Name: high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping
Uploaded: 2018-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping at JoVE.com

저자는 드문 질병 모델과 메커니즘 (RDMM) 네트워크 (캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 및 게놈 캐나다에 의해 자금)을 감사 하 고 싶습니다. CK은 UROP 장학금 수상 (오타와의 대학)에 의해 지원 됩니다. DLJ는 Vanier 캐나다 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. IAP는 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 박사 후 펠로 십 수상에 의해 지원 됩니다. 저자는 유전학의 미국 협회 권한을 부여에 대 한이 프로토콜을 게시 하 고 페 냐에서 보충 그림 5의 적응을 사용 하 여 감사 외.

절차와 관련 된 동물 주제 승인 되며 동물 보호 지침에 따라 제공 캐나다 위원회에 의해 동물 관리 및 오타와의 대학에 동물 보호 위원회.
1입니다. 준비
<ol><li>그것의 내부 표면에 걸쳐 9 cm 배양 접시 뚜껑 압력솥 테이프로 녹화 하 여 해 부 표면 준비. 스테레오 현미경 위치.</li>
	<li>3-5 일 후 수정 (dpf)를 배치 zebrafish 애벌레는 페 트리에서 접시와 ˜1.5 m m Tricaine 1 x E3 배아 미디어 (5 m m NaCl, 0.17 m m KCl, 0.33 m m CaCl2, 0.33 m m MgSO4, pH 7.2)에서 anesthetize.</li>
	<li>최소한의 스트레스와 3 dpf 애벌레에 맞게 2 mm의 직경에 한 쌍의가 위 또는 면도날과 P1000 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li>
</ol>2. 지 느 러 미 클리핑 Zebrafish 애벌레의
<ol><li>수정된 P1000 micropipette를 사용 하 여 마 취 유 충을 선택 하 고 위치 고압 테이프에 zebrafish 애벌레 Petri 접시 뚜껑에 배치.</li>
	<li>애벌레는 micropipette를 사용 하 여 주변 초과 Tricaine 솔루션을 제거 합니다. 지역으로 하 여 성공적으로 섹션은 지 느 러 미를 선택 하지만 생존을 위해 아직도 젖은 건조 해야 한다.</li>
	<li>마이크로 메스, 섹션 윌 킨 슨 외16에 설명 된 대로 그림 1에 표시 된 대로 스테레오 현미경 아래 꼬리 지 느 러 미를 사용 하 여. 절 개를 하는 동안 사이트 내에서 안료 격차는 꼬리 지 느 러 미, 말 초 혈액 순환 (그림 1A)의 한계에의 꾸준한 하향 압력을 적용. notochord 손상 되지 않도록 부드러운 압력을 적용 합니다.</li>
	<li>현미경 sectioned 지 느 러 미를 시각화 하 고 microscalpel 블레이드 (그림 2A)의 팁 위에 조각 위치. 필터 종이의 작은 조각의 표면에 지 느 러 미를 포함 하는 microscalpel를 놓습니다. 참고: transected 조직에서 melanocytes의 존재로 인해이 단계 작은 블랙 스팟 (그림 2B)로 지 느 러 미의 시각화 수 있습니다.</li>
	<li>50mm 잘 (그림 2D) 당 NaOH 솔루션의 25 μ를 포함 하는 96-잘 PCR 플레이트에 지 느 러 미를 포함 하는 필터 종이 위와 핀셋 (그림 2C), 전송 사용 하.</li>
	<li>PCR 접시의 라벨에 따라 잘 번호 플랫-아래 96 잘 접시를 준비 합니다. 신선한 1 x E3 배아 미디어의 200 µ L로 가득 수정된 P1000 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 zebrafish 애벌레 부드러운 압력을 사용 하 여 수집 합니다. 같은 PCR 플레이트 (그림 2E)으로 잘 번호 96-잘 조직 문화 접시에 있는 애벌레를 분배.</li>
	<li>필터 종이 (그림 2F) 솔루션에 빠져들 잘는 다는 것을 확인 하십시오. Microscapel 70 %EtOH 솔루션으로 그것을 찍기 하 여 교차 오염을 방지 하기 위해 각 컷 사이 핀셋의 블레이드를 청소. 깨끗 한 종이 티슈/지우기와 블레이드를 닦아.</li>
	<li>2.1-2.7 단계를 반복 하 여 모든 배아 잘립니다 되었습니다.</li>
	<li>genotypes 발견 되었습니다 때까지 28 ° C에 96 잘 접시에 애벌레를 저장 합니다. 참고: 배아 미디어 프로토콜은 2 일 이내에 쉽게 완료 될 수 있다 때문에 바뀔 필요가 없습니다. 더 많은 시간이 필요한 경우 미디어 변경 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 게놈 DNA 추출
<ol><li>96-잘 PCR 접시와 원심 분리기 1000 x g 되도록 모든 필터 종이 1 분에 샘플 NaOH 솔루션 내에서 잠긴 인감.</li>
	<li>조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 냉각 5 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열.</li>
	<li>500 mM Tris HCl, pH 8.0 각 샘플의 6 μ를 추가 합니다. 와 동입니다.</li>
	<li>짧게 원심 1500 x g, 실 온에서 5 분에 접시.</li>
	<li>PCR 반응 당 DNA 상쾌한의 1.5 μ를 사용 합니다.</li>
