Name: visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila
Uploaded: 2017-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
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Agradezco a Alex L. Kolodkin, ya que aprendí este protocolo de preparación en filetes en su laboratorio. También doy las gracias al joven Gi Hong por su asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).

1. Preparación <ol><li> Preparar 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con solución de t-octilfenoxipolietoxietanol (PBT) mediante la adición de 0,5 g de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,5 ml de t-octilfenoxipolietoxietanol (véase la Tabla de Materiales) a 500 ml de PBS 1X Y agitando durante al menos 30 min. Almacenar a 4 ° C. Utilice cuando sea relativamente fresco y guarde la solución en una botella limpia. </li><li> Hacer 10 ml de paraformaldehído al 4% mediante la adición de 2,5 ml de una solución de paraformaldehído de reserva al 16% y 1 ml de PBS 10x a 6,5 ​​ml de agua desionizada. Almacenar a 4 ° C y utilizar en una semana. PRECAUCIÓN: Evite el contacto de la piel con la solución de paraformaldehído porque es altamente tóxico. </li><li> Hacer el sustrato X-Gal (X-Gal al 10% p / v en dimetilsulfóxido (DMSO)) disolviendo 0,1 g de sustrato X-Gal por 1 ml de DMSO. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 100 μl. </li><li> Hacer la solución de tinción X-Gal usando tampón fosfato 10 mM (pH 7,2), NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, 3 mMK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ] y 0,3% de t-octilfenoxipolietoxietanol. Conservar a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Hacer una solución de peróxido de hidrógeno al 3% diluyendo al 30% de agua oxigenada 1:10 con agua desionizada. </li><li> Hacer una solución de 3,3&#39;-diaminobencidina (DAB) disolviendo completamente 1 comprimido (10 mg) de DAB en 35 ml de solución PBT fresca. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm y almacenar a -20 ° C en alícuotas de 910 μl. PRECAUCIÓN: Deseche todos los residuos DAB en lejía para destruir el DAB. </li><li> Hacer placas de huevo con jugo de manzana. Añadir 35 g de agar y 1 L de agua desionizada a un matraz de 2 l. Añadir 33 g de sacarosa, 2 g de tegosept y 375 ml de jugo de manzana a un matraz de 1 l. Derretirlos en autoclave durante 30 min. Deje que las dos soluciones se enfríen a unos 60 ° C. Combinar y mezclar bien estas soluciones con agitación. Vierta ~ 11 ml de solución combinada por plato de cultivo de 60 mm. </li><li> Haga la pasta de la levadura mezclando el panadero síSt en agua desionizada (proporción 1: 0.8) y almacenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Colección de embriones (día 1) <ol><li> Recoger las moscas jóvenes y las moscas macho (menores de 5 días), y durante 1-2 días, mantenerlas en una jaula de plástico con una placa de huevo (60 mm x 15 mm) que contiene una pequeña cantidad de pasta de levadura en el centro. </li><li> Para la recolección óptima de los embriones de la fase tardía-16, establecer una jaula de botellas con moscas (&gt; 50) alrededor de las 5 PM y dejar que los huevos a 25 ° C durante 3 h. </li><li> Transferir las moscas a una botella de comida fresca. </li><li> Cerrar la placa de huevo con la tapa e incubarla al revés a 25 ° C en una incubadora humidificada (~ 70% de humedad) durante