Alex L. Kolodkin에게 감사의 말을 전합니다. 그의 실험실에서이 필렛 준비 프로토콜을 배웠습니다. 홍영기 씨에게도 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ)에 의해 지원되었습니다.

1. 준비 <ol><li> 1X PBS 500 mL에 소 혈청 알부민 (BSA) 0.5 g과 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (표 2 참조) 0.5 mL를 첨가하여 t- 옥틸 페녹시 폴리에 톡시 에탄올 (PBT) 용액으로 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 30 분 이상 교반 하였다. 4 ° C에서 보관하십시오. 비교적 신선한 상태에서 사용하고 용액을 깨끗한 병에 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수 6.5 mL에 16 % 스톡 파라 포름 알데히드 용액 2.5 mL와 10 mL PBS 1 mL를 넣어 4 % 파라 포름 알데히드 10 mL를 만든다. 4 ° C에서 보관하고 일주일 이내에 사용하십시오. 주의 : 파라 포름 알데히드 용액은 독성이 강하기 때문에 피부와의 접촉을 피하십시오. </li><li> 1 ML의 DMSO 당 0.1 g의 X-Gal 기질을 용해하여 X-Gal 기질 (10 % w / v X-Gal / dimethyl sulfoxide (DMSO))을 만든다. 100 μL 분취 량으로 -20 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 10 MM 인산 완충액 (산도 7.2), 150 MM NaCl, 1 MM MgCl 2 , 3m을 사용하여 X - Gal 얼룩 솔루션을 확인하십시오MK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ], 및 0.3 % t- 옥틸 페녹시 폴리에 톡시 에탄올. 어둠 속에서 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수로 30 % 스톡 과산화수소 1:10을 희석하여 3 % 과산화수소 용액을 만드십시오. </li><li> 신선한 PBT 용액 35 mL에 DAB 1 정 (10 mg)을 완전히 녹여 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘 (DAB) 용액을 만든다. 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과하고 -20 ℃에서 보관하십시오 (910 μL 분취 량). 주의 : 모든 DAB 폐기물을 표백제로 처리하여 DAB를 폐기하십시오. </li><li> 사과 주스로 달걀 접시를 만드십시오. 한천 35g과 탈 이온수 1L를 2L 플라스크에 넣는다. 1L 플라스크에 33g의 자당, 2g의 테 고세이트 및 375ml의 사과즙을 넣는다. 30 분 동안 고압 증기 멸균으로 그들을 녹입니다. 두 용액을 약 60 ° C로 식힌다. 이 용액을 잘 저 어서 혼합하고 혼합하십시오. 60mm 배양 접시 당 ~ 11mL의 혼합 용액을 붓습니다. </li><li> 빵 굽는 사람을 혼합해서 효모 풀을 만드십시오(1 : 0.8 비율)에 넣고 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 2. 