Ich danke Alex L. Kolodkin, als ich dieses gefilmte Vorbereitungsprotokoll in seinem Labor gelernt habe. Ich danke auch Young Gi Hong für technische Unterstützung. Diese Studie wurde von NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ) unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung von 500 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) -Lösung durch Zugabe von 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5 ml t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (siehe Tabelle der Materialien) auf 500 ml 1X PBS Und Rühren für mindestens 30 min. Bei 4 ° C aufbewahren. Verwenden Sie, wenn relativ frisch und speichern Sie die Lösung in einer sauberen Flasche. </li><li> Mischen Sie 10 ml 4% Paraformaldehyd durch Zugabe von 2,5 ml einer 16% igen Stamm-Paraformaldehydlösung und 1 ml 10x PBS zu 6,5 ml entionisiertem Wasser. Bei 4 ° C aufbewahren und innerhalb einer Woche verwenden. ACHTUNG: Hautkontakt mit Paraformaldehyd-Lösung vermeiden, da es sehr giftig ist. </li><li> Mischen Sie X-Gal-Substrat (10% w / v X-Gal in Dimethylsulfoxid (DMSO)) durch Lösen von 0,1 g X-Gal-Substrat pro 1 ml DMSO. Bei -20 ° C in 100 μl Aliquoten lagern. </li><li> Mischen Sie X-Gal-Färbe-Lösung unter Verwendung von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 3 mMK 4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K 3 [FeIII (CN) 6 ] und 0,3% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol. Bei 4 ° C im Dunkeln aufbewahren. </li><li> Mischen Sie 3% Wasserstoffperoxidlösung durch Verdünnen von 30% Stamm Wasserstoffperoxid 1:10 mit deionisiertem Wasser. </li><li> Mischen Sie 3,3&#39;-Diaminobenzidin (DAB) -Lösung durch vollständiges Auflösen von 1 Tablette (10 mg) DAB in 35 ml frischer PBT-Lösung. Durch einen 0,2 μm-Spritzenfilter filtrieren und bei -20 ° C in 910 μl Aliquots lagern. ACHTUNG: Alle DAB-Abfälle in Bleichmittel entsorgen, um den DAB zu zerstören. </li><li> Eierteller mit Apfelsaft herstellen. Füge 35 g Agar und 1 l entionisiertes Wasser in einen 2 l-Kolben ein. Füge 33 g Saccharose, 2 g Tegosept und 375 ml Apfelsaft in einen 1- l-Kolben ein. Schmelzen Sie sie durch Autoklavieren für 30 min. Lassen Sie beide Lösungen auf ca. 60 ° C abkühlen. Kombinieren und mischen diese Lösungen gut durch Rühren. Gießen Sie 11 ml kombinierte Lösung pro 60 mm Kulturschale. </li><li> Machen Sie Hefepaste, indem Sie Bäcker schlagenSt in deionisiertes Wasser (Verhältnis 1: 0,8) und bei 4 ° C aufbewahren. </li></ol> 2. Embryo-Sammlung (Tag 1) <ol><li> Sammeln Sie junge weibliche und männliche Fliegen (jünger als 5 Tage) und halten Sie sie für 1-2 Tage in einem Plastikbecherkäfig mit einer Eiplatte (60 mm x 15 mm), die eine kleine Menge Hefepaste in der Mitte enthält. </li><li> Für die optimale Sammlung von Spätstadium-16 Embryonen, richten Sie einen Flaschenkäfig mit Fliegen (&gt; 50) gegen 17 Uhr auf und lassen Sie sie Eier bei 25 ° C für 3 h legen. </li><li> Übertragen Sie die Fliegen auf eine frische Flasche. </li><li> Schließen Sie die Eiplatte mit dem Deckel und inkubieren Sie sie bei 25 ° C in einem befeuchteten Inkubator (~ 70% Luftfeuchtigkeit) über Nacht. </li></ol> 3. Vorbereitung von Embryonen zur Immunfärbung (Tag 2) <ol><li> Füge 1,8 ml PBT-Lösung zur Eiplatte um 10:20 Uhr hinzu und verwende einen Wattestäbchen, um die Embryonen von der Platte zu lösen, während du sie kippst. Hinweis: Durch sanftes Maischen der Hefepaste mit einem CottAuf Tupfer, löst es auf, falls eine große Anzahl von Embryonen darauf gefunden wird. Beginne das Sammeln der Embryos ~ 40 Minuten vor der Fixierung (gegen 11:00 Uhr). </li><li> Übertragen Sie die Embryos aus der Eiplatte auf ein 1,5-ml-Mikroröhrchen mit einer 1-ml-Pipettenspitze. </li><li> Lassen Sie sich die Embryos so weit wie möglich absetzen und die PBT-Lösung aspirieren. Spülen Sie die Embryos zweimal mit 1 ml PBT-Lösung. Setzen Sie die PBT-Lösung so weit wie möglich ein. </li><li> Füllen Sie das Röhrchen mit 1 ml 50% igem Bleichmittel ( dh verdünnt in entionisiertem Wasser) und dechorionieren Sie die Embryos, indem Sie sie 3 min bei Raumtemperatur (RT) auf einen Nusskern