la noche. </li></ol> 3. Preparación de embriones para inmunotinción (día 2) <ol><li> Añadir 1,8 mL de solución de PBT a la placa de huevo alrededor de 10:20 AM y utilizar un hisopo de algodón para aflojar los embriones de la placa mientras que la inclinación. Nota: Al macerar suavemente la pasta de levadura usando un cottEn un hisopo, disolverlo en caso de que se encuentre un gran número de embriones. Comience a recoger los embriones ~ 40 minutos antes de la fijación (alrededor de las 11:00 AM). </li><li> Transferir los embriones de la placa de huevo a un microtubo de 1,5 ml utilizando una punta de pipeta de 1 ml. </li><li> Permita que los embriones se establezcan y aspiren la solución de PBT lo más posible. Enjuague los embriones dos veces con 1 mL de solución de PBT. Aspirar la solución PBT lo más posible. </li><li> Llenar el tubo con 1 ml de lejía al 50% (diluido en agua desionizada) y decolorar los embriones incubándolos en un nutator durante 3 min a temperatura ambiente (RT). Nota: Este paso no mata a los embriones dechorionated. </li><li> Deje que los embriones dechorionated para establecerse, aspirar el blanqueador al 50% tanto como sea posible, y enjuague los embriones 3 veces con 1 mL de solución de PBT. </li><li> Añadir 0,5 ml de heptano y posteriormente añadir 0,5 ml de solución de paraformaldehído al 4% al tubo a la TA a las 11:00 horas aproximadamente. </li><li> Incubar elEmbriones en un nutator durante 15 min a RT. </li><li> Eliminar la solución de paraformaldehído al 4% (la capa inferior). </li><li> Añadir 0,5 ml de metanol al 100% y devitellinar los embriones agitando vigorosamente el tubo durante 30 s. </li><li> Retire el heptano ( es decir, la capa superior). </li><li> Añadir 0,5 ml de metanol al 100% y agitar vigorosamente el tubo durante 10 s. </li><li> Permita que los embriones se establezcan golpeando ligeramente el tubo y aspirando el metanol lo más posible. Enjuague los embriones con 1 ml de metanol al 100%, agitando durante menos de 10 s. Nota: La exposición prolongada al metanol destruye la actividad β-Gal. </li><li> Retire el metanol y enjuague los embriones devitellinizados 3 veces con 1 mL de solución de PBT. </li></ol> 4. Genotipificación de los embriones mediante tinción LacZ (día 2) <ol><li> Añadir 1 ml de solución de PBT al tubo e incubar el tubo en un bloque de calor a 37 ° C o un baño de agua durante 15 min. </li><li> Durante la incubación, coloque la solución de tinción X-Gal (1 ml por tuBe) a 65 ° C en un baño de agua hasta que se enturbia. Incubar en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Aspirar la solución PBT y añadir 1 ml de solución de tinción X-Gal y 20 μL de sustrato X-Gal al tubo. </li><li> Incubar el tubo a 37 ° C con nutación hasta que un precipitado azul es evidente. Nota: El tiempo de incubación de los equilibradores azules 2º y 3º en general oscila entre 2 y 4 h. </li><li> Quitar la solución de tinción X-Gal y enjuagar los embriones 3 veces con 1 mL de RT solución PBT. </li><li> Usando una sonda de aguja o fórceps, clasifique a mano los embriones del genotipo deseado ( es decir, embriones blancos no teñidos) con un microscopio de disección (objetivos 1.6X-2.5X). Nota: Dado que algunos equilibradores azules, como CyO, actina-LacZ y TM3, actina-LacZ , llevan una construcción transgénica que expresa β-Gal (LacZ) bacteriana bajo el control del