私はAlex L. Kolodkinに感謝します。私は彼の研究室でこのフィレット付きの準備プロトコルを学びました。私はまた、技術支援のために香港のYoung Giに感謝します。この研究はNRF-2013R1A1A4A01011329（SJ）によって支持された。

1.準備<ol><li> 0.5Xのウシ血清アルブミン（BSA）と0.5mLのt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（材料の表参照）を1×PBS（500mL）に加えて、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（PBT）溶液で500mLのリン酸緩衝生理食塩水少なくとも30分間攪拌した。 4℃で保存する。比較的新鮮なときに使用し、清潔な瓶に保存してください。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド10 mLに、脱イオン水6.5 mLに16 mLストックパラホルムアルデヒド溶液2.5 mLと10 mL PBS 1 mLを加えて調製する。 4℃で保存し、1週間以内に使用してください。 注意：パラホルムアルデヒド溶液との接触は避けてください。毒性が強いためです。 </li><li> 1mLのDMSOあたり0.1gのX-Gal基質を溶解することにより、X-Gal基質（ジメチルスルホキシド（DMSO）中10％w / v X-Gal）を作製する。 100μLアリコートで-20℃で保存する。 </li><li> 10mMリン酸緩衝液（pH7.2）、150mM NaCl、1mM MgCl 2、3μlを用いてX-Gal染色溶液を作製する。MK 4 [FeII（CN） 6 ]、3mM K 3 [FeIII（CN） 6 ]、および0.3％t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール。暗所で4℃で保存する。 </li><li> 3％過酸化水素水を、30％原液の過酸化水素1:10を脱イオン水で希釈することによって調製する。 </li><li> DAB 1錠（10mg）を35mLの新鮮なPBT溶液に完全に溶解して3,3&#39;-ジアミノベンジジン（DAB）溶液を調製する。 0.2μmのシリンジフィルターでろ過し、-20℃で910μLのアリコートで保存します。 注意：すべてのDAB廃棄物を漂白剤に入れてDABを破壊してください。 </li><li>リンゴジュースで卵子を作る。 1L 35gの寒天と1Lの脱イオン水を2Lフラスコに加える。 33Lのスクロース、2gのテゴセプト、および375mLのリンゴジュースを1Lフラスコに加える。 30分間オートクレーブしてそれらを溶かす。両方の溶液を約60℃まで冷ます。これらの溶液を攪拌してよく混合する。 60ミリリットルの培養皿あたり〜11 mLの混合溶液を注ぐ。 </li><li>パン酵母をブレンドして酵母ペーストを作る（1：0.8の比）に入れ、4℃で保存する。 </li></ol> 2.胚コレクション（1日目） <ol><li>若い雌雄のハエ（5日未満）を採取し、1〜2日間、少量の酵母ペーストを中央に含む卵板（60mm×15mm）をプラスチックビーカーケージに入れて維持する。 </li><li>後期段階16胚の最適な収集のために、午後5時にハエ（&gt; 50）でボトルケージを設置し、3時間25℃で卵を産卵させる。 </li><li>フライドポテトを新鮮なフードボトルに移す。 </li><li>蓋をして卵プレートを閉じ、25℃で加湿インキュベーター（〜70％湿度）で一晩インキュベートする。 </li></ol> 3.免疫染色のための胚の調製（2日目） <ol><li>午前10時20分頃に1.8 mLのPBT溶液を卵板に加え、綿棒で卵を傾けながら胚を緩めます。 注：コットンを使用して酵母ペーストを静かにマッシュすることによりスワブ上に多数の胚が見つかった場合にはそれを溶かす。固定の約40分前（午前11時頃）に胚の採取を開始する。 </li><li> 1mLのピペットチップを使用して、卵プレートから1.5mLのマイクロチューブに胚を移す。 </li><li>胚を沈降させ、可能な限りPBT溶液を吸引する。 1mLのPBT溶液で胚を2回すすぐ。可能な限りPBT溶液を吸引する。 </li><li> 50％漂白剤（ すなわち、脱イオン水で希釈）1mLでチューブを満たし、室温（RT）で3分間ナットでインキュベートすることにより胚を脱皮する。 