inkubieren. Anmerkung: Dieser Schritt tötet nicht die dechorionierten Embryonen. </li><li> Lassen Sie die dechorionierten Embryos sich absetzen, aspirieren Sie die 50% ige Bleiche so weit wie möglich und spülen Sie die Embryos 3 mal mit 1 ml PBT-Lösung. </li><li> Fügen Sie 0,5 ml Heptan hinzu und fügen Sie anschließend ca. 11 ms 0,5 ml einer 4% igen Paraformaldehydlösung zu dem Röhrchen bei RT hinzu. </li><li> Inkubieren derEmbryos auf einem Nutator für 15 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die 4% Paraformaldehydlösung (die untere Schicht). </li><li> Fügen Sie 0,5 ml 100% Methanol hinzu und entzünden Sie die Embryos, indem Sie das Röhrchen 30 Minuten lang kräftig schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Heptane ( dh die obere Schicht). </li><li> Fügen Sie 0,5 ml 100% Methanol hinzu und schütteln Sie das Röhrchen für 10 s kräftig. </li><li> Lassen Sie die Embryos sich niederlassen, indem Sie das Röhrchen klopfen und das Methanol so weit wie möglich absaugen. Spülen Sie die Embryonen mit 1 ml 100% Methanol, Schütteln für weniger als 10 s. Anmerkung: Ausgedehnte Exposition gegenüber Methanol zerstört die β-Gal-Aktivität. </li><li> Das Methanol entfernen und die devitellinisierten Embryos 3 mal mit 1 ml PBT-Lösung abspülen. </li></ol> 4. Genotypisierung der Embryonen mit LacZ-Färbung (Tag 2) <ol><li> Füge 1 ml PBT-Lösung dem Röhrchen zu und inkubiere das Röhrchen in einem 37 ° C Hitzestrom oder Wasserbad für 15 min. </li><li> Während der Inkubation wird die X-Gal-Färbelösung (1 ml pro TuWerden bei 65 ° C in einem Wasserbad, bis es bewölkt wird. Inkubieren Sie es in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Die PBT-Lösung einatmen und 1 ml X-Gal-Färbelösung und 20 &amp; mgr; l X-Gal-Substrat zu dem Röhrchen geben. </li><li> Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 ° C mit Nutation, bis ein blauer Niederschlag offensichtlich ist. Hinweis: Die Inkubationszeit für die 2. und 3. Blue Balancer im Allgemeinen reicht von 2-4 h. </li><li> Die X-Gal-Färbe-Lösung entfernen und die Embryos dreimal mit 1 ml RT-PBT-Lösung spülen. </li><li> Mit einer Nadelsonde oder Pinzette, sortieren Sie die Embryonen des gewünschten Genotyps ( dh nicht gebeizte weiße Embryos) mit einem leichten Seziermikroskop (1.6X-2.5X-Ziele). Anmerkung: Da einige blaue Balancer wie CyO, Actin-LacZ und TM3, Actin-LacZ , ein transgenes Konstrukt tragen, das unter der Kontrolle des Aktin-Promotors bakterielles β-Gal (LacZ) exprimiert, enthalten Embryos, die in einer ubiquitären Weise blau gefärbt sindEin oder zwei Kopien von Blue Balancer Chromosomen. Daher sind nicht gefärbte weiße Embryos für das gewünschte tödliche Allel homozygot. </li></ol> 5. Immunfärbung von Embryonen mit Anti-Fasciclin II-Antikörpern (Tag 2-3) <ol><li> Sammeln und übertragen die Embryos des gewünschten Genotyps ( dh nicht gefärbten weißen Embryos) zu einem 0,5 ml-Mikroröhrchen unter Verwendung einer 1 ml-Pipettenspitze. Anmerkung: In diesem Schritt können die Embryos nach morphologischen Kriterien grob inszeniert werden, einschließlich der Segmentierungsmuster der Nagelhaut und der Strukturen von Kopf und Schwanz 9 . Während der Kopfinvasion, zwischen 10 und 16 h nach dem Verlegen der Eier, erfährt der Embryo eine ausgeprägte Reduktion des vordersten Segments 9 . </li><li> Die Embryos einmal mit 0,4 ml PBT-Lösung waschen und 0,3 ml Blockierungslösung (5% normales Ziegenserum und 5% DMSO in PBT-Lösung) zugeben. </li><li> Blockiere die Embryos mit Nutation bei RT für 15 min. </li><li&gt; 75 μl Anti-Fasciclin II-Antikörper zugeben und das Röhrchen bei RT über Nacht mit Nussation inkubieren. </li><li> Die Embryonen 4 mal mit 0,4 ml PBT-Lösung für mindestens 20 min pro Waschung waschen. </li><li> Füge 0,3 mL Blockierungslösung (5% normales Ziegenserum in PBT-Lösung) mit Ziegen-anti-Maus-HRP-Antikörper (2 μg / ml) hinzu und inkubiere das Röhrchen mit Nussation bei RT über Nacht. </li><li> Die Embryos 6 mal mit 0,4 ml PBT-Lösung für mindestens 20 min pro Waschung waschen. </li><li> Füge 0,3 ml DAB-Lösung dem Röhrchen hinzu. ACHTUNG: Handschuhe tragen und alle