promotor de actina , los embriones manchados de azul en forma omnipresente contienenUna o dos copias de los cromosomas azul equilibrador. Por lo tanto, los embriones blancos no teñidos son homocigóticos para el alelo letal deseado. </li></ol> 5. Inmunocoloración de embriones con anticuerpos anti-Fasciclin II (día 2-3) <ol><li> Recoger y transferir los embriones del genotipo deseado ( es decir, embriones blancos no teñidos) a un microtubo de 0,5 ml usando una punta de pipeta de 1 ml. Nota: En este paso, los embriones pueden ser escalonados de acuerdo con criterios morfológicos, incluyendo los patrones de segmentación de la cutícula y las estructuras de la cabeza y la cola 9 . Durante la involución de la cabeza, entre 10 y 16 h después de la puesta de los huevos, el embrión sufre una pronunciada reducción del segmento más anterior 9 . </li><li> Lavar los embriones una vez con 0,4 ml de solución de PBT y añadir 0,3 ml de solución de bloqueo (5% de suero de cabra normal y 5% de DMSO en solución PBT). </li><li> Bloquear los embriones con nutation a RT durante 15 min. </li><li&gt; Añadir 75 μL de anticuerpo anti-Fasciclin II e incubar el tubo con nutación a RT durante la noche. </li><li> Lavar los embriones 4 veces con 0,4 ml de solución de PBT durante al menos 20 minutos por lavado. </li><li> Añadir 0,3 ml de solución de bloqueo (suero de cabra normal al 5% en solución de PBT) que contiene anticuerpo anti-ratón-HRP de cabra (2 μg / ml) e incubar el tubo con nutación a RT durante la noche. </li><li> Lave los embriones 6 veces con 0,4 mL de solución de PBT durante al menos 20 minutos por lavado. </li><li> Añadir 0,3 ml de solución de DAB al tubo. PRECAUCIÓN: Use guantes y coloque todos los desechos / tubos / puntas DAB en el blanqueador. </li><li> Añadir 2 μl de peróxido de hidrógeno al 3% e incubar el tubo en la oscuridad con nutación a RT hasta producir la cantidad deseada de precipitado. Nota: El tiempo de incubación para la inmunohistoquímica 1D4 en general oscila entre 0,5-1 h. </li><li> Lavar los embriones 4 veces con 0,4 ml de solución de PBT. PRECAUCIÓN: Retire la solución DAB y los dos primeros lavados con una pipeta y diScard ellos en lejía. </li><li> Añadir 0,2 ml de solución de glicerol / PBS al 70% al tubo y almacenar a RT o 4ºC. Nota: Mantenga el tubo alejado de la luz. Se pueden obtener preparaciones más claras colocando los embriones en una solución de glicerol / PBS al 90% 10 . Sin embargo, es más difícil diseccionar los embriones eliminados en solución de glicerol / PBS al 90% que los eliminados en la solución de glicerol / PBS al 70% 10 . </li></ol> 6. Etapa, Disección, Montaje e Imaging de los Embriones (Día 4) <ol><li> Para la estadificación, transfiera los embriones equilibrados con glicerol al 70% / PBS sobre un portaobjetos de vidrio. </li><li> Recolecte embriones de fase tardía-16 que tienen los nervios del segmento abdominal 7 (A7), A8 y A9 ISN que convergen para tocarse unos a otros y / o tener un intestino medio que se subdivide en tres bandas. Nota: Los embriones teñidos con anticuerpos 1D4 se pueden clasificar según los patrones de proyección de los axones motores ISN e ISNb. Después de salir del CNS, A7, A8 y A9 ISN neRves de última etapa-16 embriones convergen para tocarse mutuamente y posteriormente divergen para extenderse lejos a los músculos dorsales (flecha en la Figura 1A ). En