배아 컬렉션 (주 1) <ol><li> 젊은 암컷과 수컷 파리 (5 일 미만)를 모으고 1-2 일 동안 센터에 소량의 효모 페이스트가 들어있는 난 접시 (60mm x 15mm)가있는 플라스틱 비이 케이지에 넣어 유지하십시오. </li><li> 후기 16 기 배아를 최적으로 채취하려면 오후 5 시경 파리 (&gt; 50)로 병 케이지를 설치하고 25 ° C에서 3 시간 동안 알을 낳게하십시오. </li><li> 파리를 신선한 음식 병으로 옮기십시오. </li><li> 뚜껑을 달고 계란 접시를 닫고 25 ℃에서 거꾸로 가온하십시오. 가습기 배양기 (~ 70 % 습도) 하룻밤. </li></ol> 3. 면역 염색을위한 태아 준비 (2 일째) <ol><li> 오전 10시 20 분경에 계란 판에 PBT 용액 1.8 mL를 넣고 면봉을 사용하여 접시에서 태아를 느슨하게합니다. 참고 : 부드럽게 cott를 사용하여 효모 붙여 넣기를 매시함으로써면봉에 많은 배아가 발견 될 경우를 대비해 용해하십시오. 고정하기 전에 ~ 40 분 전에 태아 수집을 시작하십시오 (오전 11 시경). </li><li> 난 접시에서 1 ML 피펫 팁을 사용하여 1.5 ML의 마이크로 튜브로 배아를 전송합니다. </li><li> 배아가 정착하고 가능한 한 PBT 솔루션을 대기음을 허용합니다. 배아를 PBT 솔루션 1 ML로 두 번 씻어. 가능한 한 많이 PBT 용액을 흡인하십시오. </li><li> 50 % 표백제 ( 즉, 탈 이온수로 희석) 1 ML로 튜브를 채우고 실내 온도 (RT)에서 3 분 nutator에 배양하여 배아 dechorionate. 참고 :이 단계는 dechorionated 배아를 죽이지 않습니다. </li><li> dechorionated 배아가 정착되도록 가능한 50 % 표백제를 대기음, 그리고 PBT 솔루션 1 ML로 배아를 3 번 ​​씻어. </li><li> 헵탄 0.5 mL를 넣고 4 ° 파라 포름 알데히드 용액 0.5 mL를 실온에서 오전 11 시경에 관에 넣는다. </li><li> 인큐베이터RT에서 15 분 동안 nutator에 배아. </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드 용액 (바닥층)을 제거한다. </li><li> 100 % 메탄올 0.5 ML을 추가하고 격렬하게 30 초 동안 튜브를 흔드는하여 배아를 devitellinize. </li><li> 헵탄 ( 즉, 상단 층)을 제거하십시오. </li><li> 100 % 메탄올 0.5 ML을 추가하고 격렬하게 10 초 동안 튜브를 흔드십시오. </li><li> 튜브를 도청하여 배아가 정착되도록 최대한 메탄올을 대기음. 10 초 미만 동안 흔들어 100 % 메탄올 1 ML로 배아를 씻어. 주 : 메탄올에 장시간 노출되면 β-Gal 활성이 파괴됩니다. </li><li> 메탄올을 제거하고 PBT 솔루션 1 ML로 devotellinized 배아를 3 번 ​​씻어. </li></ol> 4. LacZ 얼룩을 사용하여 태아의 유전자형 결정 (2 일째) <ol><li> 튜브에 1 ML의 PBT 솔루션을 추가하고 15 분 37 ° C 열 블록 또는 수조에서 튜브를 품어. </li><li> 배양하는 동안, X-Gal 염색 용액 (1 mL / tu) 65 ° C에서 수욕에서 흐려질 때까지. 37 ° C 수 욕조에서 그것을 품어. </li><li> PBT 솔루션을 대기음 튜브에 X - Gal 얼룩 솔루션 1 ML 및 X - 갈색 기판 20 μL를 추가합니다. </li><li> 푸른 침전물이 분명 때까지 계곡과 37 ° C에서 튜브를 품어. 