DAB-Abfälle / Röhrchen / Spitzen in Bleichmittel stellen. </li><li> Man gibt 2 μl 3% iges Wasserstoffperoxid zu und inkubiert das Röhrchen im Dunkeln mit Nutation bei RT, bis die gewünschte Menge an Niederschlag entsteht. Anmerkung: Die Inkubationszeit für 1D4 Immunhistochemie im Allgemeinen reicht von 0,5-1 h. </li><li> Die Embryos 4 mal mit 0,4 ml PBT-Lösung waschen. ACHTUNG: Entfernen Sie die DAB-Lösung und die ersten beiden Wäschen mit einer Pipette und diSchmeißt sie in Bleiche. </li><li> Füge 0,2 ml der 70% igen Glycerin / PBS-Lösung in das Röhrchen ein und lag bei RT oder 4 ° C auf. Hinweis: Halten Sie den Schlauch von Licht fern. Klarere Präparate können erhalten werden, indem die Embryonen in eine 90% ige Glycerin / PBS-Lösung 10 gegeben werden . Jedoch ist es schwieriger, Embryonen, die in 90% Glycerin / PBS-Lösung freigesetzt wurden, zu sezieren, als die, die in 70% Glycerin / PBS-Lösung 10 freigesetzt wurden. </li></ol> 6. Inszenierung, Dissektion, Montage und Bildgebung der Embryonen (Tag 4) <ol><li> Zur Inszenierung die mit 70% Glycerin / PBS äquilibrierten Embryonen auf einen Glasrutsche übertragen. </li><li> Sammeln Sie späte Stadium-16 Embryonen, die Bauchsegment 7 (A7), A8 und A9 ISN Nerven konvergieren, um einander zu berühren oder / und haben midgut, die in drei Banden unterteilt ist. Hinweis: Embryos, die mit 1D4-Antikörper gefärbt sind, können auf der Grundlage der Projektionsmuster von ISN- und ISNb-Motoraxonen inszeniert werden. Nach dem Verlassen des ZNS, A7, A8 und A9 ISN neRs der späten Stadium-16 Embryonen konvergieren, um einander zu berühren und anschließend divergieren, um weit hinaus zu den dorsalen Muskeln (Pfeilspitze in Abbildung 1A ) zu verlängern. In der Mitte der Stufe-16 Embryonen, aber A7 ISN Nerven erstrecken sich parallel zu A8 / A9 Nerven (eckige Klammer in Abbildung 1B ). Darüber hinaus sind die Projektionsachsen der A6 ISNb-Nerven (senkrecht zu den ventrolateralen Muskeln) in beiden Hämisenteilen grob mit dem hinteren Ende der ZNS-Längsaxon-Faszikel (Pfeile und einer Linie in Abbildung 1C ) ausgerichtet. Diese morphologischen Kriterien variieren etwas zwischen verschiedenen Genotypen. Alternativ können Embryonen auf der Grundlage der Darmmorphologie 9 , 11 inszeniert werden . Vor der Stufe 17 hat der Midgut eine herzförmige Form, während der Midgut nach Stufe 17 12 in drei Banden unterteilt ist. </li><li> Zerschneiden die Embryonen. <ol><li> Mit einer 1 mL-Spritze, bewegen Sie jeden Embryo aus dem Glycerin-Tropfen und legen Sie den Embryo ventral-Gesicht nach oben. Schneide den vorderen Teil bei 1/4 der Körperlänge und dem hintersten Bereich ab, der frei von Motoraxonen ist. </li><li> Mit einem Nadel-Sonde, verschieben Sie den End-Cut-Embryo aus dem Glycerin-Drop, rollen, um es dorsal-side nach oben zu orientieren, und legen Sie es horizontal auf dem Feld. Anmerkung: Wenn der Embryo aus dem Glycerintropfen herausgezogen wird, macht ein bisschen Glycerin, das mit dem Embryo assoziiert ist, es klebrig. </li><li> Schneiden Sie den Embryo entlang der dorsalen Mittellinie mit einer einzigen sehr feinen Wolframnadel 13 . Machen Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des Embryos und dann weiter, um die dorsale Mittellinie in Richtung der vorderen zu reduzieren; Schneiden in die entgegengesetzte richtung ist auch gut </li><li> Mit einem Nadelsonden den Mittellinie-Embryo in den Glycerin-Tropfen verwandeln, ihn dorsal nach oben stellen und den Darm von der Körperwand lösen, indem er jede Körperwand in einer ventrolateralen (diagonalen) Richtung entfaltet (2.5X Ziel). Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die dorsale Mittellinie vollständig geschnitten ist, was zu einer vollständigen Trennung zwischen den linken und rechten Körperwänden führt. </li><li> Ziehen Sie den Mittellinien-Embryo vorsichtig aus dem Glycerin-Tropfen und legen Sie dann mit einer feinen Nadelsonde (2.5X-Objektiv) zwei Klappen der Körperwand auf den Glasschieber. </li><li> Mit einer sehr feinen Wolframnadel, entfernen Sie die inneren Organe aus dem sezierten Embryo, indem Sie sie seitlich (5X Objektiv) drücken. Anmerkung: Eine ausführlichere Beschreibung eines anderen ähnlichen Dissektionsprozesses finden Sie auf der Website 5 . </li></ol></li><li> Zur Montage fügen Sie 2-3 μl 70% ige Glycerin / PBS-Lösung zum Reinigen, Sezieren von Embryonen und überführen sie mit einer feinen Nadelsonde auf einen neuen Glasschieber, auf den 8 μl 70% Glycerin / PBS-Lösung verteilt wurden Das Zentrum (2.5X Ziel). </li><li> Setzen Sie auf ein Deckglas (18 mm x 18 mm). Die Kanten des Deckglases mit regelmässigem Nagellack abdichten (entwederKlar oder farbig ist gut). </li><li> Erfassen Sie Bilder mit hoher Auflösung (20X, 40X und 63X Öl-Immersions-Objektiven) unter einem DIC-Lichtmikroskop (Differential Interference contrast) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Eine bessere Visualisierung und phänotypische Charakterisierung, insbesondere für ISNb-Motoraxone, können mit einem 63X-Öl-Immersions-Objektiv hergestellt werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+larval+muscles+in+Drosophila.">The embryonic development of larval muscles in Drosophila.</a> Development. 110 (3), 791-804 (1990).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67 (1), 45-57 (1991).</li><li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila.">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).</li><li>. Available from: <a target="_blank" href="https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html">https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html</a> (2017)</li><li>Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+genes+necessary+for+guidance+toward+or+away+from+the+midline.">Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline.</a> Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).</li><li>Thor, S., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+islet+gene+governs+axon+pathfinding+and+neurotransmitter+identity.">The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity.</a> Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).</li><li>Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ligand+regulation+of+PlexB+signaling+in+motor+neuron+axon+guidance+in+Drosophila.">Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole+mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+dissection+of+Drosophila+embryos:+streamlined+methods+for+screening+mutant+collections+by+antibody+staining.">Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining.</a> J. Vis. Exp. (34), (2009).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasciclin+IV:+sequence,+expression,+and+function+during+growth+cone+guidance+in+the+grasshopper+embryo.">Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo.</a> Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).</li><li>Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+semaphorin-1a-mediated+reverse+signaling+by+opposing+pebble+and+RhoGAPp190+functions+in+Drosophila.">The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila.</a> Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).</li><li>Winberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin+A+is+a+neuronal+semaphorin+receptor+that+controls+axon+guidance.">Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance.</a> Cell. 95 (7), 903-916 (1998).</li><li>Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+guidance+function+of+Rap1+small+GTPase+is+independent+of+PlexA+RasGAP+activity+in+Drosophila.">The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila.</a> Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).</li><li>Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+Semaphorin+Sema+I+is+required+in+Drosophila+for+embryonic+motor+and+CNS+axon+guidance.">The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance.</a> Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Kidd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roundabout+controls+axon+crossing+of+the+CNS+midline+and+defines+a+novel+subfamily+of+evolutionarily+conserved+guidance+receptors.">Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors.</a> Cell. 92 (2), 205-215 (1998).</li><li>Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+neural+circuits+into+shape+with+semaphorins.">Getting neural circuits into shape with semaphorins.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).</li></ol>