注：この手順では、脱皮した胚は死滅しません。 </li><li>脱皮した胚を沈降させ、できるだけ50％漂白剤を吸引し、1mLのPBT溶液で3回胚をすすいでください。 </li><li> 0.5mLのヘプタンを添加し、続いて0.5mLの4％パラホルムアルデヒド溶液を室温で午前11時頃に管に加える。 </li><li>インキュベートするRTで15分間ナッターで胚を摘出した。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド溶液（最下層）を除去する。 </li><li> 0.5mLの100％メタノールを添加し、30秒間激しくチューブを振盪することにより胚を脱皮する。 </li><li>ヘプタン（ すなわち、最上層）を除去する。 </li><li> 100mLのメタノール0.5mLを添加し、10秒間激しくチューブを振とうする。 </li><li>胚をチューブをタップして沈降させ、可能な限りメタノールを吸引する。 100％メタノール1 mLで胚をすすぎ、10秒未満振盪する。 注：メタノールへの長期暴露はβ-Gal活性を破壊する。 </li><li>メタノールを除去し、脱膜した胚をPBT溶液1mLで3回すすぐ。 </li></ol> 4. LacZ染色を用いた胚のジェノタイピング（2日目） <ol><li> PBT溶液1 mLをチューブに添加し、チューブを37℃のヒートブロックまたは水浴中で15分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション中に、X-Gal染色溶液（1mLあたり1mL水浴中で曇るまで65℃で保存してください。それを37℃の水浴中でインキュベートする。 </li><li> PBT溶液を吸引し、1 mLのX-Gal染色溶液と20μLのX-Gal基質をチューブに加えます。 </li><li>青色の沈殿が明らかになるまで、チューブを37℃で培養する。 注：第2 および第 3 のブルーバランサのインキュベーション時間は、一般に2〜4時間の範囲である。 </li><li> X-Gal染色溶液を除去し、1mLのRT PBT溶液で3回胚をすすぐ。 </li><li>針プローブまたは鉗子を用いて、所望の遺伝子型の胚（ すなわち、染色されていない白色胚）を光解剖顕微鏡（1.6X〜2.5X対物レンズ）で手で分類する。 注： CyO、アクチン-LacZおよびTM3、アクチン -LacZなどのいくつかのブルーバランサーは、 アクチンプロモーターの制御下で細菌β-Gal（LacZ）を発現するトランスジェニック構築物を担持しているため、遍在的に青く染色された胚は、青バランサー染色体の1つまたは2つのコピー。したがって、染色されていない白色胚は、所望の致死対立遺伝子についてホモ接合である。 </li></ol> 5.抗Fasciclin II抗体による胚の免疫染色（2-3日目） <ol><li>所望の遺伝子型の胚（ すなわち、染色されていない白色胚）を収集し、1mLピペットチップを用いて0.5mLマイクロチューブに移す。 注：この段階では、キュービクルのセグメンテーションパターンや頭と尾の構造を含む形態学的基準に従って、胚を大まかにステージングすることができます。頭部の崩壊の間、卵が飼育されてから10〜16時間の間に、胚は最も前側の部分9の顕著な減少を受ける。 </li><li> 0.4mLのPBT溶液で胚を1回洗浄し、0.3mLのブロッキング溶液（PBT溶液中5％正常ヤギ血清および5％DMSO）を加える。 </li><li> RTで15分間飼育して胚をブロックする。 </li><li&gt; 75μLの抗Fasciclin II抗体を添加し、チューブを室温で一晩インキュベートする。 </li><li> 1回の洗浄につき少なくとも20分間、0.4mLのPBT溶液で胚を4回洗浄する。 </li><li>ヤギ抗マウスHRP抗体（2μg/ mL）を含有するブロッキング溶液（PBT溶液中5％正常ヤギ血清）0.3mLを添加し、チューブを室温で一晩インキュベートする。 </li><li> 0.4mLのPBT溶液で胚を6回洗浄し、1回の洗浄につき少なくとも20分間洗浄する。 </li><li>チューブに0.3 mLのDAB溶液を加える。 注意：手袋を着用し、すべてのDAB廃棄物/チューブ/チップを漂白剤に入れてください。 </li><li> 3％過酸化水素2μLを添加し、望みの量の沈殿物が生成されるまで、チューブを室温で暗所でインキュベートする。 