	<li>표 1-2와 같이 유전자를 PCR는 애벌레를 준비 합니다. 참고:이 프로토콜은 두 응용 프로그램에 대 한 테스트 되었습니다: 다중 PCR 반응 agarose 젤9, heteroduplex 녹는 genotypes polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)17을 사용 하 여 공개 하는 분석 결과 (HMA)을 사용 하 여 유전자 형을 공개.</li>
</ol>4. 대체 게놈 추출 Chelating 수 지를 사용 하 여
<ol><li>96-잘 PCR 접시에 잘린된 지 느 러 미와 지를 추가 하 여 완료 단계 2.5 킬레이트 화 수 지 (스 티 렌-divinylbenzene 공중 합체 짝된 iminodiacetate 이온을 포함) 5%의 30 μ를 포함. 참고: 수 지의이 종류 주로 조직 세포와 신속 하 고 효율적인 방식으로18에서 PCR 준비 DNA의 준비에 대 한 사용 됩니다.</li>
	<li>단계 2.6-2.8로 표시 합니다.</li>
	<li>96-잘 PCR 접시를 봉인 하 고 모든 필터 종이 chelating 수 지 내에서 잠긴 ㄴ 다는 것을 확인 하는 예제를 간단히 원심.</li>
	<li>조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 15 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열. 참고:이 단계 동안 수 있습니다 세포와 세포질 분 대를 북극 수 지 구슬의 후속 바인딩 DNA와 RNA 해결책에 남아 있다.</li>
	<li>짧게 원심 작은 수 지 구슬 고 현 탁 액에서 DNA를 샘플.</li>
	<li>3.5-3.6 유전형 절차를 완료 하려면 단계를 따릅니다.</li>
</ol>5. 응용 프로그램 1: 다중 PCR Agarose 젤 분석 뒤
<ol><li>표 1, 다음 설정 다중 PCR 반응 homozygous 돌연변이, heterozygotes, WT 애벌레 사이 차별 활성화. 96-잘 열 cycler를 사용 하 여 표 3에 설명 된 사이클링 조건을 사용 하 여 PCR 반응을 수행. 참고: PCR 반응 또한 어떤 다른 기존의 PCR 열 cycler에서 수행할 수 있습니다. 이 예제에서는 페 냐, 그 외 여러분 에 의해 사용 되는 PCR 전략을 설명 합니다. aldh7a1 WT 및 같은 다중 반응에서 5 bp 삽입 돌연변이 체 대립 유전자를 확인 9 .</li>
	<li>1 물 나트륨 붕 산 염 버퍼에 1 %agarose 젤 준비 x GelRed. 참고: 나트륨 붕 산 염 버퍼 재고 x 20이 이루어집니다 10 M NaOH, ddH2O, 1800 mL 40 mL의 pH 8.5 붕의 76 g를 조정 하 고 다음 2 L 최종 볼륨 ddH2o.를 사용 하 여 완료</li>
	<li>1 x 나트륨 붕 산 염 버퍼 250 V에서 15 분 동안에 젤을 실행 합니다. 과정을 촉진 하기 위하여 가능 하다 면, 젤 시스템 샘플 로드 시간을 줄임으로써 더 높은 처리량 기능을 사용 하려면 멀티 채널 pipets와 호환 되는 사용 합니다.</li>
	<li>이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 자외선 (UV)에서 젤.</li>
</ol>6. 응용 프로그램 2: Heteroduplex 분석 결과 용 해
<ol><li>페이지 12% 젤 1.5 m m 간격 장치 격판덮개 15-샘플 빗을 사용 하 여 준비 합니다. 12.21 mL ddH2O, 트리 스/Borate/EDTA (TBE), 30% 아크릴 아 미드 10 mL, 250 μ x 10의 2.52 mL의 10% 염화 persulfate (AP)를 사용 하 여 두 페이지 젤 준비 및 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 μ. 1 x TBE 버퍼를 사용 하 여 (0.089 0.089 M 붕 산 및 0.002 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) M Tris HCl) 버퍼를 실행.</li>
	<li>5 분 동안 94 ° C에서 PCR 제품을 열.</li>
	<li>차가운 얼음에 또는 4 ° c.에서 10 분 동안 thermocycler 튜브</li>
	<li>PCR 견본 당 10 μ 분자량 마커의 8 μ를 로드 합니다.</li>
	<li>150 V 1 x TBE를 사용 하 여 수직 전기 시스템 1 h 또는 분자량 표식까지 거의 도달 유리 접시의 피트 라인에서 페이지를 실행 합니다.</li>
	<li>이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 UV 빛에서 젤.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders.">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li><li>Grone, B. P., Baraban, S. 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(25), e1115 (2009).</li><li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Genome+Editing+Using+High+Efficieny+TALENs.">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Pena, I. 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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