Der Autor erklärt, dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Die Details der Motor-Axon-Führungsdefekte werden durch die gefilterte Vorbereitung von DAB-gefärbten Embryonen schneller und mit besserer Genauigkeit erzielt als durch eine konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Laserscanning. Daher eignet sich die filtrierte Präparation von fixierten und 1D4-gefärbten Embryonen am besten für die funktionelle Charakterisierung von Guidance Cue Molekülen. Vier Hauptklassen von Leitlinien, darunter Netrine, Schlitze, Semaphorine (Semas) und Ephrine, und ihre verwandten Rezeptoren haben evolutionär Rollen über Würmer, Fliegen und Wirbeltiere konserviert 20 . Unter den Kreisel- (Robo-) Familienmolekülen, die als Rezeptoren für Schlitze wirken, wurde Drosophila Robo zuerst identifiziert, um eine abstoßende Führungsfunktion im ZNS 6 , 21 zu vermitteln. Semas sind eine große Familie von Leitmolekülen, die an Plexin-haltige Rezeptorkomplexe 22 binden. Die Axonführungsfunktion von SemasWurde zuerst in der Heuschrecke ZNS 14 entdeckt. Anschließend wurde das Transmembran-Semaphorin Sema-1a der Klasse 1 in Drosophila weitgehend charakterisiert . Sema-1a, das nicht nur als Ligand für Plexin A, sondern auch als Rezeptor für einen unbekannten Liganden fungiert, spielt bei der axon-axon-Abstoßung bei bestimmten Wahlpunkten während der embryonalen neuronalen Entwicklung eine wichtige Rolle 15 , 16 , 17 , 18 ( Fig. 2C ). Es gibt einige gängige Fehlerbehebungsschritte, die mit dem aktuellen Protokoll auftreten können. Zuerst können in den Schritten 3.9-3.13 die Embryonen mit geringem Wirkungsgrad devitellinisiert werden, wenn zu viele oder zu kleine Embryonen im Methanol-Devitellinierungsverfahren eingesetzt werden. In diesem Fall empfiehlt es sich, ein Bettvolumen von 40-80 μl fester Embryonen zur Devitellinisierung in Schritt 3.5 zu verwenden. Zweitens in stePs 3.9-3.13 kann eine schwache X-Gal-Färbung im Falle einer längeren Exposition gegenüber Methanol oder einer unvollständigen Heptanentfernung auftreten, da Methanol, das als Fixiermittel verwendet wird, die β-Gal-Aktivität zerstört. In diesem Fall ist es am besten, dass das Devitellinierungsverfahren mit Methanol in den Schritten 3.9-3.13 so schnell wie möglich durchgeführt wird. Darüber hinaus kann Restheptan, das in Methanol solubilisiert wird, die Färbung stören; Daher ist es am besten, so viel Methanol wie möglich in den Schritten 3.11-3.13 zu entfernen. Das gegenwärtig gefilterte Vorbereitungsprotokoll kann auf Funktionsverlust-Funktions- und Gain-of-Function-Gen-Screenes angewendet werden, um neuartige Gene zu identifizieren, die an der motorischen Axon-Pfadfindung und der Zielerkennung beteiligt sind. Ein Nachteil dieses Protokolls ist jedoch, dass es ziemlich zeitaufwändig ist, feste Embryos zu sezieren, um gefilterte Präparate zu erzeugen. Um dieses Problem zu überwinden, kann die phänotypische Charakterisierung der axonalen Projektionen in einer ganzheitlichen Vorbereitung von 1D4-gefärbten embRyos, obwohl diese Methode eine aufeinanderfolgende Visualisierung der axonalen Projektionen in der Peripherie ermöglicht. Dennoch hat sich das gesamte Vorbereitungsprotokoll als ein effizienter Ansatz für das Screening von Axonführungsgenen erwiesen 4 . Ein alternatives Protokoll unter Verwendung der lebenden Dissektion von fluoreszenzmarkierten Embryonen wurde vor kurzem für systematische Screening 11 entwickelt. Das lebende Dissektionsprotokoll ermöglicht eine relativ schnelle Vorbereitung der phänotypischen Analyse 11 . Allerdings ist dieses Protokoll für Embryonen, die älter als der Anfang der Stufe 17 sind, nicht ausreichend. Das hier beschriebene Filament-Präparations-Protokoll kann verwendet werden, um Protein-Expressionsmuster mit verschiedenen Antikörpern zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch auf Drosophila Embryonen in verschiedenen Stadien der Entwicklung angewendet werden.