참고 : 2 차 및 3 차 블루 밸런서의 배양 시간은 일반적으로 2 ~ 4 시간입니다. </li><li> X - Gal 얼룩 솔루션을 제거하고 1 ML의 RT PBT 솔루션으로 배아를 씻어 3 회. </li><li> 바늘 프로브 또는 포 셉를 사용하여 원하는 유전자형 ( 즉, 비 얼룩 흰 배아)의 배아를 빛 해부 현미경 (1.6X - 2.5X 목적)과 손으로 정렬합니다. 주 : CyO, 액틴 -LacZ 및 TM3, 액틴 -LacZ 와 같은 일부 청색 밸런서는 액틴 프로모터의 제어하에 박테리아 β-Gal (LacZ)을 발현하는 트랜스 제닉 구조물을 지니고 있기 때문에, 유비쿼터스 방식으로 청색으로 착색 된 배아는블루 밸런서 염색체 하나 또는 두 개의 복사본. 따라서 염색되지 않은 흰 배아는 원하는 치사 대립 유전자에 대해 동형 접합체이다. </li></ol> 5. 항 Fasciclin II 항체로 태아의 Immunostaining (2-3 일) <ol><li> 수집 및 1 ML 피펫 팁을 사용하여 0.5 ML microtube에 원하는 유전자형 ( 즉, 비 얼룩 흰 배아)의 배아를 전송할 수 있습니다. 참고 :이 단계에서 배아는 표피의 세분화 패턴과 머리와 꼬리의 구조를 포함하여 형태 학적 기준에 따라 대략적으로 스테이징 될 수 있습니다. 머리가 빠져 나가는 동안, 난자가 놓인 후 10 시간에서 16 시간 사이에, 배아는 가장 앞쪽에있는 부분을 현저히 감소시킵니다. </li><li> 배아를 0.4 mL의 PBT 용액으로 한번 씻고 0.3 mL의 블로킹 용액 (5 % 정상 염소 혈청 및 5 % DMSO를 PBT 용액에 넣는다)을 넣는다. </li><li> 15 분 RT에서 nutation과 배아를 차단합니다. </li><li&gt; 항 Fasciclin II 항체 75 μL를 추가하고 하룻밤 RT에서 관상 동맥과 튜브를 품어. </li><li> 배양액을 0.4 mL의 PBT 용액으로 4 회 씻으십시오. </li><li> 염소 항 마우스 HRP 항체 (2 μg / ML)를 포함하는 차단 용액 (PBT 용액에 5 % 정상 염소 5 %) 0.3 ML을 추가하고 하룻밤 RT에 nutration와 튜브를 품어. </li><li> 배양액을 0.4 mL의 PBT 용액으로 6 회 씻으십시오. </li><li> 튜브에 DAB 용액 0.3 mL를 넣는다. 주의 : 장갑을 착용하고 모든 DAB 폐기물 / 튜브 / 팁을 표백제에 넣으십시오. </li><li> 3 % 과산화수소 2 μL를 추가하고 침전물의 원하는 금액이 생산 때까지 RT에서 열차와 어둠 속에서 튜브를 품어. 참고 : 1D4 면역 조직 화학 요법의 배양 시간은 일반적으로 0.5-1 시간입니다. </li><li> 0.4 ML의 PBT 솔루션으로 배아를 4 번 씻으십시오. 주의 : DAB 용액을 제거하고 처음 두 번의 세척은 피펫과 di표백제에 그들을 두려워하십시오. </li><li> RT 또는 4 ° C에서 튜브에 70 % 글리세롤 / PBS 용액을 올려 놓고 0.2 mL를 넣으십시오. 참고 : 튜브는 빛으로부터 멀리하십시오. 배아를 90 % 글리세롤 / PBS 용액에 넣음으로써 더 깨끗한 준비를 할 수 있습니다 10 . 그러나, 90 % 글리세롤 / PBS 솔루션 10 에서 제거 된 것보다 90 % 글리세롤 / PBS 솔루션에서 제거 된 배아를 해부하는 것이 더 어렵습니다. </li></ol> 6. 준비, 해부, 설치 및 이미징 (4 일) <ol><li> 준비를 위해 70 % 글리세롤 / PBS로 평형 배아를 슬라이드 유리에 옮기십시오. </li><li> 복부 부분 7 (A7), A8 및 A9 ISN 신경이 서로 닿기 위해 수렴하거나 / 또는 3 개의 밴드로 세분되는 중간 덩어리를 가진 늦은 무대 -16 배아를 수집합니다. 