Bu protokol, odak epilepsisinin en yaygın nedeni olan WC5 geninin devrilmesinin etkilerini değerlendirmek için hızlı bir yol sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, gelişimin çeşitli aşamalarında hem davranışsal hem de fizyolojik özellikleri kullanarak fenotip gibi epilepsiyi değerlendirmek için kullanabilmemizdir. Mikro enjeksiyondan bir gün önce Zebra balığı çiftleşme tanklarını kurun.
Enjeksiyon sabahı, yumurtlamayı etkinleştirmek için bölücüleri çıkarın. Yumurtaları embriyo suyuyla dolu 100 milimetre Petri kabına aktarmak için ince bir elek kullanın. Plastik bir Pasteur pipet kullanarak, 60 ila 80 yumurta seçin ve enjeksiyon için yumurtaları silikon kaplı bir Petri kabına yerleştirin.
suyun çoğunu hareket ettiriyoruz, yumurtaları yarıya kadar kaplayacak kadar bırakıyoruz. Bir cam iğneyi bir enjeksiyon çözeltisi tüpüne dikey olarak yerleştirin. Renkli çözeltinin birkaç dakika boyunca kılcal damar etkisiyle tüpü doldurmasına izin verin.
Enjeksiyon çözeltisi iğnenin ucunda göründüğünde, iğneyi mikro enjektörün enjekte sapına monte edin ve hava kompresörünü açın. İki nanoliter enjeksiyon hacmi oluşturmak için basınç ayarını ayarlayın. Ve yumurtaları dört kat büyütme ile Diseksiyon Dürbün Mikroskobu altına yerleştirmek için.
Çözeltiyi doğrudan her hücreye enjekte etmek için iğne ucunu korona ve tek aşamalı embriyoların sarısına yerleştirin. Daha sonra enjekte edilen embriyoları etiketli 100 milimetre Petri embriyo suyu kabına aktarın ve plakayı 28 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Döllenmeden 28 saat sonra, test kabının altına plastik bir 1.2 ila 1.2 milimetre ağ ızgarası yerleştirin.
10 ila 12 embriyoyu koroları içinde plastik ağın üzerine yerleştirmek için plastik bir Pasteur pipet kullanın. Kabı, embriyoyu su altında tutmak için yeterli embriyo suyu ile doldurun, ancak yüzmeyin, embriyoları gerektiği gibi plastik bir uçla dikkatlice ızgarada pozisyona getirin. Ardından, Diseksiyon Mikroskobuna bağlı bir video kamera kullanarak, spontan bobinleme aktivitesini 10 ila 20 dakika boyunca kaydedin.
Toplam spontan hareketi analiz etmek için, kaydedilen videoyu yüklemek ve her embriyonun etrafındaki izleme arenalarını uygun şekilde tasarlamak için zebra laboratuvar sistemindeki aktivite niceleme modülini kullanın. Donma ve patlama eşiklerini sırasıyla 10 ve 50 olarak ayarlayın. Ve otomatik video analizi, tanımlanan arenaların her birinin içindeki toplam aktiviteyi ölçer.
Ardından, uygun veri çözümleme yazılımını kullanarak analizi gerçekleştirmek için veri kümesini elektronik tablo olarak kurtarın. Döllenmeden 46 saat sonra, embriyoları kaynatmak için ince tokmaklar kullanın ve 130 milimetrelik bir test kabını embriyo suyuyla doldurun. Geri kalanından en az 15 dakika önce, test kabını 28 santigrat derecelik bir inkübatörde ısıtın.
Dokunmatik uyarılmış kaçış yanıt testi yapmak için, test çanağının ortasına, kameranın altına bir embriyo yerleştirmek için plastik bir Pasteur pipet kullanın. Saniyede 30 karelik bir alım oranı kullanarak kaydı başlatın. İnce bir plastik uç kullanarak, bir hareketle embriyonun kuyruğuna hafifçe dokunun.
Larva hareketini sonlandırdığında kaydı durdurmak. Daha sonra embriyoyu taze embriyo suyu ile dolu yeni bir tutma kabına aktarın ve testi her deneysel durum için gerektiği kadar embriyo ile tekrarlayın. Zebra balığını elektrofizyolojik analize hazırlamak için, gübreleme sonrası balıkları bir cam dip Petri kabına bir, dört ila altı gün yerleştirin.
Balığın yemeğin dibine mümkün olduğunca yakın olmasını sağlamak için fazla, ekstra denizci ortamını çıkarın. Larvaları örtecek kadar sıcak sıvı agros eklemek için plastik pastör pipet kullanın. Agros hardnes iken, balık ventral tarafı yemeğin ortasına yönlendirmek için ince tokmaklar kullanın.
Daha sonra nöromüsküler iletimi engellemek için yemeğe 10 mikromoler panküronyum bromür içeren iki mililitre kayıt çözeltisi ekleyin. Daha sonra, bir mikropipettingi kayıt çözeltisi ile doldurun ve doğru değerini doğrulamak için banyodaki elektrot direncini ölçmek için voltaj kelepçesi konfigürasyonunda bir yama kelepçesi amplifikatörü kullanın. 20x'lik bir hedef kullanarak larva başını merkezi görüş alanına yerleştirin ve optik tectum içindeki kayıt konumuna ulaşmak için mikropipet'i küçümseyi küçümseyin.
yama kelepçesi amplifikatörini mevcut kelepçe konfigürasyona geçirin ve tutma akımını sıfır miliamp'a sabitleyin. Bir kilohertz'lik düşük geçiş filtresi ve bir kilohertz'lik bir alım oranı ve 10 dijital kazanç kullanarak, temel aktivite seviyelerini belirlemek için balığın spontan aktivitesini 60 dakika boyunca kaydedin. Taban çizgisi kaydının sonunda, litre başına 20 milimolar son konsantrasyon için banyoya litre başına 300 milimolar pentilentetrazol çözeltisinin 143 mikrolitresinde.
Hayvanın nöronal aktivitesini pentylenetetrazol çözeltisinde 120 dakika daha kaydedin. Kaydın temel süresi boyunca, döllenme sonrası dört ila altı gün epileptik modeller zebra balıkları spontan olayların daha yüksek bir oluşumunu gösterirken, uyumsuz kontrol balıkları çok az dalgalanma gösterir. Pentylenetetrazol uygulamasından sonra, hem uyuşmazlık kontrolü hem de epileptik modeller zebra balıkları daha fazla sayıda derin polarizasyon olayı sergiler.
Pentylenetetrazol uygulamasından sonraki ilk dönemde, hem uyumsuzluk kontrolünde hem de olayların çoğunluğunun yüksek genlikte olduğu hayvanları devirmede dakikada 0,8 olay oranı gözlenir. İkinci yanıt döneminde. Depolarizasyon olaylarının oranı dakikada yaklaşık bir olaya artar.
Ve olayların çoğu düşük genliktedir. Knock down yaparken, bir doz yanıt eğrisi kullanarak doğru morfotin dozunu oluşturmak ve spesifik olmayan toksisiteleri önlemek için kontroller yapmak çok önemlidir. Bu itme, genetik veya kimyasal değiştiricilerin etkilerini test etmek de dahil olmak üzere birkaç aşağı akış çalışmasını mümkün kılar.
Ve Zebra balığı davranışı ve sinirsel aktiviteler, DC beş mutasyonunun gelişimsel etkilerini anlamak için faaliyette bulunur.
