Questo protocollo fornisce un modo rapido per valutare gli effetti dell'abbattimento del gene WC5, che è la causa più comune di epilessia focale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo usarla per valutare l'epilessia, come il fenotipo utilizzando caratteristiche sia comportamentali che fisiologiche in varie fasi dello sviluppo. Un giorno prima della micro iniezione, allestire le vasche di accoppiamento Zebrafish.
La mattina dell'iniezione, rimuovere i divisori per consentire la deposizione delle uova. Utilizzare un setaccio fine per trasferire le uova in piastre di Petri da 100 millimetri, riempite con acqua embrionale. Usando un pipetto di plastica Pasteur, scegli da 60 a 80 uova e disponi le uova in una capsula di Petri rivestita di silicone per l'iniezione.
spostiamo gran parte dell'acqua, lasciando quel tanto che basta per coprire le uova a metà strada. Posizionare un ago di vetro verticalmente in un tubo di soluzione per iniezione. Lasciare che la soluzione colorata riempia il tubo per azione capillare per un periodo di diversi minuti.
Quando la soluzione iniettabile è visibile nella punta dell'ago, montare l'ago sulla maniglia di iniezione del microiniettore e accendere il compressore d'aria. Regolare l'impostazione della pressione per generare un volume di iniezione di due nanolitri. E per posizionare le uova sotto un microscopio binoculare dissezionante, con un ingrandimento quattro volte.
Inserire la punta dell'ago attraverso il corion e il tuorlo degli embrioni monostadio per iniettare la soluzione direttamente all'interno di ciascuna cellula. Quindi trasferire gli embrioni iniettati in una capsula di Petri da 100 millimetri etichettata di acqua embrionale e posizionare la piastra in un'incubatrice a 28 gradi Celsius. 28 ore dopo la fecondazione, posizionare una griglia di plastica a maglie da 1,2 per 1,2 millimetri nella parte inferiore della piastra di prova.
Utilizzare una pipetta Pasteur di plastica per posizionare da 10 a 12 embrioni all'interno delle loro cori sulla rete di plastica. Riempi il piatto con abbastanza acqua embrionale per mantenere l'embrione sommerso, ma non galleggiante, spostando attentamente gli embrioni con una punta di plastica in posizione sulla griglia se necessario. Quindi, utilizzando una videocamera collegata a un microscopio di dissezione, registrare l'attività di avvolgimento spontaneo per 10-20 minuti.
Per analizzare il movimento spontaneo totale, utilizzate il modulo di quantificazione dell'attività in un sistema di laboratorio Zebra per caricare il video registrato e progettare le arene di tracciamento intorno a ciascun embrione in modo appropriato. Impostare le soglie di congelamento e scoppio rispettivamente su 10 e 50. E quando l'analisi video automatizzata, che quantifica l'attività totale all'interno di ciascuna delle arene definite.
Quindi recuperare il set di dati come foglio di calcolo per eseguire l'analisi, utilizzando il software di analisi dei dati appropriato. 46 ore dopo la fecondazione, utilizzare una pinzaccia fine per deconiurare gli embrioni e riempire una parabola da 130 millimetri con acqua per embrioni. Almeno 15 minuti prima del resto, riscaldare la piatta di prova in un'incubatrice a 28 gradi Celsius.
Per eseguire un test di risposta alla fuga evocata dal tocco, utilizzare una pipetta Pasteur di plastica per posizionare un embrione al centro del piatto di prova, sotto la telecamera. Inizia la registrazione, utilizzando una velocità di acquisizione di 30 fotogrammi al secondo. Usando una punta di plastica fine, tocca leggermente la coda dell'embrione con un movimento di scorrimento.
Interruzione della registrazione, quando la larva ha terminato il suo movimento. Quindi, trasferire l'embrione in un nuovo piatto di tenuta pieno di acqua fresca per embrioni e ripetere il test con tutti gli embrioni necessari per ogni condizione sperimentale. Per preparare il pesce Zebra per l'analisi elettrofisiologica, posizionare uno, quattro o sei giorni dopo la fecondazione del pesce in una capsula di Petri con fondo di vetro.
Rimuovi l'eventuale eccesso di terreno extra marinaro per assicurarti che il pesce sia il più vicino possibile al fondo del piatto. Usa una pipetta di pasta di plastica per aggiungere abbastanza agros liquidi caldi per coprire la larva. Mentre l'agros hardnes, usa una pinna fine per orientare il lato ventrale del pesce verso il basso al centro del piatto.
Quindi aggiungere due millilitri di soluzione di registrazione, contenente 10 bromuro di pancuronio micromolare al piatto per bloccare la trasmissione neuromuscolare. Quindi, riempire un micropipettaggio con una soluzione di registrazione e utilizzare un amplificatore a morsetto patch nella configurazione del morsetto di tensione, per misurare la resistenza dell'elettrodo nella vasca da bagno per confermarne il valore corretto. Utilizzando un obiettivo 20x, posizionare la testa della larva nel campo visivo centrale e abbassare il micropipetto per raggiungere la posizione di registrazione all'interno del tectum ottico.
commutare l'amplificatore patch clamp sulla configurazione corrente del morsetto e fissare la corrente di tenuta a zero milliampere. Utilizzando un filtro passa-basso di un kilohertz e una velocità di acquisizione di un kilohertz e un guadagno digitale di 10, registrare l'attività spontanea del pesce per 60 minuti per determinare i livelli di attività di base. Alla fine della registrazione al basale, a 143 microlitri di una soluzione di pentilenetetrazolo da 300 millimolari per litro al bagno, per una concentrazione finale di 20 millimolari per litro.
Registrare l'attività neuronale dell'animale in soluzione di pentilenetetrazolo per altri 120 minuti. Durante il periodo basale della registrazione, da quattro a sei giorni dopo la fecondazione i modelli epilettici dei pesci zebra mostrano una maggiore incidenza di eventi spontanei, mentre i pesci di controllo della mancata corrispondenza mostrano pochissime fluttuazioni. Dopo l'applicazione del pentilenetetrazolo, sia il controllo della mancata corrispondenza che i modelli epilettici di pesci zebra mostrano un numero maggiore di eventi di polarizzazione profonda.
Durante il primo periodo dopo l'applicazione di pentylenetetrazole, si osserva un tasso di 0,8 eventi al minuto sia nel controllo del mismatch che negli animali abbattuti per i quali la maggior parte degli eventi è di ampiezza elevata. Durante quest'ultimo periodo di risposta. Il tasso di eventi di depolarizzazione aumenta a circa un evento al minuto.
E la maggior parte degli eventi sono di bassa ampiezza. Quando si esegue il knock down, è molto importante stabilire la dose corretta di morfolinos utilizzando una curva di risposta alla dose ed eseguire controlli per evitare tossicità non specifiche. Questa spinta consente diversi studi a valle, tra cui la sperimentazione degli effetti dei modificatori genetici o chimici.
E il comportamento di Zebrafish e l'attività neurale per comprendere gli effetti sullo sviluppo delle cinque mutazioni DC.