참고 : 1D4 항체로 얼룩진 태아는 ISN 및 ISNb 모터 axons의 투영 패턴을 기반으로 준비 할 수 있습니다. CNS, A7, A8 및 A9 ISN ne를 종료 한 후후기 16 단계 태아의 줄기는 서로 닿기 위해 수렴하고 이후에 서로 엇갈려서 등 근육으로 멀리 확장됩니다 ( 그림 1A의 화살촉). 그러나 16 단계 중반의 배아에서는 A7 ISN 신경이 A8 / A9 신경과 평행하게 확장됩니다 ( 그림 1B의 대괄호). 또한, 양쪽 hemisegments의 A6 ISNb 신경 (ventralateral 근육에 수직)의 투영 축은 대략 CNS 종축 axon fascicles ( 그림 1C의 화살표와 라인)의 후부와 정렬됩니다. 이러한 형태학적인 기준은 다른 유전형간에 다소 차이가 있습니다. 또는, 배아는 창자 형태학에 기초하여 준비 될 수있다 9 , 11 . 17 단계 이전에, midgut은 가슴과 같은 모양을 가지고있는 반면, midgut은 17 단계 12 단계로 세 개의 밴드로 세분됩니다. </li><li> 배아를 해부하십시오. <ol><li> 1m 사용L 주사기, 글리세롤 드롭에서 각 배아를 이동하고 배아 복부 - 얼굴을 위로 놓습니다. 전신 부분의 1/4과 전 축삭 돌기가없는 가장 후방 부위에서 앞쪽 부분을 잘라냅니다. </li><li> 바늘 탐침을 사용하여 글리세롤 드롭에서 끝 컷 배아를 움직여 배면쪽으로 위로 향하게하고 롤을 필드에 수평으로 놓습니다. 참고 : 배아가 글리세롤 방울 밖으로 옮겨지면 배아와 관련된 글리세롤이 약간 끈적 거리게됩니다. </li><li> 하나의 매우 미세한 텅스텐 바늘 13을 사용하여 지느러미 중간 선을 따라 배아를 잘라내십시오. 배아의 후부 끝 부분에 작은 상처를 만들고 앞쪽을 향해 지느러미 중간 선을 계속 잘라내십시오. 반대 방향으로 절단해도 괜찮습니다. </li><li> 바늘 탐침을 사용하여 정중선 절단 배아를 글리세롤 방울로 옮기고 등쪽면을 위로 향하게하고 각 몸 벽을 ventralateral (대각선) 방향으로 펼쳐서 몸 벽에서 창자를 분리합니다 (2.5X 목표). 참고 : 등쪽 중간 선이 완전히 절단되어 왼쪽 및 오른쪽 몸체 벽이 완전히 분리되도록하십시오. </li><li> 조심스럽게 정중선 컷 배아를 글리세롤 드롭 밖으로 이동하고 미세 바늘 프로브 (2.5X 객관적인)를 사용하여 유리 슬라이드에 몸 벽의 두 플랩을 내려 놓으십시오. </li><li> 아주 미세한 텅스텐 바늘을 사용하여 내부 장기를 옆으로 밀어 (5X 객관적인) 해부 된 배아에서 제거하십시오. 참고 : 비슷한 해부 절차에 대한 자세한 설명은 웹 사이트 5 에서 찾을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 장착을 위해 깨끗하고 해부 된 배아에 70 % 글리세롤 / PBS 용액 2 ~ 3 μL를 넣고 미세 바늘 프로브를 사용하여 7 μL의 70 % 글리세롤 / PBS 용액이 퍼져있는 새로운 유리 슬라이드로 옮깁니다 센터 (2.5X 대물 렌즈). </li><li> 커버 슬립 (18mm x 18mm)을 착용하십시오. 정기 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 봉인하십시오 (맑거나 채색이 좋다). </li><li> 제조업체의 지침에 따라 차동 간섭 명암 (DIC) 광학 현미경으로 고해상도 (20X, 40X 및 63X 오일 침지 대물 렌즈)로 이미지를 캡처합니다. 참고 : 특히 ISNb 모터 축삭 돌기에 대한보다 나은 시각화 및 표현형 특성 분석은 63X 오일 침지 객관 물을 사용하여 생성 할 수 있습니다. </li></ol>