注：1D4免疫組織化学のインキュベーション時間は、一般に0.5〜1時間の範囲である。 </li><li> 0.4mLのPBT溶液で胚を4回洗浄する。 注意：DAB溶液を除去し、最初の2回の洗浄はピペットで行い、di漂白剤でそれらを傷つける。 </li><li> 70％グリセロール/ PBS溶液をチューブに0.2 mL添加し、室温または4℃で保存する。 注：チューブは光から遠ざけてください。胚を90％グリセロール/ PBS溶液10中に置くことにより、より明瞭な調製物を得ることができる。しかし、90％グリセロール/ PBS溶液で清澄された胚を、70％グリセロール/ PBS溶液10で浄化された胚よりも解剖することはより困難である。 </li></ol> 6.胚のステージング、解剖、マウントおよび画像化（4日目） <ol><li>ステージングのために、70％グリセロール/ PBSで平衡化した胚をガラススライド上に移す。 </li><li>腹部セグメント7（A7）、A8、およびA9 ISN神経が互いに接触するように収束する、および/または中腸が3つのバンドに細分される後期段階16の胚を収集する。 注：1D4抗体で染色された胚は、ISNおよびISNbモーター軸索の投影パターンに基づいてステージングすることができる。 CNSを出た後、A7、A8、およびA9 ISN ne後期段階-16の胚の群は互いに接触するように収束し、続いて発散して背側の筋肉に遠くまで広がる（ 図1Aの矢頭）。しかし、16段階中期胚では、A7 ISN神経はA8 / A9神経と平行して伸びる（ 図1Bの角括弧）。さらに、両半分のA6 ISNb神経（腹側筋に垂直）の投影軸は、CNS縦軸索束の後端とほぼ整列している（ 図1Cの矢印および線）。これらの形態学的基準は、異なる遺伝子型によって多少異なる。あるいは、胚の形態学に基づいて胚をステージングすることができる9,11。ステージ17に先立ち、中腸は心臓のような形をしているのに対して、中腸はステージ17,12によって3つのバンドに細分されている。 </li><li> 胚を解剖する。 <ol><li> 1mを使用するLシリンジで、各胚をグリセロール液滴から移動させ、胚を腹面を上にして置く。体の長さの1/4とモーター軸索のない最も後部の領域で前部を切断する。 </li><li>ニードルプローブを使用して、エンドカット胚をグリセロールドロップから移動させ、ロールバックして背側を上にして、フィールドに水平に置きます。 注：胚をグリセロール液滴の外に移動すると、胚に付随するグリセロールが少し粘着してしまいます。 </li><li>単一の非常に細かいタングステンの針13を使用して背面の正中線に沿って胚を切断します。胚の後端で小さな切れ目を作って、背中の正中線を前部に向かって引き下げ続けます。反対方向に切断しても問題ありません。 </li><li>ニードルプローブを使用して、正中線切断した胚をグリセロール液滴の中に移動させ、背側を上に置き、各腹壁を腹側（対角線）方向に展開することによって体壁から腸を分離する（2.5X対物レンズ）。 注：背中正中線が完全に切断されていることを確認し、左右の体壁を完全に分離します。 </li><li>慎重にグリセロールドロップから正中線切断胚を移動し、細い針のプローブ（2.5倍の対物レンズ）を使用してガラススライド上に体の壁の2つのフラップを置きます。 </li><li>非常に細かいタングステン針を使用して、横に（5Xの対物レンズ）それらを押すことにより、解剖された胚から内臓を除去する。 注：別の同様の解剖手順のより詳細な説明は、ウェブサイト5で見つけることができます。 </li></ol></li><li>マウントするには、70μlの70％グリセロール/ PBS溶液を2〜3μL添加して清潔な胚にし、細い針状プローブを使用して新しいスライドグラスに移し、7μLの70％グリセロール/ PBS溶液を広げてくださいセンター（2.5X対物レンズ）。 </li><li>カバースリップ（18mm×18mm）を置く。カバースリップのエッジを通常のマニキュアでシールします（どちらか透明または着色されています）。 </li><li>メーカーの指示に従って、微分干渉コントラスト（DIC）光学顕微鏡下で高解像度（20倍、40倍、および63倍油浸対物レンズ）で画像を取り込む。 注：ISNbモーター軸索の場合、特に視覚化と表現型の解析がより容易になるためには、63X油浸対物レンズを使用することができます。 </li></ol>