los embriones de la etapa media-16, sin embargo, los nervios A7 ISN se extienden en paralelo con los nervios A8 / A9 (soporte cuadrado en la Figura 1B ). Además, los ejes de proyección de los nervios A6 ISNb (perpendiculares a los músculos ventrolaterales) en ambos hemisegmentos están aproximadamente alineados con el extremo posterior de los fascículos del axón longitudinal del SNC (flechas y una línea en la Figura 1C ). Estos criterios morfológicos varían algo entre los diferentes genotipos. Alternativamente, los embriones se pueden realizar en función de la morfología intestinal 9 , 11 . Antes de la etapa 17, el intestino medio tiene una forma de corazón, mientras que el intestino medio se subdivide en tres bandas por la etapa 17 12 . </li><li> Disecar los embriones. <ol><li> Usando un 1 mL, retire cada embrión de la gota de glicerol y coloque el embrión boca arriba. Corte la parte anterior a 1/4 de la longitud del cuerpo y la región más posterior que esté libre de axones motores. </li><li> Usando una sonda de aguja, mueva el embrión de corte final de la gota de glicerol, ruede para orientarlo hacia arriba y colóquelo horizontalmente en el campo. Nota: Cuando el embrión se retira de la gota de glicerol, un poco de glicerol asociado con el embrión lo hace pegajoso. </li><li> Corte el embrión a lo largo de la línea media dorsal utilizando una sola aguja de tungsteno muy fino 13 . Haga un pequeño corte en el extremo posterior del embrión y luego continúe cortando la línea media dorsal hacia la parte anterior; Corte en la dirección opuesta es también muy bien. </li><li> Usando una sonda de aguja, mueva el embrión cortado a la línea media en la gota de glicerol, colóquelo de lado dorsal hacia arriba y separe el intestino de la pared del cuerpo desplegando cada pared del cuerpo en una dirección ventrolateral (diagonal) (2.5X objetivo). Nota: Asegúrese de que la línea media dorsal está completamente cortada, lo que resulta en la separación completa entre las paredes del cuerpo izquierdo y derecho. </li><li> Con cuidado, mueva el embrión cortado de la línea media de la gota de glicerol y luego coloque dos solapas de la pared del cuerpo sobre el portaobjetos de vidrio usando una sonda de aguja fina (objetivo 2,5X). </li><li> Usando una aguja de tungsteno muy fina, retire los órganos internos del embrión diseccionado empujándolos lateralmente (objetivo 5X). Nota: Una descripción más detallada de otro procedimiento de disección similar se puede encontrar en el sitio web 5 . </li></ol></li><li> Para el montaje, añadir 2-3 μL de solución de glicerol / PBS al 70% a embriones limpios, disecados y, utilizando una sonda de aguja fina, transferirlos a una nueva diapositiva de vidrio sobre la cual se han extendido 8 μl de solución de glicerol / PBS al 70% El centro (objetivo 2.5X). </li><li> Póngase una cubreobjetos (18 mm x 18 mm). Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas regular (ya seaClaro o coloreado está bien). </li><li> Capture imágenes a alta resolución (objetivos de inmersión en aceite 20X, 40X y 63X) bajo un microscopio de luz de contraste de interferencia diferencial (DIC), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: Se puede producir una mejor visualización y caracterización fenotípica, especialmente para los axones motores ISNb, utilizando un objetivo de inmersión en aceite 63X. </li></ol>