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Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).</li></ol>

저자는 그가 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언한다.

모터 축색 돌연변이 결함의 세부 사항은 DAB로 얼룩진 배아의 filleted 준비가 형광으로 표시된 것들의 공 촛점 현미경 검사보다 더 빠르고 정확도가 높습니다. 따라서, 고정 및 1D4 얼룩 배아의 필렛 된 준비는 안내 큐 분자의 기능적 특성 결정에 가장 적합합니다. 넷린, 슬릿, 세마포린 (semas) 및 에프 린을 비롯한 네 가지 주요 안내 단서와 그 동족 수용체는 웜, 파리 및 척추 동물을 통해 진화 적으로 보존 된 역할을합니다 20 . Drosophila Robo는 Slit에 대한 수용체 역할을하는 원형 (Robo) 계열 분자 중에서 CNS 6 에서 반발 유도 기능을 매개하는 것으로 처음 확인되었습니다. Semas는 plexin-containing 수용체 복합체 22 에 결합하는 안내 분자의 큰 계열입니다. Semas의 축삭 유도 기능메뚜기 CNS 14 에서 처음 발견되었습니다. 이어서, 클래스 1 막 횡단 Semaphorin Sema-1a는 Drosophila에서 광범위하게 특성화 되었다. Sema-1a는 plexin A의 리간드로서뿐만 아니라 알려지지 않은 리간드의 수용체 로서도 기능하며 , 배아 신경 발달 동안 특정 선택 지점에서 축삭 - 축색 반발에 중요한 역할을한다 15 , 16 , 17 , 18 ( 도 2c ). 현재 프로토콜에서 발생할 수있는 몇 가지 일반적인 문제 해결 단계가 있습니다. 첫째, 단계 3.9-3.13에서 태아는 너무 많거나 너무 작은 배아가 메탄올 탈락 과정에서 사용된다면 낮은 효율성으로 박탈 될 수있다. 이 경우 단계 3.5에서 탈락 소화를위한 고정 배아의 체적 40 ~ 80 μL를 사용하는 것이 좋습니다. 둘째, steps 3.9-3.13, 메탄올 또는 불완전 헵탄 제거에 오래 노출 될 경우 약한 X-Gal 염색이 발생할 수 있는데, 이는 고정액으로 사용되는 메탄올이 β-Gal 활성을 파괴하기 때문입니다. 이 경우 단계 3.9-3.13에서 메탄올을 사용하는 이탈 제거 절차가 가능한 한 빨리 수행되는 것이 가장 좋습니다. 또한 메탄올에 가용화 된 잔류 헵탄은 염색을 방해 할 수 있습니다. 그러므로 단계 3.11-3.13에서 최대한 많은 메탄올을 제거하는 것이 가장 좋습니다. 현재 filleted preparation protocol은 기능 상실 및 기능 상실 유전 스크린에 적용되어 모터 축색 돌연변이 및 표적인지에 관여하는 새로운 유전자를 확인합니다. 그러나,이 프로토콜의 단점은 filleted 준비를 생성 고정 배아를 해부하는 것은 꽤 시간이 걸리는 것입니다. 이 문제를 극복하기 위해 축색 돌기의 표현형 특성을 1D4로 염색 된 emb이 방법은 주변부에서 축삭 돌기의 저해상도 시각화를 제공하지만, 그럼에도 불구하고, 전체 마운트 준비 프로토콜은 축삭 유도 유전자 4 를 스크리닝하는 효율적인 방법임이 입증되었습니다. 형광 라벨 배아의 라이브 해부를 사용하여 대체 프로토콜은 최근 체계적인 심사를 위해 개발되었습니다 11 . 라이브 해부 프로토콜은 phenotypic 분석 11 비교적 빠른 준비를 허용합니다. 그러나,이 프로토콜은 단계 17 11 의 시작보다 오래된 배아에 적합하지 않습니다. 여기에 설명 된 filleted preparation protocol은 다른 항체로 단백질 발현 양상을 조사하는데 사용될 수있다. 또한,이 프로토콜은 개발 의 다양한 단계에서 초파리 배아에 적용 할 수 있습니다.

