى إلى خلايا مفردة قد يكون أمرا صعبا ، فقد يكون قياس التدفق الخلوي بديلا في المختبرات التي تم إنشاء هذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام علاج BFA لدراسات زراعة الخلايا في المختبر في جميع المقايسات المذكورة أعلاه.

تحدد الدراسة الحالية طريقتين من أكثر طرق تحضير الأنسجة شيوعا ، والأنسجة الثابتة المغموسة بالبارافين والأنسجة المجمدة ، والتي تعمل بشكل جيد مع الأجسام المضادة المستخدمة في الدراسة. ومع ذلك ، نظرا للطبيعة المتغيرة للأجسام المضادة ، فمن المحتمل أن يطلب من الباحثين الذين يتبنون هذه التقنية توحيد بروتوكولات التلوين أو معالجة الأنسجة بشكل أكبر ، اعتمادا على الجسم المضاد. نظرا لأن السيتوكينات تفرز عادة ، يتم اختبار عدد قليل من الأجسام المضادة للسيتوكين بحثا عن تلطيخ الأنسجة. لتسريع توحيد البروتوكول ، نوصي بإنشاء ضوابط إيجابية يتم فيها حصاد الأعضاء المعروفة بإفراز السيتوكينات ذات الأهمية بعد علاج BFA. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون الطحال من المعالجة بعديدات السكاريد الدهنية و BFA بمثابة نسيج تحكم إيجابي للعديد من السيتوكينات المختلفة. إن حصاد الطحال ومعالجته كأنسجة مدمجة في البارافين أو مجمدة من شأنه أن يسمح بتوحيد تركيز الأجسام المضادة والمخازن المؤقتة بشكل أسرع. علاوة على ذلك ، إذا تم تمييز الأجسام المضادة للسيتوكين بتلطيخ السيتوكينات في شكلها الأصلي في المختبر ، فمن المرجح أن تتعرف هذه الأجسام المضادة على هدفها في الأنسجة المجمدة الأقل معالجة.

في حين أن علاج BFA يمكن أن يكون أداة قوية عند قياس البروتينات المفرزة ، إلا أنه لا يخلو من قيود. القيد الأكثر وضوحا هو أن البروتين المفرز الذي يتم تحليله يجب أن يتبع مسار إفراز ER-Golgi. خلاف ذلك ، قد يكون ل BFA تأثير محدود. قيد آخر هو أن التي عولجت ب BFA قد تكون قد غيرت النتائج في فحوصات تجريبية أخرى. على سبيل المثال ، تعتمد بعض المؤشرات الحيوية لإصابة الكلى ، مثل KIM-1 ، على نقل ER-Golgi ليتم تقديمه على سطح الخلية. وبالتالي ، من المحتمل أن تنخفض مستويات KIM-1 في البول في الحيوانات المعالجة ب BFA. بالإضافة إلى ذلك ، هناك قلق من أن BFA قد يؤدي إلى زيادة الإجهاد الخلوي. في حين أنه يمكن التخفيف من هذا القلق عن طريق تقليل وقت علاج BFA ، إلا أنه يجب أن يكون في الاعتبار. لم يلاحظ أي زيادة معنوية في BUN في هذه الدراسة. ومع ذلك ، كانت هناك ~ 10٪ زيادة. وبالتالي ، يجب توخي الحذر أثناء تحديد الأهداف أو العلامات الأخرى التي سيتم تحليلها في المعالجة ب BFA.

توضح هذه الدراسة أنه يمكن استخدام BFA لمنع إفراز البروتينات ، مما يؤدي إلى تراكم السيتوكينات داخل الخلايا ، والتي يمكن تلطيخها بواسطة تقنيات التألق المناعي القياسية. يتيح ذلك تحديد أنواع الخلايا التي تفرز سيتوكينات معينة أو بروتينات أخرى ، وتحديد إنتاج السيتوكين بواسطة هذه الخلايا. الميزة الأخرى لهذا البروتوكول هي أنه يمكن الحفاظ على البيانات النسيجية والمرضية وتحليلها في نفس الأقسام التسلسلية أو المجاورة. وبالتالي ، يوفر علاج BFA نهجا فعالا من حيث التكلفة وبسيطا نسبيا لدراسة إنتاج السيتوكين في أنسجة الكلى.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

جمعية القلب الأمريكية (AHA): كينسي تاجوتشي ، 20POST35200221 ؛ HHS | المعاهد الوطنية للصحة | المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK): كريج بروكس ، DK114809-01 DK121101-01.