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	<li>Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+larval+muscles+in+Drosophila.">The embryonic development of larval muscles in Drosophila.</a> Development. 110 (3), 791-804 (1990).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67 (1), 45-57 (1991).</li><li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila.">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).</li><li>. Available from: <a target="_blank" href="https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html">https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html</a> (2017)</li><li>Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+genes+necessary+for+guidance+toward+or+away+from+the+midline.">Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline.</a> Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).</li><li>Thor, S., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+islet+gene+governs+axon+pathfinding+and+neurotransmitter+identity.">The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity.</a> Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).</li><li>Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ligand+regulation+of+PlexB+signaling+in+motor+neuron+axon+guidance+in+Drosophila.">Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole+mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+dissection+of+Drosophila+embryos:+streamlined+methods+for+screening+mutant+collections+by+antibody+staining.">Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining.</a> J. Vis. Exp. (34), (2009).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasciclin+IV:+sequence,+expression,+and+function+during+growth+cone+guidance+in+the+grasshopper+embryo.">Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo.</a> Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).</li><li>Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+semaphorin-1a-mediated+reverse+signaling+by+opposing+pebble+and+RhoGAPp190+functions+in+Drosophila.">The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila.</a> Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).</li><li>Winberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin+A+is+a+neuronal+semaphorin+receptor+that+controls+axon+guidance.">Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance.</a> Cell. 95 (7), 903-916 (1998).</li><li>Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+guidance+function+of+Rap1+small+GTPase+is+independent+of+PlexA+RasGAP+activity+in+Drosophila.">The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila.</a> Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).</li><li>Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+Semaphorin+Sema+I+is+required+in+Drosophila+for+embryonic+motor+and+CNS+axon+guidance.">The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance.</a> Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Kidd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roundabout+controls+axon+crossing+of+the+CNS+midline+and+defines+a+novel+subfamily+of+evolutionarily+conserved+guidance+receptors.">Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors.</a> Cell. 92 (2), 205-215 (1998).</li><li>Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+neural+circuits+into+shape+with+semaphorins.">Getting neural circuits into shape with semaphorins.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).</li></ol>