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	<li>Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+larval+muscles+in+Drosophila.">The embryonic development of larval muscles in Drosophila.</a> Development. 110 (3), 791-804 (1990).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67 (1), 45-57 (1991).</li><li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila.">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).</li><li>. Available from: <a target="_blank" href="https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html">https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html</a> (2017)</li><li>Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+genes+necessary+for+guidance+toward+or+away+from+the+midline.">Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline.</a> Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).</li><li>Thor, S., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+islet+gene+governs+axon+pathfinding+and+neurotransmitter+identity.">The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity.</a> Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).</li><li>Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ligand+regulation+of+PlexB+signaling+in+motor+neuron+axon+guidance+in+Drosophila.">Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole+mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+dissection+of+Drosophila+embryos:+streamlined+methods+for+screening+mutant+collections+by+antibody+staining.">Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining.</a> J. Vis. Exp. (34), (2009).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasciclin+IV:+sequence,+expression,+and+function+during+growth+cone+guidance+in+the+grasshopper+embryo.">Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo.</a> Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).</li><li>Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+semaphorin-1a-mediated+reverse+signaling+by+opposing+pebble+and+RhoGAPp190+functions+in+Drosophila.">The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila.</a> Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).</li><li>Winberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin+A+is+a+neuronal+semaphorin+receptor+that+controls+axon+guidance.">Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance.</a> Cell. 95 (7), 903-916 (1998).</li><li>Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+guidance+function+of+Rap1+small+GTPase+is+independent+of+PlexA+RasGAP+activity+in+Drosophila.">The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila.</a> Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).</li><li>Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+Semaphorin+Sema+I+is+required+in+Drosophila+for+embryonic+motor+and+CNS+axon+guidance.">The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance.</a> Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Kidd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roundabout+controls+axon+crossing+of+the+CNS+midline+and+defines+a+novel+subfamily+of+evolutionarily+conserved+guidance+receptors.">Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors.</a> Cell. 92 (2), 205-215 (1998).</li><li>Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+neural+circuits+into+shape+with+semaphorins.">Getting neural circuits into shape with semaphorins.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).</li></ol>