편집 도구는 정확 하 게 지난 돌연변이 제 브라에서 transgenes 소개 고용 되었다 유전자 년5,6,,78. 질병 zebrafish에 모델링을 수행할 때 초기 애벌레 또는 젊은 고기는 종종9,12,13,14을 관찰 하 게 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 설명 3 dpf 어린 애벌레의 유전형을 수 있도록 작은 zebrafish 애벌레 꼬리 생 검에서 PCR 준비 DNA 추출을 합니다. 특히 특별 게시물 유전형 하지 않을 때 가능한9genotypes의 조기 식별 여러 실험실 응용, 결정적 이다. 이른 나이에서 genotypes을 알고 또한 용이 하 게 생존 연구 및 phenotypic 돌연변이 분석. 이 프로토콜은 또한 특정 genotypes 성숙의 애벌레의 양육에 대 한 특히 유용 합니다. 애벌레 유전형은 아직 널리 사용 되지 않습니다 zebrafish 실험실에는 전세계 그리고이 프로토콜이 기술의 보급을 촉진 하는 것을 목표로. Transected 지 느 러 미를 조작 하는 동안이 메서드를 사용 하 여 샘플; 내 DNA의 존재로 신뢰를 제공 합니다. 지 느 러 미 생 처리 과정 전반에 걸쳐 필터 종이에 짙은 반점으로 쉽게 구상 될 수 있다. 이 윌 킨 슨 외 의해 프로토콜의 중요 한 향상을 나타냅니다. 16.
프로토콜 내에서 몇 가지 중요 한 단계 품질 결과를 얻을 올바르게 따라야 합니다. 맨먼저, 애벌레 지 느 러 미의 transection 안료 간격, 출혈 방지, 혈액 순환 제한 하 원심 내에서 발생 해야 합니다. 이 지 느 러 미 생 검 동안 애벌레의 생존을 보장합니다. 또한, 지 느 러 미의 위치를 표시 하는 필터 종이에 검정색 점이 NaOH 솔루션에서 필터 종이 배치 하기 전에 관찰 해야 합니다. 이 각 샘플 잘에 지 느 러 미 조직 (와 그러므로, DNA)의 존재를 보장합니다. 필터 종이 또한 셀 세포 및 DNA 추출 NaOH 솔루션 내에서 몰두 해야 합니다. 이 프로토콜은 부 화 애벌레만 사용 했다 3 dpf 보다 젊은 연령에 대 한 테스트 하지. 유전자 형 젊은 배아를 (깐 < 3 dpf) chorion 제거 해야 할 것 이다. 그 부족 한 PCR 증폭 발생, 표준 PCR 최적화 전략 적용 (예를 들어, 다양 한 뇌관 농도, 온도, 또는 DNA 농도 어 닐 링) 이어야 한다. 충분 한 DNA PCR 반응 ( aldh7a1 및 plpbp 유전형 예제와 같이)의 여러 종류를 성공적으로 수행을 추출, 다음 지 느 러 미 클리핑 절차 얻은 DNA의 농도 작은 (~ 5 ng / µ L 당 샘플) 따라서, 증폭의 큰 성공에 대 한 수 있습니다 PCR 반응에 있는 DNA의 농도 증가.
이 프로토콜 추출 애벌레 핀 DNA 애벌레 zebrafish genotypes와 높은 처리 방식으로 정확한 식별을 허용 여러 증폭 반응에 사용할 수 있습니다. Heteroduplex 분석 결과 페이지 젤에 녹는 다른 돌연변이17를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. DNA의 ~ 30 μ는 샘플에 따라 받은 고 ~ 1-1.5 μ DNA의 PCR 반응 당 사용, 추출된 샘플 당 약 30 PCR 반응은 실행할 수 있습니다. PCR 제품은 또한 적합 생어 시퀀싱 응용 프로그램; 읽기의 높은 품질, WT의 정확한 확인 및 aldh7a1를 위한 homozygous 돌연변이 시퀀스 얻은 했다. 애벌레 zebrafish에서 게놈 DNA 추출 연구에 많은 응용 프로그램을 있다. 이 프로토콜을 개발에 대 한 원래 목표 aldh7a19특정 돌연변이 인해 성인에 도달할 수 없는 유전자 형 애벌레 효과적으로 했다. 또한,이 프로토콜 활성화 genotypes의 분리와 특히 애벌레 단계 이후9 aldh7a1-/- 물고기에에서 고기 간 연결의 관측. RNA 추출 등 대사 산물 추출 방법에 대 한 각 유전자 형의 애벌레의 풀링 유전형 클리핑 절차9이 애벌레 지 느 러 미를 사용 하 여 후 정확 하 게 실행할 수 있습니다. 결론적으로, 훈련의 짧은 기간 후 경험된 조사만 최소화 하 고 저렴 한 시 약, 정기적으로 수행 하는 하루 핀 클립의 수백을 요구이 간단 하 고 시간 효율적인 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 가능 하 게 페 냐 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 연구 그리고 잘하면 광범위 한 제 브라 지역 사회에 대 한 유사한 목적을 될 것입니다.