El autor declara que no tiene intereses financieros en competencia.

Los detalles de los defectos de orientación del axón motor se anotan más rápido y con mayor precisión por la preparación en filetes de los embriones teñidos con DAB que por la microscopía confocal de escaneo con láser de los marcados fluorescentemente. Por lo tanto, la preparación en filetes de embriones fijos y teñidos con 1D4 es la más adecuada para la caracterización funcional de moléculas de guía. Cuatro clases principales de señales de guía, incluyendo netrinas, hendiduras, semaforinas (Semas), y ephrins, y sus receptores cognados han conservado evolutivamente papeles a través de gusanos, moscas y vertebrados [ 20] . Entre las moléculas de la familia de la rotonda (Robo) que actúan como receptores para las hendiduras, Drosophila Robo se identificó por primera vez para mediar la función de guía repulsiva en el SNC 6,21. Semas son una gran familia de moléculas de orientación que se unen a la plexina que contienen los complejos receptores [ 22] . La función de orientación axonal de SemasFue descubierto por primera vez en el saltamontes CNS 14 . Posteriormente, la semahorina transmembrana de clase 1 Sema-1a se caracterizó extensamente en Drosophila . Sema-1a, que funciona no sólo como un ligando para la plexina A, sino también como un receptor para un ligando desconocido, juega un papel importante en la repulsión del axón-axón en puntos específicos de elección durante el desarrollo neural embrionario 15 , 16 , 17 , 18 ( Figura 2C ). Hay algunos pasos de solución de problemas comunes que pueden ocurrir con el protocolo actual. Primero, en los pasos 3.9-3.13, los embriones pueden devitellinized con la eficacia baja si los embriones demasiados o demasiado pequeños se utilizan en el procedimiento del devitellinization del methanol. En este caso, se recomienda utilizar un volumen de lecho de 40-80 μl de embriones fijos para devitellinización en el paso 3.5. Segundo, en stePs 3,9-3,13, la tinción de X-Gal débil puede ocurrir en caso de una exposición más prolongada al metanol o una eliminación incompleta de heptano, puesto que el metanol utilizado como fijador destruye la actividad β-Gal. En este caso, lo mejor es que el procedimiento de desvitellinización utilizando metanol en los pasos 3.9-3.13 se realice lo más rápidamente posible. Además, el heptano residual que se solubiliza en metanol puede interferir con la tinción; Por lo tanto, es mejor quitar la cantidad de metanol posible en los pasos 3.11-3.13. El actual protocolo de preparación de fileteado se puede aplicar a la pérdida de función y ganancia de funciones de las pantallas genéticas para identificar nuevos genes que están involucrados en el axón motor pathfinding y reconocimiento de objetivos. Sin embargo, una desventaja de este protocolo es que es bastante lento diseccionar embriones fijos para generar preparaciones en filetes. Para superar este problema, la caracterización fenotípica de las proyecciones axonales se puede monitorear en una preparación de montaje completo de embrión teñido con 1D4Ryos, aunque este método proporciona una visualización de baja resolución de las proyecciones axonales en la periferia. Sin embargo, el conjunto de montaje de protocolo de preparación ha demostrado ser un enfoque eficaz para la selección de axón orientación genes [ 4] . Recientemente se desarrolló un protocolo alternativo usando la disección viva de embriones marcados fluorescentemente para el cribado sistemático 11 . El protocolo de disección en vivo permite la preparación relativamente rápida para el análisis fenotípico [ 11] . Sin embargo, este protocolo no es adecuado para los embriones más antiguos que el comienzo de la etapa [17, 11] . El protocolo de preparación en filetes descrito aquí puede usarse para examinar patrones de expresión de proteínas con diferentes anticuerpos. Además, este protocolo también puede aplicarse a los embriones de Drosophila en diversas etapas de desarrollo.