著者は競合する金銭的利益がないと宣言します。

モーター軸索誘導欠陥の詳細は、蛍光標識されたもののレーザー走査共焦点顕微鏡によるよりも、DABで染色した胚のフィレット調製物により、より迅速かつより正確に得点される。したがって、固定された1D4染色胚のフィレット調製物は、誘導キュー分子の機能的特徴付けに最も適している。ネトリン、スリット、セマフォリン（セマ）、エフリンなどの4つの主要な手がかりとそれらの同族受容体は、虫、ハエ、および脊椎動物の進化的に保存された役割を果たしている20 。ショウジョウバエの受容体として働くラウンドアバウト（Robo）ファミリー分子の中で、 ショウジョウバエ Roboは、CNSにおける反発誘導機能を仲介することが最初に確認された6,21。セマは、プレキシン含有受容体複合体22に結合するガイダンス分子の大きなファミリーである22 。 Semasの軸索誘導機能ニジマスのCNS 14で最初に発見された。続いて、クラス1膜貫通セマフォリンSema-1aは、ショウジョウバエにおいて広範に特徴付けられた 。セマ1aは、プレキシンAのリガンドとしてだけでなく、未知のリガンドの受容体としても機能し、胚神経発達中の特定の選択点での軸索 - 軸索反発に重要な役割を果たす15,16,17,18（ 図2C ）。 現在のプロトコルで発生する一般的なトラブルシューティング手順がいくつかあります。第1に、段階3.9~3.13において、メタノール脱グリチル化手順において使用される胚が多すぎたり小さすぎたりする場合、胚を低効率で脱皮することができる。この場合、ステップ3.5で脱鞭毛のために40〜80μLの固定胚のベッド容積を使用することが推奨される。第二に、steps 3.9-3.13では、固定剤として使用されるメタノールがβ-Gal活性を破壊するので、メタノールまたは不完全ヘプタン除去に長時間さらされた場合、弱いX-Gal染色が起こり得る。この場合、工程3.9~3.13でメタノールを使用する脱揮発工程は、できるだけ迅速に実施されることが最良である。さらに、メタノール中で可溶化された残留ヘプタンは、染色を妨害し得る。したがって、ステップ3.11-3.13でできるだけ多くのメタノールを除去することが最善です。 現行のフィレット調製プロトコルは、機能喪失および機能獲得遺伝子スクリーンに適用して、モーター軸索経路探索および標的認識に関与する新規遺伝子を同定することができる。しかし、このプロトコールの欠点は、固定された胚を切開して、フィレット調製物を生成することはかなり時間がかかることである。この問題を克服するために、軸索突起の表現型の特徴付けを、1D4で染色されたembの全マウント調製物でモニターすることができるこの方法は周辺部の軸索突起の低解像度視覚化を提供するが、それにもかかわらず、全身調製プロトコールは、軸索誘導遺伝子をスクリーニングするための効率的なアプローチであることが証明されている4 。最近、系統的スクリーニングのために、蛍光標識された胚の生検を用いた別のプロトコールが開発された11 。ライブ解剖プロトコールは、表現型解析のための比較的迅速な準備を可能にする11 。しかし、このプロトコールは、ステージ17の開始よりも古い胚には適切ではない。 ここに記載されたフィレット調製プロトコールは、異なる抗体を用いたタンパク質発現パターンを調べるために使用することができる。さらに、このプロトコールは、発育の様々な段階でショウジョウバエの胚にも適用することができる。

ショウジョウバエの幼生における正常な運動のためには、胚発生の間に運動軸索と標的筋肉との間の正確で選択的な結合が不可欠である。腹部半分体A2〜A7の各々における30本の筋線維の胚形成は、段階16 1によって確立される。腹側神経脊髄で生成された36個の運動ニューロンは、軸索を末梢に伸ばして特定の標的筋肉を神経支配する2 。モーター軸索の経路探索および標的認識は、抗体（マウスモノクローナル抗体1D4） 3,4による免疫組織化学によって視覚化することができる。野生型胚のモーター軸索突起パターンの複数の画像がウェブ5上で利用可能である。 1D4抗体は、胚性中枢神経系（CNS） 4の正中線の両側にすべての運動軸索および3つの縦軸索束を標識する</sup&gt; 、 6 （ 図1Cおよび図2A ）。したがって、FasII抗体による免疫組織化学は、運動軸索誘導および標的認識の根底にある分子メカニズムを実証するために、神経筋結合に必要な遺伝子を同定するための強力なツールを提供する。 腹部半分体A2~A7のそれぞれにおいて、運動軸索は、2つの主要な神経枝である分節神経（SN）および椎間板神経（ISN） 2,4 、および軽微な神経枝に選択的に束縛され、横断神経） 7 。 SNは選択的に脱皮して、SNaおよびSNcと呼ばれる2つの神経分枝を生じさせるが、ISNはISN、ISNbおよびISNdと呼ばれる3つの神経分枝に分裂する。その中でも、ISN、ISNb、およびSNaモーター軸索投射パターンは、後期ステージ16胚がFasII抗体で染色され、フィレット化されたときに最も正確に視覚化される（ 図1Cおよび図2A ）。 ISN運動ニューロンは、それらの軸索を背側筋肉1,2,3,4,9,10,11,18,19、および20,2,4（ 図2A ）に神経支配するように拡張する。 ISNb運動ニューロンは、腹外側筋6,7,12,13,14,28、および30,2,4（ 図2Aおよび2B）を支配する。 SNa神経枝は、側方筋肉5,8,21,22,23、および24,2,4（ 図2A ）を神経支配するように突出する。 2つの運動軸索からなるTNは、筋肉25を神経支配するための分節境界に沿って同側に突出しており、筋肉25の外側二極樹状突起ニューロン（LBD）とシナプスを形成する周辺部7 （ 図2A ）。これらの標的筋の神経支配は、特定の選択点において運動軸索の選択的脱毛皮化を必要とするだけでなく、筋肉の認識を標的とすることを必要とする。さらに、中間標的として作用するいくつかの推定中胚葉誘導ポスト細胞は、ISNおよびSNa経路の両方で見出されたが、ISNb経路4では見出されなかった。これは、ISNbモーター軸索経路探索が、ISNおよびSNaモーター軸索ガイダンスと比較して明確な様式で調節され得ることを示唆し、また、周辺モーター軸索ガイダンスが、単一のガイダンスキューの差異または保存された役割を研究する魅力的な実験モデル分子8 。 この研究は、ショウジョウバエの胚運動ニューロンの軸索突起パターンを視覚化するための標準的な方法を提示する。記載されたプロトコールは、1D4aで染色された固定胚を解剖する方法を含むフィブリル化調製物のために3,3&#39;-ジアミノベンジジン（DAB）で処理した。固定された胚の平らな調製物の1つの重大な利点は、周辺における軸索突起および筋肉パターンのより良好な視覚化である。さらに、この研究は、LacZ染色法を用いて所望の突然変異胚を選別するための固定された胚を遺伝子型決定する方法も示している。