배아 발생 과정에서 모터 축삭과 표적 근육 사이의 정확하고 선택적 연결은 Drosophila 애벌레의 정상적인 이동에 필수적 입니다. 복부 hemisegment A2-A7 각각에서 30 개의 근육 섬유의 배아 패터닝은 단계 16 1 에 의해 확립된다. 복부 신경 코드에서 생성 된 36 개의 운동 뉴런은 축삭을 주변으로 확장시켜 특정 표적 근육을 신경 자극합니다 2 . 모터 축색 돌연변이와 표적인지는 항체 (마우스 단클론 항체 1D4) 3 , 4로 면역 조직 화학으로 시각화 할 수 있습니다. 야생형 배아에서 모터 축삭 돌기 패턴의 다중 이미지는 웹 5에서 사용할 수 있습니다. 1D4 항체는 배아 중추 신경계 (CNS) 4 정중선의 각 측면에있는 모든 모터 축삭 및 세 개의 세로축 축삭 줄기를 표시합니다 </sup&gt; , 6 ( 도 1C 및 도 2A ). 따라서 FasII 항체를 이용한 면역 조직 화학은 운동 축삭 유도 및 표적 인식의 기본이되는 분자 메커니즘을 증명하기 위해 신경근 연결에 필요한 유전자를 확인하는 강력한 도구를 제공합니다. 복부 hemisegments A2-A7의 각각에서, 모터 축삭 돌기는 2 개의 주요한 신경 가지로 분열 신경 (SN) 및 intersegmental 신경 (ISN) 2 및 4 , 및 작은 신경 분기, TN ) 7 . SN은 ISN, ISNb 및 ISNd 2 , 4 라고 불리는 3 개의 신경 가지로 분할하는 반면, SN은 선택적으로 탈 섬유되어 두 개의 신경 가지 인 SNa 및 SNc를 발생시킵니다. 그 중에서도 ISN, ISNb 및 SNa 모터 축삭투상 패턴은 말기 16 기 배아가 FasII 항체로 염색되고 필렛 처리되면 가장 정확하게 시각화됩니다 ( 그림 1C 및 그림 2A ). ISN 운동 뉴런은 축삭을 등쪽 근육 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19, 20 2 , 4 ( 그림 2A )를 자극하도록 확장시킵니다. ISNb 모터 뉴런은 6, 7, 12, 13, 14, 28 및 30 2 , 4 ( 그림 2A 및 2B)의 복근 근육을 자극합니다. SNa 신경 가지는 측면 근육 5, 8, 21, 22, 23 및 24 2 , 4 ( 그림 2A )에 신경을 작용하도록 돌출합니다. 두 모터 엑손으로 구성된 TN은 근육을 자극 할 수 있도록 분절 경계를 따라 일 측적으로 돌출하고, 근육에서 신경 양측 신경근 (lateral bipolar dendritic neuron, LBD)과 시냅스를 만든다.( 도 7 ). 이러한 목표 근육 내향은 특정 ​​선택 지점에서 모터 축삭의 선택적 탈 섬유화뿐만 아니라 근육 인식을 목표로합니다. 또한, 중간 표적으로 작용하는 일부 추정 중배엽 안내 표지 세포는 ISN 및 SNa 경로 모두에서 발견되었지만 ISNb 경로에서는 발견되지 않았다. 이것은 ISNb 모터 축삭 길 찾기가 ISN 및 SNa 모터 축삭 유도와 비교하여 뚜렷한 방식으로 조절 될 수 있음을 시사하며, 또한 말초 모터 축삭 유도가 단일 안내 큐의 차별적 인 또는 보존 된 역할을 연구하기위한 매력적인 실험 모델을 제공한다는 것을 나타낸다 분자 8 . 이 작품은 Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 axonal 투영 패턴을 시각화하는 표준 방법을 제공합니다. 설명한 프로토콜은 1D4로 얼룩진 고정 배아를 해부하는 방법을 포함filtted 제제의 경우 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘 (DAB)으로 가공한다. 고정 배아의 편평한 준비의 한 가지 중요한 이점은 주변에서 축삭 돌기 및 근육 패턴의 더 나은 시각화입니다. 또한,이 작품은 또한 LacZ 얼룩 방법을 사용하여 원하는 돌연변이 배아를 정렬 고정 배아를 유전자형하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal Substrate</td><td>US Biological</td><td>X1000</td><td>X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244023</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>US Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Tricon Beaker</td><td>Simport</td><td>B700-100</td><td>This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Societe Industrielle Lesaffre</td><td>Saf Instant Yeast Red</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td><td>VWR</td><td>14220-263</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube (1.5 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>#72.690</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>The Clorox Company</td><td>Clorox</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FasciculinII Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4 anti-Fasciclin II</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-068</td><td>AffiniPure F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L)&lt;br/&gt; (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass</td><td>Duran Group</td><td>235501403</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Duran Group</td><td>235503104</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson Medical(s)</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Ted Pella</td><td>#27-11</td><td>Tungsten Wire, &amp;oslash;0.13mm/6.1m (&amp;oslash;.005&quot;/20 ft.)</td></tr><tr><td>Nutator (Mini twister)</td><td>Korean Science</td><td>KO.VS-96TWS</td><td>Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td></tr></tbody></table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