Las conexiones precisas y selectivas entre los axones motores y los músculos diana durante el desarrollo embrionario son esenciales para la locomoción normal en larvas de Drosophila . El patrón embrionario de 30 fibras musculares en cada uno de los hemisegments abdominales A2-A7 se establece por la etapa 16 1 . Las 36 neuronas motoras que se generan en el cordón nervioso ventral extienden sus axones hacia la periferia para inervar los músculos diana específicos 2 . La detección del axón motor y el reconocimiento del objetivo se pueden visualizar mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo (anticuerpo monoclonal de ratón 1D4) 3 , 4 . Múltiples imágenes de los patrones de proyección del axón motor en embriones de tipo salvaje están disponibles en la web 5 . El anticuerpo 1D4 etiqueta todos los axones motores y tres fascículos axónicos longitudinales en cada lado de la línea media del sistema nervioso central embrionario (SNC) 4 </sUp&gt; , 6 ( Figura 1C y Figura 2A ). Por lo tanto, la inmunohistoquímica con el anticuerpo FasII proporciona una poderosa herramienta para identificar los genes necesarios para la conectividad neuromuscular para demostrar los mecanismos moleculares subyacentes axón motor orientación y reconocimiento de objetivos. En cada uno de los hemisegmentos abdominales A2-A7, los axones motores se proyectan y se fasciculan selectivamente en dos ramas nerviosas principales, el nervio segmentario (SN) y el nervio intersectorial (ISN) 2 , 4 , y una rama nerviosa menor, el nervio transversal ) 7 . El SN defascicula selectivamente para dar lugar a dos ramas nerviosas llamadas SNa y SNc, mientras que el ISN se divide en tres ramas nerviosas llamadas ISN, ISNb e ISNd 2 , 4 . Entre ellos, ISN, ISNb, SNA y el axón motorLos patrones de proyección se visualizan con mayor precisión cuando los embriones de etapa 16 tardía se tiñen con anticuerpo FasII y se filetean ( Figura 1C y Figura 2A ). Las neuronas motoras ISN extienden sus axones para inervar los músculos dorsales 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 y 20 2 , 4 ( Figura 2A ). Las neuronas motoras ISNb inervan los músculos ventrolaterales 6, 7, 12, 13, 14, 28 y 30 2 , 4 ( Figura 2A y 2B). La rama nerviosa SNa proyecta inervar los músculos laterales 5, 8, 21, 22, 23 y 24 2 , 4 ( Figura 2A ). El TN, que consiste en dos axones motores, proyecta ipsilateralmente a lo largo del borde segmentario para inervar el músculo 25 y hace sinapsis con la neurona dendrítica bipolar lateral (LBD) en elPeriferia 7 ( figura 2A ). Estas innervaciones musculares objetivo requieren no sólo la defasciculación selectiva de los axones motores en puntos específicos de elección, sino también el reconocimiento del músculo objetivo. Además, algunas putativo mesodermal guidepost células que actúan como objetivos intermedios se encontraron tanto en el ISN y SNa vías, pero no a lo largo de la vía ISNb [ 4] . Esto podría sugerir que ISNb motor axon pathfinding puede ser regulado de una manera distinta en comparación con la ISN y SNa axón motor guía, y también indica que periféricos axón motor guía proporciona un atractivo modelo experimental para estudiar el diferencial o conservado funciones de una sola guía de referencia Molécula 8 . Este trabajo presenta un método estándar para visualizar los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila . Los protocolos descritos incluyen cómo diseccionar embriones fijos teñidos con 1D4 aNtibody y procesados ​​en 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) para preparaciones en filetes. Una ventaja crítica de las preparaciones planas de embriones fijos es la mejor visualización de las proyecciones axonales y patrones musculares en la periferia. Además, este trabajo también muestra cómo el genotipo de embriones fijos para ordenar los embriones mutantes deseados utilizando el método de tinción LacZ.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal Substrate</td><td>US Biological</td><td>X1000</td><td>X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244023</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>US Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Tricon Beaker</td><td>Simport</td><td>B700-100</td><td>This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Societe Industrielle Lesaffre</td><td>Saf Instant Yeast Red</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td><td>VWR</td><td>14220-263</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube (1.5 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>#72.690</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>The Clorox Company</td><td>Clorox</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FasciculinII Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4 anti-Fasciclin II</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-068</td><td>AffiniPure F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L)&lt;br/&gt; (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass</td><td>Duran Group</td><td>235501403</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Duran Group</td><td>235503104</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson Medical(s)</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Ted Pella</td><td>#27-11</td><td>Tungsten Wire, &amp;oslash;0.13mm/6.1m (&amp;oslash;.005&quot;/20 ft.)</td></tr><tr><td>Nutator (Mini twister)</td><td>Korean Science</td><td>KO.VS-96TWS</td><td>Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td></tr></tbody></table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