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal Substrate</td><td>US Biological</td><td>X1000</td><td>X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244023</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>US Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Tricon Beaker</td><td>Simport</td><td>B700-100</td><td>This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Societe Industrielle Lesaffre</td><td>Saf Instant Yeast Red</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td><td>VWR</td><td>14220-263</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube (1.5 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>#72.690</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>The Clorox Company</td><td>Clorox</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FasciculinII Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4 anti-Fasciclin II</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-068</td><td>AffiniPure F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L)&lt;br/&gt; (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass</td><td>Duran Group</td><td>235501403</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Duran Group</td><td>235503104</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson Medical(s)</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Ted Pella</td><td>#27-11</td><td>Tungsten Wire, &amp;oslash;0.13mm/6.1m (&amp;oslash;.005&quot;/20 ft.)</td></tr><tr><td>Nutator (Mini twister)</td><td>Korean Science</td><td>KO.VS-96TWS</td><td>Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td></tr></tbody></table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

機能的な神経筋回路の確立は、運動軸索と標的筋肉の間の正確な接続に依存する。運動ニューロンは、周囲の細胞外環境から発する多数の軸索誘導手がかりに応答することによって、特定の経路に沿って移動する成長円錐を拡張する。成長円錐標的認識はまた、神経筋特異性において重要な役割を果たす。この研究は、後期段階16 ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学プロトコルを提示する。このプロトコールは、所望の突然変異胚を選別するための遺伝子型決定手順を含むいくつかの重要なステップを含む。ファシクリンII（FasII）抗体で胚にタグ付けするための免疫染色手順;固定された胚からフィレット調製物を生成するための解剖手順を含む。末梢のモーター軸索突起および筋肉パターンは、filleted embryosの平らな調製物では、whよりもはるかに良好に視覚化されるオレ - マウント胚。したがって、FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、モーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供し、機能喪失および機能獲得遺伝子スクリーンの両方に適用することもできる。

