Este protocolo fornece uma maneira rápida de avaliar os efeitos da derrubada do gene WC5, que é a causa mais comum de epilepsia focal. A principal vantagem dessa técnica é que podemos usá-la para avaliar a epilepsia, como o fenótipo usando características comportamentais e fisiológicas em vários estágios de desenvolvimento. Um dia antes da micro injeção, configure os tanques de acasalamento de Zebrafish.
Na manhã da injeção, remova os divisores para permitir a desova. Use uma peneira fina para transferir os ovos em pratos petri de 100 milímetros, cheios de água de embrião. Usando uma pipeta pasteur de plástico, escolha 60 a 80 ovos, e disponha os ovos em uma placa de Petri revestida de silicone para a injeção.
movemos a maior parte da água, deixando o suficiente para cobrir os ovos no meio do caminho. Coloque uma agulha de vidro verticalmente em um tubo de solução de injeção. Deixe a solução colorida encher o tubo por ação capilar durante um período de vários minutos.
Quando a solução de injeção estiver visível na ponta da agulha, coloque a agulha na alça de injeção do micro injetor e ligue o compressor de ar. Ajuste a configuração de pressão para gerar um volume de injeção de dois nanoliter. E colocar os ovos sob um microscópio binóculo dissecado, com uma ampliação quatro vezes maior.
Insira a ponta da agulha através do acorde e da gema de embriões de estágio único para injetar a solução diretamente dentro de cada célula. Em seguida, transfira os embriões injetados em uma placa de Petri de 100 milímetros rotulada de água embrionária, e coloque a placa em uma incubadora de 28 graus Celsius. 28 horas após a fertilização, coloque uma grade de malha de plástico de 1,2 por 1,2 milímetros na parte inferior do prato de teste.
Use uma pipeta pasteur de plástico para colocar de 10 a 12 embriões dentro de seus acordes na malha plástica. Encha o prato com água de embrião suficiente para manter o embrião submerso, mas não flutuando, movendo cuidadosamente os embriões com uma ponta plástica na posição na grade, conforme necessário. Em seguida, usando uma câmera de vídeo anexada a um microscópio de dissecção, registo da atividade de enrolamento espontâneo por 10 a 20 minutos.
Para analisar o movimento espontâneo total, use o módulo de quantificação de atividade em um sistema de laboratório Zebra para carregar o vídeo gravado e projetar as arenas de rastreamento em torno de cada embrião conforme apropriado. Defina os limiares de congelamento e estouro para 10 e 50, respectivamente. E quando a análise automatizada de vídeo, que quantifica a atividade total dentro de cada uma das arenas definidas.
Em seguida, recupere o conjunto de dados como uma planilha para realizar a análise, usando o software de análise de dados apropriado. 46 horas após a fertilização, use fórceps finos para descorriorar os embriões e encher um prato de teste de 130 milímetros com água embrionária. Pelo menos 15 minutos antes do resto, aqueça o prato de teste em uma incubadora de 28 graus Celsius.
Para realizar um teste de resposta de fuga evocado, use uma pipeta pasteur de plástico para colocar um embrião no centro do prato de teste, sob a câmera. Comece a gravação, usando uma taxa de aquisição de 30 quadros por segundo. Usando uma ponta plástica fina, toque levemente na cauda do embrião com um movimento de movimento.
Parando a gravação, quando a larva terminou seu movimento. Em seguida, transfira o embrião para um novo prato de retenção cheio de água fresca de embrião, e repita o teste com quantos embriões necessários para cada condição experimental. Para preparar o peixe Zebra para análise eletrofisiológica, coloque um, quatro a seis dias pós-fertilização em uma placa de Petri de fundo de vidro.
Remova qualquer excesso, meio de marinheiro extra para garantir que o peixe estará o mais perto possível do fundo do prato. Use uma pipeta pasteur plástica para adicionar agros líquidos quentes suficientes para cobrir a larva. Enquanto os agros hardnes, use fórceps finos para orientar o lado ventral do peixe para baixo no centro do prato.
Em seguida, adicione dois mililitros de solução de gravação, contendo 10 brometo de pancurônio micromolar ao prato para bloquear a transmissão neuromuscular. Em seguida, encha uma micropipetagem com solução de gravação e use um amplificador de grampo de remendo na configuração do grampo de tensão, para medir a resistência ao eletrodo no banho para confirmar seu valor correto. Usando um objetivo de 20x, posicione a cabeça da larva no campo de visão central e baixe o micropipet para alcançar a posição de gravação dentro do tectum óptico.
mudar o amplificador do grampo de remendo para a configuração do grampo atual e fixar a corrente de retenção a zero miliamper. Usando um filtro de passe baixo de um kilohertz, e taxa de aquisição de um kilohertz, e um ganho digital de 10, registre a atividade espontânea do peixe por 60 minutos para determinar os níveis de atividade da linha de base. No final da gravação da linha de base, a 143 microliters de uma solução de pentilenotrazol de 300 mililitros por litro para o banho, para uma concentração final de 20 mililitros por litro.
Regissotrazol da atividade neuronal do animal na solução de pentilenotetrazol por mais 120 minutos. Durante o período de base do registro, quatro a seis dias após a fertilização modelos epilépticos de zebra demonstram maior ocorrência de eventos espontâneos, enquanto os peixes de controle de incompatibilidade apresentam pouquíssimas flutuações. Após a aplicação do pentilenotetrazol, tanto o controle de incompatibilidade quanto os modelos epilépticos de zebramcesão apresentam um número crescente de eventos de polarização profunda.
Durante o primeiro período após a aplicação do pentilenotetrazol, observa-se uma taxa de 0,8 eventos por minuto tanto no controle de incompatibilidade quanto em animais para os quais a maioria dos eventos são de alta amplitude. Durante o último período de resposta. A taxa de eventos de despolarização aumenta para cerca de um evento por minuto.
E a maioria dos eventos são de baixa amplitude. Ao realizar knock down, é muito importante estabelecer a dose correta de morfolnos usando uma curva de resposta de dose e realizar controles para evitar as toxicidades inespecíficas. Este esforço para permitir vários estudos a jusante, incluindo testar os efeitos de modificadores genéticos ou químicos.
E o comportamento zebrafish e atividades neurais para entender os efeitos do desenvolvimento das cinco mutações dc.