기능적 신경근 회로의 구축은 모터 축색 돌기와 표적 근육의 정확한 연결에 의존한다. 모터 뉴런은 주변 세포 외 환경에서 발생하는 많은 수의 축색 유도 신호에 반응하여 특정 경로를 따라 이동하기 위해 성장 원뿔을 확장시킵니다. 성장 원뿔 표적 인식은 또한 신경근 특이성에 중요한 역할을합니다. 이 연구는 후기 무대 16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 immunohistochemistry 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 원하는 돌연변이 배아를 분류하기위한 genotyping 절차를 포함한 몇 가지 주요 단계가 포함되어 있습니다. 배아에 fasciclin II (FasII) 항체를 표지하기위한 면역 염색 절차; 및 해부 절차, 고정 배아에서 filleted 준비를 생성합니다. 말초의 모터 축삭 돌기 및 근육 패턴은 filleted embryos의 편평한 준비 과정에서 wh보다 훨씬 더 잘 시각화됩니다올레 - 마운트 배아. 따라서, FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 모터 축색 돌연변이 및 표적 인식에 필요한 유전자를 특성화하기위한 강력한 도구를 제공하며, 기능 상실 및 기능 상실 유전 스크린 모두에 적용될 수있다 .

신경 발달 동안 모터 축삭과 표적 근육 사이의 정확한 연결은 선택적 축삭 - 축색 반발과 특정 선택 지점에서의 표적 인식에 달려 있습니다 4 . 초파리에서 모터 축삭 사이의 선택 반발은 부분 1과 2 세마포린 (Sema-1a, Sema-2a, Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . 따라서 Sema-1a 기능이 상실되면 ISNb 축삭 돌기가 특정 선택 지점에서 결석이 제거되어 비정상적으로 두꺼운 형태를 보이지 않게됩니다 ( 그림 2C의 화살촉). wildtype 배아에서, 적어도 7 모터 뉴런은 확장하고 축삭을 형성 ISNb 신경 가지 ( 그림 2A ). ISNb 신경 분지가 근육 6과 7 사이에있는 선택 지점에 도달하면, 두 개의 축삭이 주 ISNb 묶음에서 선택적으로 결말을 제거하고이어서 근육 6과 7을 자극합니다 ( 그림 2B ). 근육 6, 13 및 30 사이에있는 다음 선택 지점에서 또 다른 세 개의 모터 축삭은 근육을 13, 14 및 30 ( 그림 2B ) 신경을 자극하도록 선택적으로 모근 제거합니다. 나머지 두 개의 축색은 근육 12의 가장자리 근처의 마지막 선택 지점에 도달하기 위해 등쪽으로 확장되어 근육 12를 반대 방향으로 자극합니다 ( 그림 2B ). 이러한 결과는 filleted preparation protocol이 motor axon guidance에 필요한 유전자를 연구하는데 유용한 tool임을 보여줍니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig1.jpg" /> <strong&gt; 그림 1 : ISN 및 ISNb 모터 축색 돌기 패턴을 기반으로 배아의 준비. ( A ) 말기 16 야생형 배아에서 A7, A8 및 A9 ISN 신경 (화살표)이 서로 닿아 수렴합니다 (화살촉). 앞쪽은 왼쪽이고 복부는 아래쪽입니다. 눈금 막대 = 15 μm. ( B ) 중간 단계 16 야생형 배아에서 A7 ISN 신경은 A8 / A9 신경 (대괄호)과 평행하게 확장됩니다. 화살표는 A7, A8 및 A9 ISN 신경을 나타냅니다. 앞쪽은 왼쪽이고 복부는 아래쪽입니다. 눈금 막대 = 15 μm. ( C ) FasII 항체로 염색 된 늦은 무대 16 야생형 배아의 준비. 왼쪽 및 오른쪽 A6 ISNb 신경의 투영 축 (화살표)은 CNS 종축 축괴 (흑색 라인)의 후단과 대략 정렬됩니다. 복부 부분 A1-A7은 맨 위에 표시되어 있습니다. 앞쪽이 남았습니다. 