제 브라 (Danio rerio) 척추 생물 치료 가설1,2,3의 전 임상 시험에 관해서는 뿐만 아니라 질병 조사에 대 한 모델으로 널리 이용 되는. 이 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아4DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 소설 유전자 변형, 유전자 기술 등 아연 손가락 nucleases (ZFN)5, 탈 같은 이펙터 Nucleases (TALENs)6,7는 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 편집의 증가 개발을 통해 (CRISPR)을 반복 하는 구조/CRISPR 관련 9 (Cas9) 시스템8, zebrafish는 실질적으로 여러 pathologic 조건의 이해를 향상 시킬 태세 이다. 이러한 기술을 모두 체세포 타겟된 녹아웃을 만드는 데는 그리고 zebrafish, 효율적으로 사악한 유전자에 생식 세포 동물8수정. 최근 문학에서 등이 간 질 및 대사 질환의 유전자 모델의 성공적인 개발 zebrafish3,,910,11,12 .
진전 zebrafish 게놈 편집, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 유전형 명백한 속도-제한 단계 되고있다. 특정 DNA 변이 예측된 게놈 편집 대상 사이트에 인접 한의 식별 프로토콜의 필수 단계입니다. 전통적으로, 지 느 러 미 클리핑에 의해 유전형 기법만 수행된에 청소년 이나 성인 zebrafish는 일반적으로. 그러나, 성인 기에 올리는 zebrafish 보낸 시간 (> 2 개월) 상당히 지연 연구에 있는 전진. 대부분의 경우, 성인 필수 유전자 (예를 들어, 질병 모델링에서) 또는 해로운 phenotypic 효과로 이어지는 이득의 기능 돌연변이의 녹아웃으로 얻을 수 없다. 또한, 여러 분석 실험 등 RNA 또는 대사 산물 추출, 애벌레의 풀링 요구 하 고 따라서 유일한 특별 게시물 유전형 기술을 사용할 수 있는 경우에 도전적 일 수 있다 genotypes의 사전 식별을 포함. 상기 예제 애벌레 유전형 기법을 정확 하 게 동시에 하 고 전체 복구 및 애벌레의 정상적인 발전의 중요성을 강조 표시 합니다. 초기 단계 zebrafish 유전형 표시 되지 않으면 현재 널리 이용 될; 이 애벌레 genotypes 유전형 실험12,,1314의 실행 전에 보다는 사후 유전형을 통해 식별 되는 질병 모델의 최근 간행물에 의해 반영 됩니다. 이 논문에서는, 애벌레 핀 클립 전략 이전 설립된 유전형 절차를 향상을 목표로 제공 됩니다.
과거에는, K 성분을 소화 유전자 형을 채용 하는 전략 라이브 zebrafish 애벌레 변수 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 효율15이어졌다. 더 최근 미세한 꼬리 생 검 기술은 더 유망한 결과16제공 게시, 비록 우리와 다른 그룹 하지 못했습니다 고효율와 저자에 의해 보고 된 DNA 복구를 재현. 윌 킨 슨 외 에 의해 설명 하는 프로토콜의 주요 좌절 16 PCR 튜브에 꼬리 조직의 전송 될 수 있습니다. 미세한 크기로 인해 fin 수집 및 pipetting으로 적절 하 게 제대로 되었음을 보장 하기 어렵다. 이 배리어를 해결 하기 위해 우리는 유전형 거의 1009라이브 zebrafish 애벌레의 큰 숫자에 대 한 향상 된 프로토콜을 개발 했습니다. microscalpel을 사용 하 여, 지 느 러 미 꼬리의 끝은 제거 하 고 필터 종이 조각에 배치. 조직을 포함 하는 필터 종이 쉽게 시각화 하 고 올바르게 PCR 튜브에 배치 수 있습니다. 게놈 DNA 추출 다음 다음 유전자 형 표본에 관심 영역의 PCR 증폭, 수행 됩니다. 이 방법의 장점은 높은 PCR 효율, 낮은 거짓 긍정적인 평가 낮은 사망률을 포함합니다. 또한, 많은 수의 배아의 유전형이이 프로토콜을 사용 하 여 가능 하다. 여기에 설명 된 프로토콜 지 느 러 미-클리핑 수백이 접근 및 genotyped 물고기와 2 일 이내 꼬리 재생의 정확한 식별을 사용 하 여 2-3 h 이내 애벌레의 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>96-well Tissue-culture plate</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plate</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S25548A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>5% Chelex 100 sodium form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 system</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>paper wipes (Kimwipes&amp;reg; disposable wipers)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>1kb-plus molecylar weight marker&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system)</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1658004</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping

Zebrafish (Danio rerio) orthologues를 인간의 질병과 관련 된 것으로 알려진 유전자의 84%를 소유한 다. 또한, 이러한 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아에서 DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 최근 발전 도구를 편집 하는 유전자 돌연변이 제 브라에서 transgenes의 정확한 소개를 활성화는 합니다. 종종 zebrafish에 모델링 질병 해석 genotypes 알려지지 않은 경우에 도전적 일 수 있다 이른 죽음과 애벌레 고기 이끌어 낸다. 이 초기 신분의 genotypes 샘플 풀링 요구 하는 실험에 필요한, 진 식 또는 질량 분석 연구 등 이기도 합니다. 그러나, 광범위 한 genotypic 심사 사후 애벌레 또는 성인 zebrafish에만 수행 됩니다 대부분의 실험실에는 전통적인 방법에 의해 제한 됩니다. 우리는 72 h 후 수정 (hpf)로 빨리 달성 될 수 있는 라이브 zebrafish 애벌레에서 PCR 준비 genomic DNA의 분리 하는 방법에 적응 하 여이 문제를 해결. 이 시간 및 비용 효율적인 기술, 이전 게시 된 유전형 프로토콜에서 향상 된 미세한 핀 biopsies에서 genotypes 식별 수 있습니다. 지 느 러 미는 애벌레 개발에 신속 하 게 다시 생성 합니다. 연구원은 선택 하 고이 높은 처리량 PCR 기반 유전형 절차를 이용 하 여 성인 기에 원하는 genotypes을 올릴 수 있습니다.