神経発達中の運動軸索と標的筋肉との間の正確な接続は、選択的軸索 - 軸索反発および特定の選択肢4での標的認識に依存する。 ショウジョウバエでは、運動軸索間の選択的反発は、Sema-1a、Sema-2a、およびSema-2b 8,14,15,16,17,18を含むクラス1と2のセマフォリン（Semas）の併用作用によって部分的に制御される。したがって、 Sema-1a機能の喪失は、しばしば特定の選択点で脱皮して異常に厚い形態を示すISNb軸索の欠損をもたらす（ 図2Cの矢頭）。野生型胚では、少なくとも7つの運動ニューロンが伸長し、それらの軸索を束ねてI型を形成するSNb神経分岐（ 図2A ）。 ISNb神経枝が筋肉6と7との間に位置する選択点に達すると、2つの軸索が主ISNb束から選択的に脱皮し、続いて筋肉6および7を神経支配する（ 図2B ）。筋肉6,13、および30の間に位置する次の選択点で、別の3つの運動軸索は選択的に脱皮して筋肉13,14および30を神経支配する（ 図2B ）。残りの2つの軸索は、筋肉12の縁の近くの最後の選択点に達するように背側に延び、それによって筋肉12を反対方向に支配する（ 図2B ）。これらの結果は、フィレット調製プロトコールが、運動軸索誘導に必要な遺伝子を研究するための有用なツールを提供することを明らかに示している。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig1.jpg" /> <strong&gt;図1：ISNおよびISNbモーター軸索の投影パターンに基づく胚の病期分類。 （ A ）後期第16段階の野生型胚では、A7、A8、およびA9 ISN神経（矢印）が互いに接触するように収束する（矢頭）。前部は残され、腹部は下になる。スケールバー=15μm。 （ B ）段階16中期野生型胚において、A7 ISN神経はA8 / A9神経（角括弧）と平行して伸びる。矢印は、A7、A8、およびA9 ISN神経を示す。前部は残され、腹部は下になる。スケールバー=15μm。 （ C ）FasII抗体で染色された後期段階16野生型胚の作製。左右のA6 ISNb神経の投影軸（矢印）は、CNS縦軸索束（黒線）の後端とほぼ整列している。腹部セグメントA1~A7は、上部にラベルが付けられている。前方が残る。スケールバー=15μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55830/55830fig1large.jpg" target="_blank">歓喜</a>この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig2.jpg" /> 図2：野生型およびSema-1a突然変異体胚におけるモーター軸索突起パターン。 （ A〜C ）FasII抗体で染色された後期段階16胚の調製を完了した。前部は残され、腹部は下になる。各パネルで表される軸索投影パターンを示す概略図。スケールバー=15μm。 （ A ）野生型胚における2つの連続した腹部半分、A3およびA4の明視野写真。 3つの左右対称縦軸索束がCNSに存在する。 ISNb、SNa、ISN、およびTNモータ軸索の正常な神経支配パターンは、ボックスおよび周辺の矢印によって示される。腹筋を神経支配する横方向双極性樹状突起ニューロン（LBD）は、矢頭で描かれている。模式図では、ISNb（茶色）、SNa（青色）、ISN（緑色）、TN（黄色）運動ニューロンおよびそれらの標的筋肉の神経分枝および神経支配パターンが示されている。 CNSにおけるこれらの運動ニューロンの細胞体の位置もまた、それら自身の色で示される。 （ B ）野生型胚では、ISNb軸索は、番号が付けられた腹側の筋肉に投射し、それらを特定の選択点（DIC画像の矢印）に神経支配する。 （ C ） Sema-1a機能喪失突然変異体では、ISNb軸索は、筋肉6と13の間で相互に脱皮しないことが多い（DIC画像中の矢頭）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55830/55830fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K ビュー.  Chonbuk National University. この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。 

ビデオ: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3の幼虫分節神経の可視化 RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

神経科学

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

の形態素解析ショウジョウバエ</em遺伝モザイクを使用>幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

発生生物学

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

の調製<em&gt;ショウジョウバエ</emための&gt;中央ニューロン<em&gt;その場で</em&gt;パッチクランプ

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60716/retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using'>Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)</a>This video demonstrates the method of retrograde labeling of Drosophila motor neurons using lipophilic dyes. The dye enters the axon, travels retrogradely, and labels the neurons green, allowing detailed visualization of their morphology and projections under a confocal microscope.

Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)This video ...

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化

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