이 프로토콜은 초점 간질의 가장 일반적인 원인인 WC5 유전자의 노크의 효과를 평가하는 빠른 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 간질을 평가하는 데 사용할 수 있다는 것입니다, 개발의 다양한 단계에서 행동 및 생리적 특징을 모두 사용하여 표현형처럼. 마이크로 주입 하루 전에 Zebrafish 결합 탱크를 설정합니다.
주사의 아침에, 산란을 가능하게 하는 칸막이를 제거합니다. 미세한 체로 계란을 배아 물로 채워진 100mm 페트리 요리로 옮기. 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 60~80개의 달걀을 선택하고 실리콘 코팅 페트리 접시에 달걀을 주선하여 주입합니다.
우리는 물의 대부분을 이동, 중간 계란을 커버하기에 충분한 떠나. 유리 바늘을 사출 용액 튜브에 수직으로 놓습니다. 컬러 솔루션이 몇 분 동안 모세관 작용으로 튜브를 채울 수 있도록 합니다.
주사 용액이 바늘 의 끝에서 볼 때, 마이크로 인젝터의 주입 핸들에 바늘을 장착하고 공기 압축기를 켭니다. 압력 설정을 조정하여 두 개의 나노리터 사출 부피를 생성합니다. 그리고 4 배 배와 해부 쌍안경 현미경 아래에 계란을 배치합니다.
각 세포 내에서 직접 용액을 주입하기 위해 단일 단계 배아의 초리온과 노른자를 통해 바늘 팁을 삽입합니다. 그런 다음 주입된 배아를 배아 물의 100mm 페트리 접시로 옮기고 접시를 섭씨 28도에 넣습니다. 28 시간 후 수정, 테스트 접시의 바닥에 플라스틱 1.2 x 1.2 밀리미터 메쉬 그리드를 배치합니다.
플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 10-12개의 배아를 플라스틱 메쉬에 넣습니다. 배아를 물에 담그지 않도록 충분한 배아 물로 접시를 채우고, 부동하지 않고 필요에 따라 플라스틱 팁으로 배아를 조심스럽게 그리드의 위치로 옮킨다. 그런 다음, 해부 현미경에 부착 된 비디오 카메라를 사용하여 10 ~ 20 분 동안 자발적인 코일 활동을 기록합니다.
총 자발적움직임을 분석하려면 Zebra 랩 시스템의 활동 정량화 모듈을 사용하여 녹화된 비디오를 업로드하고 각 배아 주변의 추적 경기장을 적절히 설계합니다. 동결 및 버스트 임계값을 각각 10 및 50으로 설정합니다. 그리고 정의된 각 경기장 내에서 총 활동을 정량화하는 자동화된 비디오 분석이 있을 때.
그런 다음 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하기 위해 데이터 세트를 스프레드시트로 복구합니다. 46 시간 후 수정, 배아를 부추기 위해 미세 한 집게를 사용 하 여, 배아 물로 130 밀리 미터 테스트 접시를 채우기. 나머지 15분 전에 테스트 접시를 섭씨 28도의 인큐베이터로 데워보겠습니다.
터치 방출 탈출 응답 테스트를 수행하려면 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 테스트 접시의 중앙에 배아를 카메라 아래에 배치합니다. 초당 30프레임의 획득률을 사용하여 녹음을 시작합니다. 미세한 플라스틱 팁을 사용하여 배아의 꼬리를 가볍게 터치합니다.
애벌레가 움직임을 종료했을 때 녹음을 중지합니다. 그런 다음, 신선한 배아 물로 채워진 새로운 홀딩 접시로 배아를 옮기고, 각 실험 조건에 필요한 만큼의 배아로 테스트를 반복한다. 전기 생리 분석을 위해 얼룩말 물고기를 준비하려면 유리 바닥 페트리 접시에 수정 물고기를 1, 4 ~ 6 일 배치하십시오.
물고기가 가능한 한 접시의 바닥에 가까이 있을 수 있도록 여분의 여분의 선원 매체를 제거하십시오. 플라스틱 저스티드 파이펫을 사용하여 유충을 덮을 수 있는 따뜻한 액체 농약을 추가합니다. 농사 강자 동안, 접시의 중심에 아래로 물고기 복부 측면을 방향을 미세 한 집게를 사용합니다.
그런 다음 10 마이크로 몰러 판큐로늄 브로마이드를 함유한 레코딩 용액 2밀리리터를 첨가하여 신경 근육 전염을 차단합니다. 다음으로, 기록 용액으로 마이크로파이프를 채우고, 전압 클램프 구성에 패치 클램프 증폭기를 사용하여 배스의 전극 저항을 측정하여 올바른 값을 확인한다. 20배 의 목표를 사용하여, 중앙 시야에 애벌레의 머리를 배치하고, 마이크로 파이프를 낮추어 광학 텍텀 내의 기록 위치에 도달한다.
패치 클램프 증폭기를 현재 클램프 구성으로 전환하고 유지 전류를 0밀리암페어로 수정합니다. 1킬로헤르츠의 로우 패스 필터와 1킬로헤르츠의 획득률, 10의 디지털 게인을 사용하여 60분 동안 물고기의 자발적인 활동을 기록하여 기준활동 수준을 결정한다. 기준선 기록의 끝에서, 에서 143 리터 당 300 밀리머의 마이크로 리터 에 리터 pentylenetetrazole 용액, 리터 당 20 밀리머의 최종 농도에 대 한 리터 당 밀리 머.
또 다른 120 분 동안 펜티네트 라졸 용액에서 동물의 신경 활동을 기록합니다. 기록의 기준 기간 동안, 4 ~6 일 후 수정 간질 모델 얼룩말 물고기는 자발적인 이벤트의 더 높은 발생을 입증, 불일치 제어 물고기는 거의 변동을 표시하는 동안. 펜티네트트라졸 적용 후, 불일치 제어 및 간질 모델 얼룩말 물고기모두 깊은 편광 이벤트의 증가를 나타낸다.
펜티텔레네트라졸 적용 후 첫 번째 기간 동안, 분당 0.8 이벤트의 비율은 불일치 제어 및 이벤트의 대부분이 높은 진폭의 동물을 노크 모두에서 관찰된다. 후자의 응답 기간 동안. 탈극화 이벤트의 비율은 분당 약 1개의 이벤트로 증가합니다.
그리고 이벤트의 대부분은 낮은 진폭입니다. 노크를 수행 할 때, 용량 응답 곡선을 사용하여 모르폴리노의 정확한 복용량을 설정하고 비 특이적 독성을 피하기 위해 제어를 수행하는 것이 매우 중요하다. 이 푸시는 유전 적 또는 화학 적 수정자의 효과를 테스트하는 것을 포함하여 여러 다운 스트림 연구를 가능하게합니다.
그리고 Zebrafish 행동 및 신경 활동 활동은 DC 5 돌연변이의 발달 효과를 이해합니다.