protocoll의 효율성 유전형에 의해 입증 되었다 heterozygous 십자가의 자손 (aldh7a1+ ot100, aldh7a1+로 여기 표시) (그림 3A-C)9. Aldh7a1ot100돌연변이 체 대립 유전자에 frameshift와 손실의 기능 때문에 이른 정지 codon9zebrafish aldh7a1 유전자의 첫 번째 코딩 exon 5 기본적인 쌍 (bp) 삽입 합니다. 4 개의 뇌관 WT와 homozygous 돌연변이 (aldh7a1-/-) genotypes heterozygous (aldh7a1+), 구별 3 독특한 밴드를 다중 반응에서 사용 되었다 (페 냐에서 외. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5'-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-기능-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3', 그리고 "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). Gen1_FW 및 Gen1_RV 뇌관을 사용 하 여 두 대립 유전자의 증폭 434-bp amplicon 귀착되는. 293-bp 밴드는 돌연변이 체 대립 유전자의 특정 증폭에서 발생 그리고 195-bp 밴드는 WT 대립 유전자를 위해 특별히 그림 3A와 같이. PCR, 각 20 µ L 반응 볼륨의 8 µ L를 다음 그림 3B와 같이 1 %agarose / 나트륨 붕 산 염 젤에 분석 했다. 충분 한 애벌레 DNA 98%에서 발견 되었다 (n = 576) 샘플, 효율 높은 PCR 결과의. DNA 추출 NaOH 기술을 사용 하 여 평균 4.7 0.5 ng / µ L의 지 느 러 미 생 검 절차 ~ 30 µ L 볼륨에 따라 샘플 당 애벌레 DNA 얻습니다. DNA 추출 chelating 수 지를 사용 하 여 유사한 수확량, 평균 3.8 0.5 ng / µ L의 DNA 샘플 당 발생 합니다. 이 양의 DNA 애벌레 핀 transections에서 수집 genotypes 식별 수 있도록 충분 한 품질의 PCR 준비 게놈 DNA를 생성 합니다. 각 DNA 샘플 ˜30 PCR 증폭 반응에 사용할 수 있습니다. 시퀀싱 응용 프로그램9, 성공적으로 식별 homozygous 돌연변이 (aldh7a1-/-) (그림 3C에서 5 bp 삽입 증폭 제품 뇌관 Gen1_FW 및 Gen2_RV를 사용 하 여 얻은 사용하실 수 있습니다. ). 생어 시퀀싱 PCR 제품이 응용이 프로그램에 대 한 적합 한 경우 테스트 하는 외부 서비스를 통해 수행 되었다. Agarose 젤에서 DNA 샘플 확인 homozygous 돌연변이 WTs (n = 3 각) 사용 되었다. 높은 Phred19 점수 (> 30) 첫 번째 및 마지막 40 자료 쌍을 제외 하 고 높은 품질 읽기를 나타내는 가져온.
이 프로토콜은 이후 heteroduplex 분석을 용 해 하 여 다양 한 다른 zebrafish 돌연변이 유전자 형을 사용. Plpbp 유전자의 (그림 4A-D) 각 plpbpot101 및 plpbpot102 돌연변이 대립 frameshift 및 이른 정지 codon으로 이어질. Plpbp식별-null zebrafish 애벌레, 2 개의 뇌관 돌연변이 사이트를 포함 하 여 첫 번째 코딩 exon를 증폭 하는 데 사용 되었다 (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 '와 plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'). WT 동물에 plpbp 단편의 증폭 272-bp amplicon (homoduplex)에서 발생합니다. Plpbpot101 (4-bp 삭제 대립 유전자, 그림 4C)에서 얻은 amplicon 268-혈압의 조각 및 plpbpot102 (5bp 대체, 2 bp 삭제 대립 유전자, 그림 4D)의 이루어져 있다 270-혈압, 그림 4A-B에서 보듯이 변성, 어 닐 링 후 PCR 파편 heterozygous 동물에서 heteroduplex 및 homoduplex DNA17포함 됩니다. Homoduplex 및 heteroduplex 밴드 쉽게 분리 될 수 있다 그리고 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 사용 하 여 시각. 돌연변이의 발생으로 인해 불완전 한 어 닐 링에 의해 발생 하는 일치 하 고 일치 하지 않는 DNA 물가 사이 오픈 각도의 heteroduplex homoduplex DNA17보다 훨씬 느린 속도로 마이그레이션할 DNA 발생할. 고유한 마이그레이션 패턴 독특한 돌연변이 의해 생산 됩니다. Heterozygous genotypes (plpbp+ ot101, plpbp+ ot102) 따라서 heteroduplex DNA 파편으로 heterozygous 화합물 (plpbpot101/ot102) (그림 표시 4A-B). 정확한 유전형이이 heteroduplex 독특한 페이지 패턴 각 유전자 형을 획득 하 고 뚜렷한 heterozygous 돌연변이 구상 될 수 있다 분석 결과 용 해 (그림 4A-B)에 의해 얻은. Homozygous 돌연변이 페이지 젤에 homoduplex 패턴을 표시 하 고 따라서 WTs를 구별할 수 있을 것. 이러한 genotypes 구별, 페이지 젤 분석의 또 다른 라운드 WT 대립 필요가17설명 되어 있는 대로, 공부 샘플 혼합에서 PCR 제품에서 수행 되어야 합니다.