El establecimiento de circuitos neuromusculares funcionales se basa en conexiones precisas entre los axones motores en desarrollo y los músculos diana. Las neuronas motoras extienden los conos de crecimiento para navegar a lo largo de caminos específicos, respondiendo a un gran número de guías de orientación del axón que emanan del entorno extracelular circundante. El reconocimiento del blanco del cono de crecimiento también juega un papel crítico en la especificidad neuromuscular. Este trabajo presenta un protocolo de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. Este protocolo incluye algunos pasos clave, incluyendo un procedimiento de genotipado, para clasificar los embriones mutantes deseados; Un procedimiento de inmunotinción, para marcar los embriones con el anticuerpo fasciclin II (FasII); Y un procedimiento de disección, para generar preparaciones en filetes a partir de embriones fijos. Las proyecciones axonales motoras y los patrones musculares en la periferia se visualizan mucho mejor en preparaciones planas de embriones fileteados que en whOle-mount embriones. Por lo tanto, la preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la detección del axón motor y el reconocimiento de diana, y también puede aplicarse tanto a las pantallas genéticas de pérdida de función como de ganancia de función .

Las conexiones precisas entre los axones motores y los músculos diana durante el desarrollo neural dependen de la repulsión selectiva del axón-axón y el reconocimiento del objetivo en puntos específicos de elección 4 . En Drosophila , la repulsión selectiva entre los axones motores está regulada en parte por la acción combinada de semahorinas de clase 1 y 2 (Semas), incluyendo Sema-1a, Sema-2a y Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Por lo tanto, la pérdida de la función Sema-1a con frecuencia resulta en el fracaso de los axones ISNb defasciculate en determinados puntos de elección, haciendo que presenten una morfología anormalmente gruesa (flecha en la Figura 2C ). En embriones de tipo salvaje, al menos 7 neuronas motoras se extienden y fasciculan sus axones para formar un ISNb ( Figura 2A ). Cuando la rama del nervio ISNb alcanza un punto de elección, que se localiza entre los músculos 6 y 7, dos axones selectivamente defasciculate del haz ISNb principal y posteriormente inerva los músculos 6 y 7 ( Figura 2B ). En el punto de elección siguiente, que está situado entre los músculos 6, 13 y 30, otros tres axones motores defasciculate selectivamente para inervar los músculos 13, 14 y 30 ( Figura 2B ). Los otros dos axones se extienden dorsalmente para alcanzar el último punto de elección cerca del borde del músculo 12, inervando así el músculo 12 en la dirección opuesta ( Figura 2B ). Estos resultados muestran claramente que el protocolo de preparación en filetes proporciona una herramienta útil para estudiar los genes necesarios para la orientación del axón motor. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig1.jpg" /> <strFigura 1: Estadificación de embriones basados ​​en los patrones de proyección de los axones motores ISN e ISNb. ( A ) En la fase final de 16 embriones de tipo salvaje, A7, A8 y A9 nervios ISN (flechas) convergen para tocarse (flecha). El anterior es izquierdo y ventral está abajo. La barra de escala = 15 μm. ( B ) En los embriones de tipo salvaje de la etapa media-16, el nervio A7 ISN se extiende en paralelo con los nervios A8 / A9 (soporte cuadrado). Las flechas indican los nervios A7, A8 y A9 ISN. El anterior es izquierdo y ventral está abajo. La barra de escala = 15 μm. ( C ) Preparación en filetes de embriones de tipo salvaje de fase 16 tardía teñidos con anticuerpo FasII. Los ejes de proyección (flechas) de los nervios A6 ISNb izquierdo y derecho están aproximadamente alineados con el extremo posterior de los fascículos axonales longitudinales del SNC (línea negra). Los segmentos abdominales A1-A7 están marcados en la parte superior. El anterior está a la izquierda. La barra de escala = 15 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55830/55830fig1large.jpg" target="_blank">Petición</a>Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig2.jpg" /> Figura 2: Patrones de proyección del axón motor en embriones mutantes de tipo salvaje y Sema-1a . ( A - C ) Preparación en filetes de embriones de etapa tardía-16 teñidos con anticuerpo FasII. El anterior es izquierdo y ventral está abajo. Diagramas esquemáticos que muestran los patrones de proyección axonal representados en cada panel. Las barras de escala = 15 μm. ( A ) Fotografía de campo brillante de dos hemisegmentos abdominales secuenciales, A3 y A4, en embriones de tipo salvaje. En el SNC hay tres haces axónicos longitudinales bilateralmente simétricos. Los patrones normales de innervación de los axones motores ISNb, SNa, ISN y TN están indicados por las cajas y una flecha en la periferia. La neurona dendrítica bipolar lateral (LBD), que inerva los músculosEd por una punta de flecha. En el diagrama esquemático se presentan las ramas nerviosas y los patrones de inervación de las neuronas motoras ISNb (en marrón), SNa (en azul), ISN (en verde) y TN (en amarillo) y sus músculos diana. Las posiciones del cuerpo celular de estas neuronas motoras en el SNC también se muestran en sus propios colores. ( B ) En los embriones de tipo salvaje, los axones ISNb se proyectan a los músculos ventrolaterales, que están numerados, y los inervan en puntos específicos de elección (flechas en la imagen DIC). ( C ) En los mutantes de pérdida de función Sema-1a , los axones ISNb frecuentemente no se defasiculan entre sí entre los músculos 6 y 13 (punta de flecha en la imagen DIC). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55830/55830fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

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Universidad San Sebastian

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Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K vistas.  Chonbuk National University.  Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural. 

Video: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Investigación

Neurociencias

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Biología del Desarrollo

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

Preparación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas centrales para<em&gt; In situ</em&gt; Parche de sujeción

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Visualizar Drosophila pierna axones de la neurona de Motor a través de la cutícula del adulto

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60716/retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using'>Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)</a>This video demonstrates the method of retrograde labeling of Drosophila motor neurons using lipophilic dyes. The dye enters the axon, travels retrogradely, and labels the neurons green, allowing detailed visualization of their morphology and projections under a confocal microscope.

Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)This video ...

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias

Resumen

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Capítulos en este video

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3^Rd Instar Drosophila Preparación de larvas