스케일 바 = 15μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55830/55830fig1large.jpg" target="_blank">항변</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig2.jpg" /> 그림 2 : 야생형 및 Sema-1a 돌연변이 배아에서 모터 축삭 투영 패턴. ( A - C ) FasII 항체로 염색 된 16 기 배아 말기의 준비. 앞쪽은 왼쪽이고 복부는 아래쪽입니다. 각 패널에 표시된 축 방향 투영 패턴을 보여주는 구성도. 눈금 막대 = 15 μm. ( A ) 야생형 배아에서 두 개의 순차적 인 복부 반상 (A3 및 A4)의 밝은 현장 사진. 3 개의 양측 대칭 종축 축삭 덩어리가 중추 신경계에 존재한다. ISNb, SNa, ISN 및 TN 모터 축삭의 정상적인 신경 분포 패턴은 주변에 상자와 화살표로 표시됩니다. 알레르기 근육을 자극하는 lateral bipolar dendrite neuron (LBD)화살촉에 의해 ed. 개략도에서, ISNb (갈색), SNa (파란색), ISN (녹색), TN (노란색) 운동 신경 및 그 표적 근육의 신경 가지 및 신경 분포 패턴을 제시한다. 중추 신경계에서 이러한 운동 신경 세포의 세포체 위치도 자신의 색깔로 표시됩니다. ( B ) 야생형 배아에서, ISNb 축색 돌기는 번호가 매겨진 비 측 근육에 투영되고, 특정 선택 지점 (DIC 이미지의 화살표)에 신경 자극한다. ( C ) Sema-1a 기능 상실 돌연변이 체에서, ISNb 축삭은 종종 근육 6과 13 사이에서 서로 탈 섬유화되지 않는다 (DIC 영상에서 화살촉). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55830/55830fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K 조회수.  Chonbuk National University.  이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다. 

비디오: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

연구

신경과학

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

발생학

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

의 작성<em&gt; Drosophila</em에 대한&gt; 중부 뉴런<em&gt; 현장에서</em&gt; 패치 클램핑

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60716/retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using'>Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)</a>This video demonstrates the method of retrograde labeling of Drosophila motor neurons using lipophilic dyes. The dye enters the axon, travels retrogradely, and labels the neurons green, allowing detailed visualization of their morphology and projections under a confocal microscope.

Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)This video ...

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화

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