약 90% (88/98) WT 및 heterozygous 배아를 성공적으로 성인 기에 올렸다 (> 2 개월). Aldh7a1 와 plpbp 는 이른 죽음 표현 형을 표시 하는 손실의 기능 돌연변이, 치료 되지 않는 동물 성인 기에 발생 하지 수 없습니다. 그러나, 모든 살아남은 WT 및 heterozygous 성인 genotypes genotypes 애벌레 핀 생 검 절차를 사용 하 여 식별에 대 한 100% 정확도 비율을 나타내는 애벌레 핀 클리핑 결과 동일 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig1.jpg"> 그림 1입니다. 애벌레 핀 클립. (A). 3 일 후 수정 (dpf)에서 애벌레 핀 비 절단. 라인은 transection, 안료 간격 내에 있는 사이트를 나타냅니다. 검은 화살표 꼬리 혈액 순환의 한계를 보여 줍니다. (B). 유 충 다음 지 느 러 미 3 dpf에서 클리핑 절차. (C). 5 dpf에 애벌레 zebrafish 핀 자라나. 지 느 러 미 재생 blastemal 대형에서 유일한 2 일 후 느 transection을 관찰 됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58024/58024fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig2.jpg"> 그림 2입니다. 애벌레 핀 클리핑 절차. (A). 애벌레 테이프에 놓이고 초과 배아 미디어 제거 됩니다. 그림 1A와 같이 현미경, fin 안료 간격의 지역에서 transected은. microscalpel을 사용 하는 지 느 러 미를 수집 하 고 필터 종이에 배치 하면 터치 (B), 표면 및 검은 반점으로 쉽게 구상 될 수 있다. 필터 종이 지 느 러 미를 포함 하 고 원하는 지역 (C)를 둘러싼 작은 정사각형을 잘라. 96 잘 접시 (D)의 우물에는 지 느 러 미를 포함 하는 필터 종이의 작은 조각을 놓습니다. 해당 유 충 배아 미디어 (E)의 200 µ L에서 평면 아래 96 잘 접시의 해당 배치 되어야 합니다. 필터 종이 조각 세포의 용 해 솔루션 (F)에서 침수 한다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58024/58024fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig3.jpg"> 그림 3입니다. 유전형 애벌레 핀 biopsies에서 aldh7a1 heterozygous 십자가의. (A). 예상된 결과 WT 및 aldh7a1ot100 대립 유전자의 증폭 434-bp amplicon에 결과. 293-bp 밴드 (aldh7a1ot100, 5 bp 삽입), 돌연변이 체 대립 유전자의 증폭에서 발생 그리고 195-bp 밴드는 WT 대립 유전자에 대 한. (B). aldh7a1 애벌레 지 느 러 미 조직에서 예의 PCR 증폭. 1 kb 분자량 마커 레인 7에 표시 됩니다. 레인 1-6 각 단일 지 느 러 미 생을 나타냅니다. PCR 결과 확인 aldh7a1-/- (aldh7a1ot100/ot100) genotypes (1 레인) aldh7a1+ heterozygous genotypes (aldh7a1+ ot100) (3, 4, 및 5 차선)와 무게 ( aldh7a1+ +) genotypes (레인 2, 6)입니다. (C). 정렬 시퀀스 WT 5 bp 삽입 돌연변이의 위치를 보여주는 aldh7a1ot100 대립 유전자 사이. 이 수치는 페 냐 외 의 보충 그림 5에서 적응 시켰다 9 미국의 유전학 사회에서 부여 하는 권한이 있는. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58024/58024fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig4.jpg"> 그림 4입니다. Plpbp 의 유전형 heterozygous (2 bp 삭제/4 bp)에서 삭제 애벌레 핀 biopsies 복합. (A). 예상된 결과 WT 대립 유전자의 증폭 272-bp amplicon에 결과. 4 혈압 삭제 대립 유전자 (plpbpot101)와 2 혈압 삭제 대립 유전자 (plpbpot102)와 5-bp 대체 각각 amplicon 길이 268-혈압과 270-bp의 생산. heteroduplex WT 대립 유전자 (plpbp+) heterozygous 유전자에 돌연변이 체 대립 유전자 사이 형성 된다. 대립 유전자 일치 때문에 heteroduplex의 형성 WT homoduplex에 비해 젤 내의 악대의 지체가 될 수 있습니다. (B). PCR 확대의 자손의 애벌레 핀 잘라낸에서 결과 plpbp+ ot101x plpbp+ ot102 십자가. 1 kb 분자량 마커 레인 1에 표시 됩니다. 차선 2-10 각 단일 지 느 러 미 생을 나타냅니다. PCR 결과 식별 돌연변이 genotypes (plpbp-null 복합 heterozygous plpbpot101/ot102, 2, 4, 및 8 차선), heterozygous genotypes (3, 6, 7, 9, 및 10 차선)와 WT genotypes (5 레인). (C). 시퀀스 WT 및 4-bp 삭제 돌연변이의 위치를 보여주는 plpbpot101 대립 유전자 사이의 정렬. (D). 정렬 시퀀스 WT (굵게) 2-혈압 삭제 및 5 bp 대체의 위치를 보여주는 plpbpot102 대립 유전자 사이. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58024/58024fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>20 μ 반응</td>
			<td>100 반응</td>
			<td>최종 하자마자</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nuclease 무료 H2O</td>
			<td>7.45 Μ</td>
			<td>745 Μ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>이동-Taq 2 (Promega, M7122) x</td>
			<td>10 Μ</td>
			<td>1000 Μ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 Gen1_FW</td>
			<td>0.25 Μ</td>
			<td>25 Μ</td>
			<td>0.125 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 5 nt-기능-specific_FW</td>
			<td>0.3 Μ</td>
			<td>30 Μ</td>
			<td>0.15 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 Gen2_RV</td>
			<td>0.25 Μ</td>
			<td>25 Μ</td>