Präzise und selektive Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der embryonalen Entwicklung sind für die normale Fortbewegung in Drosophila- Larven essentiell . Die embryonale Strukturierung von 30 Muskelfasern in jedem der Bauchhöhenselemente A2-A7 wird nach Stufe 16 1 hergestellt. Die 36 motorischen Neuronen, die im ventralen Nervenkabel erzeugt werden, verlängern ihre Axone in die Peripherie, um spezifische Zielmuskeln zu innervieren 2 . Die motorische Axonpfadfindung und die Zielerkennung können durch Immunhistochemie mit einem Antikörper (Mausmonoklonaler Antikörper 1D4) 3 , 4 sichtbar gemacht werden. Mehrere Bilder der motorischen Axonprojektionsmuster in Wildtyp Embryonen sind auf der Bahn 5 verfügbar. Der 1D4-Antikörper markiert alle motorischen Axone und drei Längsaxon-Faszikel auf jeder Seite der Mittellinie des embryonalen Zentralnervensystems (ZNS) 4 </sUp&gt; , 6 ( Abbildung 1C und Abbildung 2A ). Daher bietet die Immunhistochemie mit FasII-Antikörper ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von Genen, die für die neuromuskuläre Konnektivität erforderlich sind, um die molekularen Mechanismen zu demonstrieren, die der motorischen Axon-Anleitung und der Zielerkennung zugrunde liegen. In jedem der Bauchhöhenselemente A2-A7 projizieren motorische Axone und selektiv in zwei Hauptnervenzweige, den Segmentnerv (SN) und den intersegmentalen Nerv (ISN) 2 , 4 und einen kleinen Nervenzweig, den Quernerv (TN ) 7 . Die SN selektiv defasciculiert, um zwei Nervenzweige zu nennen, die SNa und SNc genannt werden, während die ISN in drei Nervenzweige, die so genannten ISN, ISNb und ISNd 2 , 4 , aufgeteilt werden. Unter ihnen, ISN, ISNb und SNa MotoraxonDie Projektionsmuster werden am genauesten sichtbar gemacht, wenn Spitzstadium-16-Embryos mit FasII-Antikörper gefärbt werden und filtriert werden (Abbildung 1C und Abbildung 2A ). Die ISN-Motorneuronen verlängern ihre Axone, um die Dorsalmuskeln 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 und 20 2 , 4 zu innervieren ( Fig. 2A ). Die ISNb-Motorneuronen innervieren die ventrolateralen Muskeln 6, 7, 12, 13, 14, 28 und 30 2 , 4 ( 2A und 2B). Der SNa-Nerven-Zweig projiziert, um die Seitenmuskeln 5, 8, 21, 22, 23 und 24 2 , 4 zu innervieren ( Fig. 2A ). Die TN, die aus zwei motorischen Axonen besteht, projiziert ipsilateral entlang der segmentalen Grenze, um den Muskel 25 zu innervieren und macht Synapsen mit dem lateralen bipolaren dendritischen Neuron (LBD) in derPeripherie 7 (Abbildung 2A ). Diese Zielmuskelinnervationen erfordern nicht nur die selektive Defaskik von motorischen Axonen an bestimmten Wahlpunkten, sondern auch die Zielmuskelerkennung. Darüber hinaus wurden einige mutmaßliche mesodermale Guidepost-Zellen, die als Zwischenziele fungieren, sowohl in den ISN- als auch in den SNa-Wegen gefunden, aber nicht entlang des ISNb-Weges 4 . Dies könnte darauf hindeuten, dass die ISNb-Motor-Axon-Pfadfindung im Vergleich zu der ISN- und SNa-Motor-Axon-Führung in einer bestimmten Weise reguliert werden kann, und es zeigt auch an, dass die periphere Motor-Axon-Führung ein attraktives experimentelles Modell bietet, um die Differential- oder konservierten Rollen eines einzelnen Leitfadens zu untersuchen Molekül 8 Diese Arbeit stellt eine Standardmethode dar, um die axonalen Projektionsmuster der embryonalen motorischen Neuronen in Drosophila zu visualisieren . Die beschriebenen Protokolle beinhalten, wie man feste Embryonen, die mit 1D4 a gefärbt sind, seziertNtibody und verarbeitet in 3,3&#39;-Diaminobenzidin (DAB) für filtrierte Zubereitungen. Ein kritischer Vorteil der flachen Präparate von festen Embryonen ist die bessere Visualisierung der axonalen Projektionen und Muskelmuster in der Peripherie. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit auch, wie man feste Embryonen genotypisiert, um die gewünschten mutanten Embryos nach der LacZ-Färbemethode zu sortieren.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal Substrate</td><td>US Biological</td><td>X1000</td><td>X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244023</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>US Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Tricon Beaker</td><td>Simport</td><td>B700-100</td><td>This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Societe Industrielle Lesaffre</td><td>Saf Instant Yeast Red</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td><td>VWR</td><td>14220-263</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube (1.5 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>#72.690</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>The Clorox Company</td><td>Clorox</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FasciculinII Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4 anti-Fasciclin II</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-068</td><td>AffiniPure F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L)&lt;br/&gt; (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass</td><td>Duran Group</td><td>235501403</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Duran Group</td><td>235503104</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson Medical(s)</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Ted Pella</td><td>#27-11</td><td>Tungsten Wire, &amp;oslash;0.13mm/6.1m (&amp;oslash;.005&quot;/20 ft.)</td></tr><tr><td>Nutator (Mini twister)</td><td>Korean Science</td><td>KO.VS-96TWS</td><td>Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td></tr></tbody></table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

Die Etablierung funktioneller neuromuskulärer Schaltkreise beruht auf präzisen Verbindungen zwischen der Entwicklung von Motoraxonen und Zielmuskeln. Motorneuronen erweitern die Wachstumskegel, um auf bestimmten Wegen zu navigieren, indem sie auf eine große Anzahl von Axon-Guidance-Cues reagieren, die von der umgebenden extrazellulären Umgebung ausgehen. Die Wachstumskegel-Ziel-Erkennung spielt auch eine entscheidende Rolle bei der neuromuskulären Spezifität. Diese Arbeit stellt ein Standard-Immunhistochemie-Protokoll dar, um motorische Neuronprojektionen von späten Stadium-16 Drosophila melanogaster Embryonen zu visualisieren . Dieses Protokoll enthält einige wichtige Schritte, einschließlich eines Genotypisierungsverfahrens, um die gewünschten mutanten Embryonen zu sortieren; Ein Immunfärbeverfahren, um Embryonen mit Fasciclin II (FasII) Antikörper zu markieren; Und ein Dissektionsverfahren, um gefilterte Präparate aus festen Embryonen zu erzeugen. Motor-Axon-Projektionen und Muskelmuster in der Peripherie sind viel besser in flachen Präparationen von filtrierten Embryonen sichtbar als in whOle-Mount Embryonen Daher bietet die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt sind, ein mächtiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pfadfindung und die Zielerkennung erforderlich sind, und sie können auch sowohl auf die Funktionsstörungen als auch auf die Funktionsgenauigkeits-Gattungsbildschirme angewendet werden .