			<td>0.125 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 WT-specific_RV</td>
			<td>0.25 Μ</td>
			<td>25 Μ</td>
			<td>0.125 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>1.5 Μ</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 멀티플렉스 PCR에 사용에 대 한 반응 조건에서 aldh7a1 이 프로토콜에서 대립 유전자. 사용 하는 뇌관은 다음과 같습니다: Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5'-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-기능-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3', 그리고 "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. 뇌관 주식 10 µ M 이었다입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>13 μ 반응</td>
			<td>100 반응</td>
			<td>최종 하자마자</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>3.25 Μ</td>
			<td>325 Μ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>이동-Taq 2 (Promega, M7122) x</td>
			<td>6.25 Μ</td>
			<td>625 Μ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 FW</td>
			<td>1 Μ</td>
			<td>100 Μ</td>
			<td>0.77 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 RV</td>
			<td>1 Μ</td>
			<td>100 Μ</td>
			<td>0.77 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>1.5 Μ</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. PCR에 사용에 대 한 반응 조건 plpbp 이 프로토콜에서 대립 유전자. 앞으로 뇌관을 사용 했다 PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 '와 반대로, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. 뇌관 주식 10 µ M 이었다입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>사이클 단계</td>
			<td>임시입니다.</td>
			<td>시간</td>
			<td>사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>초기 변성</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>3 분</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>변성 시키기</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>30 초</td>
			<td rowspan="3">36</td>
		</tr>
<tr>
<td>어 닐 링 *</td>
			<td>° C X</td>
			<td>30 초</td>
		</tr>
<tr>
<td>확장</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>20 초/kb</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">마지막 확장</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>5 분</td>
			<td rowspan="2">1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>보류</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3입니다. 이 프로토콜에 사용 되는 PCR 조건.

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High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

13.9K 조회수.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

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Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

연구

유전학

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

발생학

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

신경과학

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

<meta charset="utf8"></head><body>CRISPR/Cas9 Knock-In을 사용한 제브라피시 유충의 형광 단백질 태깅

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

요약

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개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

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제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

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