Präzise Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der neuronalen Entwicklung hängen von der selektiven Axonaxonabstoßung und der Zielerkennung an bestimmten Wahlpunkten ab 4 . In Drosophila wird die selektive Abstoßung zwischen motorischen Axonen teilweise durch die kombinierte Wirkung von Klasse 1 und 2 Semaphorinen (Semas), einschließlich Sema-1a, Sema-2a und Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 reguliert . Daher führt der Verlust der Sema-1a- Funktion häufig zum Ausfall von ISNb-Axonen, um an bestimmten Wahlpunkten defascikulieren zu können, wodurch sie eine ungewöhnlich dicke Morphologie (Pfeilspitze in 2C ) zeigen. Bei Wildtyp-Embryonen verlängern und faszinieren mindestens 7 motorische Neuronen ihre Axone, um ein I zu bildenSNb-Nerven-Ast (Abbildung 2A ). Wenn der ISNb-Nervenzweig einen Wahlpunkt erreicht, der sich zwischen den Muskeln 6 und 7 befindet, werden zwei Axone selektiv vom Haupt-ISNb-Bündel defascikulieren und anschließend die Muskeln 6 und 7 innervieren (Abbildung 2B ). Am nächsten Wahlpunkt, der sich zwischen den Muskeln 6, 13 und 30 befindet, werden weitere drei Motoraxone selektiv entvasfizieren, um die Muskeln 13, 14 und 30 zu innervieren ( Fig. 2B ). Die verbleibenden zwei Axone erstrecken sich dorsal, um den letzten Wahlpunkt nahe dem Rand des Muskels 12 zu erreichen, wodurch der Muskel 12 in der entgegengesetzten Richtung innerviert wird ( Fig. 2B ). Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass das gefilterte Präparations-Protokoll ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Gene bietet, die für die motorische Axon-Führung erforderlich sind. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig1.jpg" /> <strOng&gt; Abbildung 1: Inszenierung von Embryonen basierend auf den Projektionsmustern von ISN- und ISNb-Motoraxonen. ( A ) In späten Stadium-16 Wildtyp Embryonen, A7, A8 und A9 ISN Nerven (Pfeile) konvergieren, um einander zu berühren (Pfeilspitze). Anterior ist links und ventral ist unten. Der Maßstab = 15 μm. ( B ) In mittleren Stadium-16 Wildtyp-Embryonen erstreckt sich der A7-ISN-Nerv parallel zu A8 / A9-Nerven (eckige Klammer). Pfeile zeigen A7-, A8- und A9-ISN-Nerven an. Anterior ist links und ventral ist unten. Der Maßstab = 15 μm. ( C ) Filetierte Präparation von späten Stadium-16 Wildtyp-Embryonen, gefärbt mit FasII-Antikörper. Die Projektionsachsen (Pfeile) der linken und rechten A6 ISNb-Nerven sind grob mit dem hinteren Ende der ZNS-Längsaxon-Faszikel (schwarze Linie) ausgerichtet. Die Abdominalsegmente A1-A7 sind oben markiert. Anterior ist übrig. Der Maßstab = 15 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55830/55830fig1large.jpg" target="_blank">Plädoyer</a>Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig2.jpg" /> Abbildung 2: Motoraxonprojektionsmuster in Wildtyp- und Sema-1a- Mutantenembryonen. ( A - C ) Filetierte Präparation von späten Stadium-16 Embryonen, gefärbt mit FasII-Antikörper. Anterior ist links und ventral ist unten. Schematische Diagramme, die die in jedem Panel dargestellten axonalen Projektionsmuster zeigen. Die Maßstäbe = 15 μm. ( A ) Eine helle Feldphotographie von zwei aufeinanderfolgenden Bauchhöhen, A3 und A4, in Wildtyp-Embryonen. Drei zweiseitig symmetrische Längsaxonbündel sind im ZNS vorhanden. Die normalen Innervationsmuster von ISNb-, SNa-, ISN- und TN-Motoraxonen werden durch die Boxen und einen Pfeil in der Peripherie angezeigt. Das laterale bipolare Dendritneuron (LBD), das die Alary-Muskeln innerviert, ist indikativDurch eine Pfeilspitze. In der schematischen Darstellung werden die Nervenverzweigungen und Innervationsmuster des ISNb (in braun), SNa (in blau), ISN (in grün) und TN (in gelb) motorischen Neuronen und deren Zielmuskeln dargestellt. Die Zellenkörperpositionen dieser motorischen Neuronen im ZNS werden auch in ihren eigenen Farben gezeigt. ( B ) Bei Wildtyp-Embryonen projizieren die ISNb-Axone die ventrolateralen Muskeln, die nummeriert sind, und innervieren sie an bestimmten Auswahlpunkten (Pfeile im DIC-Bild). ( C ) In Sema-1a- Verlust-of-Function-Mutanten, ISNb-Axone häufig nicht defascikulieren von einander zwischen Muskeln 6 und 13 (Pfeilspitze im DIC-Bild). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55830/55830fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila at JoVE.com

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K Aufrufe.  Chonbuk National University.  Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind. 

Serie: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Entwicklungsbiologie

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

Herstellung<em&gt; Drosophila</em&gt; Central Neuronen<em&gt; In situ</em&gt; Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Drosophila Bein Motoneuronen Axone durch die Erwachsenen Nagelhaut zu visualisieren

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60716/retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using'>Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)</a>This video demonstrates the method of retrograde labeling of Drosophila motor neurons using lipophilic dyes. The dye enters the axon, travels retrogradely, and labels the neurons green, allowing detailed visualization of their morphology and projections under a confocal microscope.

Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)This video ...

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3^Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen