Name: image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro
Uploaded: 2014-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
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The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

참고 :이 방법에 설명 된 모든 혈액 수집 절차가 헬싱키 선언에 따라 실시 및 인체에 대한 UNT 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을했다. 모든 과목은 혈액들이 정상 체중, 건강 해 보이는되었는지 확인하기 위해 본 발명의 방법에 사용 된 수집, 질병 무료 서면 동의를했다. 1. 시약 소스 및 준비 <ol><li> 사용 CD66b-APC (클론 # 1 G10F5; DF = 1 : 50) 및 CD45-APCeFluor780 (클론 # 2D1 = 1 DF : 50)이 분석합니다. 참고 : 이전 연구에, CD45와 CD66b 항체는 최적의 희석을 결정하기 위해 titered 된 다른 백혈구에서 명확하게 해결 과립구 (CD45 + / 66B의 +) (CD45 + / 66b-) 11. 염색에 대한 희석 항체를 첨가하면 튜브의 최종 희석는 875이었다. </li><li> 구입 및 주식 S. 해동 구균은 pHrodo 붉은 염료로 표지 bioparticles. 1m의 농도 일시멸균 PBS에 1 ㎖ 당 bioparticles의 g. 분석에 사용 된 때까지 나누어지는 희석 bioparticles과 상점은 -20 ° C에서 냉동. </li><li> ㎍ / ㎖ (10)의 최종 농도로 DMSO에, 산소 유리기 (즉, 산화 적 버스트)의 존재 하에서 형광성 티듐 브로마이드로 변환 dihydroethidium (DHE)을 용해. </li><li> 200 ㎎ / ㎖ 및 / ml로 각각 17.5 mg을 2 단계 희석 멸균 PBS로 (지정된 분석 배양 기간 다음과 같은 추가 식균 작용을 방지하기 위해 사용) N-에틸 말레이 미드를 섞는다. 분석에서, 15 mM의 최종 농도를 사용한다. N - 에틸 말레이 해동되면 N-에틸 말레이 용액에 남아 있지 않기 때문에, 37 ° C 열 블록을 사용한다. </li><li> 최종 정착 단계 후, 핵 DNA를 얼룩 7AAD를 사용합니다. 이전에 추가로, 멸균 PBS와 스톡 7AAD 1:10 희석. </li></ol> 2. 혈액 샘플 컬렉션 <ol><li> O / N 빠른 (&gt; 8hr)과 abstenti 다음 실험실에 도달하기 위해 주제를 물어신체 활동에서 (&gt; 12 시간)에. </li><li> 알코올 준비 패드로 피부를 청소 한 후, 주변 팔 정맥에 멸균 채혈 바늘을 삽입합니다. </li><li> 상업적으로 나트륨 헤파린으로 가득 대피 튜브에 혈액을 수집합니다. </li><li> 수집 한 후, 피사체의 팔에 접착 붕대를 적용합니다. </li><li> 10 배를 혼합 한 후 분석까지 로커에 배치 혈액 튜브를 반전. </li></ol> 3. 탐식 분석 기법 <ol><li> 해동는 S.aureus의 bioparticles (RT), DHE (RT) 및 N-에틸 말레이 미드 (37 ° C). </li><li> 멸균 후드에서 작업하는 동안 4 각 1.2 ml의 튜브는 S.aureus의 bioparticles 20 L을 추가합니다. </li><li> bioparticles를 포함하는 각각의 튜브에 DHE 40 L을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 튜브 바닥에 시약을 수집 벤치 표면에 튜브를 탭. </li><li> bioparticles과 DHE 가득 된 각 튜브에 혼합 된 전혈 100 L을 추가합니다. </li><li>어떤 오염 혈액을 제거하는면 팁 어플리케이터 튜브의 내부 모서리를 닦습니다. </li><li> 혈액 첨가 한 후 3주기 위해 혈액과 시약을 혼합 세트 전자 피펫으로 혈액과 시약을 섞는다. </li><li> 얼음 양동이에 분석 튜브를 삽입하고 빛으로부터 보호하기 위해 커버한다. </li><li> 10, 20, 및 40 분 동안 분석 튜브를 부화. 모든 분석 튜브 동시에 끝낼 수 있도록 40 분 관을 시작합니다. </li><li> 해동 N-에틸 말레이 37 ° C 구슬 목욕. </li><li> 피펫 각 분석 튜브에 (1.4에서 상술) N-15 에틸 말레이 L, 30 분 동안 배양한다. </li><li> 피펫 CD66b-APC의 10 L과 CD45-APCeFluor780 (1.1에서 설명한) 희석 된 항체의 10 L은 60 분 동안 품어. </li><li> 피펫 각 분석 튜브에 WBC 수정 / 적혈구로 용해 액의 750 L, 60 분 동안 품어. </li><li> 원심 분리기 시험 튜브 (400 XG에 10 분) 세포 펠렛을 수집한다. </li><li> 진공 잔류 플로리다를 떠나, WBC로 용해 / RBC 수정 솔루션을 대기음세포 펠렛 위의 UID 볼륨 (100 L). </li><li> 7AAD의 희석 (1.5에서 상술) 용액을 각 분석 튜브에 PBS의 50 L의 10 L 피펫. </li><li> 냉장고에 하나 호일 분석 튜브, 랩 튜브에 교정 구슬 (~ 25 L) 각 분석 튜브, 장소 캡의 드롭과 장소를 추가합니다. </li><li> 사이토 이미지 기반 흐름으로 샘플 튜브를 넣고 미리 정의 된 파라미터를 이용하여 3000 과립구 이벤트들의 최소 수집 : 오토 샘플러, 청색 (488nm의 60 MW), 적색 (640 내지 100 NW), SSC (785 나노 미터; 8.5 MW) 레이저 (그림 1). </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> 도 1 취득 방법 및 템플릿. 샘플 (A) 사이토 이미지 기반 흐름을 획득 하였다. 수집하는 동안, CD66b-APC 대 밝은 필드 화면 비율의 도트 플롯은저기서 아군 교정 구슬에서 분리 된 과립구에 생성 된g INSPIRE V. 100.2.292.0 소프트웨어 (B). 빨간색, (640 nm의 100 NW), SSC (785 nm의 8.5 MW) 레이저 5,000 과립구의 최소 푸른 오토 샘플러 (60 mW의 488 nm의)를 사용하여 각각의 샘플을 취득했다. 히스토그램의 수는 레이저 설정 및 데이터의 다른 측면 수집을 모니터링 획득 동안 존재 함을 유의하시기 바랍니다. 이 히스토그램 모든 옵션 및 실험실 표준 운영 절차는 품질 관리로 필요한 경우에만 필요합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 4. 샘플 수집 및 분석 <ol><li> 월간 이미지 파일을 보상 (CIF)를 RAW 이미지 파일 (RIF)에 대한 보상 행렬을 적용하고 만드는 아이디어 소프트웨어의 자동화 된 소프트웨어 보정 마법사를 사용합니다. </li><li> 아이디어 소프트웨어에서 개별 CIF 파일을로드하고 과립구 하위 집합을 식별하기 위해 다음 플롯을 생성합니다 </리&gt; <li> 시야 그라데이션 RMS (도 2a)에 대한 히스토그램을 이용하여 초점이있는 것으로 간주 하였다 셀을 식별하는 초기 게이트들을 확립한다. 기준 표준으로 비자극 제어를 사용하여 각 환자 샘플에 대해이 결정을. </li><li> 대 시야 영역 (도 2B) 시야 종횡비 (폭 대 높이의 셀 비율)의 도트 플롯을 사용하여 파편과 이중선 별개 중항 셀 보조 플롯을 사용한다. 기준 표준으로 비자극 제어를 사용하여 각 환자 샘플에 대해이 결정을. </li><li> 세포의 깨끗한 인구가 확인되자 양 (CD45 + / 66B의 +를) 과립구를 확인하는 CD66b 대 CD45 (그림 2C)의 도트 플롯을 설정합니다. S. 밝은 세부 강도의 딸 플롯 (그림 3)를 작성 구균 대 산화 버스트 (DHE, y 축)에 대한 밝은 세부 강도 (x 축)을 활성화 과립구의 하위 집합을 식별합니다. BR 수집채널 1과 9의 광명이 필드 이미지, 채널 2에서 bioparticles, DHE 채널 4, 7AAD 채널 5에서, CD66b 채널 (11), 및 CD45에 채널 12. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> 도 2 분석 템플릿.이 도면 포커스 (A)에 있던 세포를 식별하기 위해 생성 된 일련의 플롯, 단 전지 (B), 과립구 (C). 추가의 플롯 활성화 과립구 대 비활성 과립구의 세 서브 세트를 식별하는 데 사용 하였다. 획득 한 이미지 파일의 모든 분석은 아이디어의 6 절 소프트웨어를 사용하여 완성되었다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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	<li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes.">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li><li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response.">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li><li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li><li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li><li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-year+school-based+diet/exercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children.">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status.">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li><li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate-intensity,+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults.">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li><li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise:+implications+for+infection+risk.">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative.">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li><li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li><li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus.">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li><li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis:+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections.">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li><li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro.">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay.">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold/Flu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise.">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain.">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

본 발명의 방법은 1,3,4,12-14 유동 세포 계측법을 사용하여 과립구 기능의 평가를위한 기존의 방법의 구체화를 나타냅니다. 이 분석의 중요한 단계는 bioparticles DHE과 함께 혈액 샘플의 적절한 혼합에 관련되는 경향이있다. 불완전한 혼합은 부정확 한 결과가 발생합니다. 완전한 혼합이 중요하지만, 혼합 방법은 자연에서 완만해야한다. 이 혼합 기능보다는 볼텍스 믹서와 전자 피펫을 혼합하여 이루어질 수 있음을 제안한다. 분석에서의 또 다른 중요한 단계는 항상 분석 튜브의 상부 절반을 오염 혈흔가 없도록하는 것이다. 이 잔여 혈액을 멸균 면봉을 사용하여 제거 할 수있다. 오류가 미 용해 적혈구 제제 최종 분석을 오염시킬 수 있기 때문에 그렇게 완전한 제거가 중요하다. 이 방법에게 적절한 보상 컨트롤을 사용하기 전에이 SP의 제어를 추가해야과립구 함수의 다양한 양태를 식별하는 데 사용되는 시약 사이 ectral 오버랩. 이 방법의 경우, 보상 제어가 40 분 검정 인큐베이션을 제안하고 단일 마커로 라벨링 된 혈액 샘플을 수집 포함 (예, E. 콜리, DHE 등). 표지 한 후, 하나의 양의 이벤트가 수집되고 보정 행렬 IDEAS 분석 소프트웨어에서 자동 마법사를 사용하여 생성된다. 이것은 상기 분석이 사용될 경우, 적절한 보상 제어가 적절한 분석 성능을 보장하기 위해 완성하는 것이 중요하다. 분석 밝은 상세 강도가 집단을 구분하는 가장 좋은 변수임을 확인하고 또한 많은 중복 산화 버스트와 식균 작용 신호 사이에 존재하는 방법을 식별하는 기능을 찾기 및 공동 현지화 마법사를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 구체적으로는, 이미지 기반 계측법의 사용은 세 개의 서브 세트들로 과립구 활성화를 분리하는 기능을 제공했다. 티자신의 일부 고장은 산화 버스트 대 식세포의 밝은 세부 강도를 사용하여 측정 하였다. 단수 이들 세포의 기능을 검사하는 이외에도, 같은 해부학 적 위치 (CO 지방화)에서 동시에 이벤트를 나타내 세포 확인되었다. &quot;고 활성&quot;부분 집합으로 떨어졌다 과립구는 식균 작용과 산화 버스트 사이의 일관된 공동 현지화를 입증하는 유일한 표현형했다. 활성화 과립구 부분 집합이 식별 문제 해결이 필요한 가장 큰 지역이다. 사용자가 새로운 아이디어 샘플 프로세스 흐름을 이해하기 위해 시간이 걸릴 및 이미징 요소를 사용하여 세포 집단을 게이팅 메커니즘을 이해하는 것이 매우 중요하다. 사용자가 확인하고자 수있는 다른 수정 대체 또는 추가 분석 배양 시간의 선택을 포함한다. 현재의 방법은 10 ~ 40 분의 지속 시간의 사용을 제안한다; 그러나, 실험 모델에 따라,이 방법은 어디사용하기 위해서는, 더 긴 지속 시간 분석을 선택해야 할 것이다. 이러한 변경은 개별적으로 평가 될 필요가있다. 또한 그것은 검정 인큐베이션 기간은 세 개의 활성화 된 서브 세트의 외관에 현저한 효과가 있다고 판단 하였다. 이 보고서에 기술 된 방법은 이전에 과립구 기능 3,4,13,15에 대해 얻을 수있는 정보의 확장을 나타냅니다. 다른 실험실 면역 질환의 15-17 종합 평가의 일부로서 과립구 함수의 변화를 평가하는 것의 중요성을 보여 주었다. 이 분석의 잠재력에도 불구하고 한계가없는 것은 아니다. 주요한 제한 사항 중 하나는 높은 시료 처리 처리와 관련된 비용과 시간을 요구한다. 연구 설계가 주어진 날에 많은 수의 샘플을 필요로하는 경우, 이러한 처리는 어려울 수있다. 처리 전자 피펫 및 디스펜서를 이용하여 간소화,그러나 이들은 비싼 경향이 모든 실험실에서 반드시 사용할 수 없습니다. 연구의 우리의 영역은 운동과식이 습관이 면역 체계의 건강에 영향을주고 6,8-10,18-20를 작동 방법에 대한 연구에 초점을 맞추고있다. 이러한 목적은 인간의 건강의 다양한 분야에 대한 상당한 실질적인 의미를 가지고있다. 탐식 기능의 모니터링이 치료 결과에 중요 여기서 운동 영양 효과 이외에도 본 연구에서 입증 원고 탐식 방법은 임상 면역학의 다른 분야에서 유용 할 수있다. 본 분석은 가능성이있는 면역 학적 분석이 계측기 이미지 기반 흐름에서 할 수 할 수 있습니다 독특한 영상 정보의 장점을 취함으로써 다시 발명 할 것이 많은 사람들의 첫 번째입니다.

과립구는 침입 항원에 대한 방어의 첫 번째 라인을 제공하는 인체의 선천성 면역 시스템의 하나의 구성 요소를 나타냅니다. 과립구 기능을 평가하기위한 이전 방법은 과립구가 1-4을 어떻게 변화 해 왔는지 어려운 집단적으로 확인 할 수있게 별도의 방법을 사용하여 탐식 능력 또는 산화 버스트에 초점을 맞추었다. 흐름의 분야에서의 발전은 계측법 고 스루풋으로 5 세포의 고해상도 멀티 컬러 촬상 가능한 탁상 악기의 생산에 성공. 기존의 흐름과 함께 영상을 결합하는 능력은 세포 계측법 방법 세포 계측법 기존의 흐름 내에서 혁신과 면역 체계에 대한 새로운 정보를 추출하는 데 필요한 기술 플랫폼을 제공하는 진보를 나타냅니다. 지난 10 년 동안, 다른 사람의 사이에서 우리의 실험실은, 날카롭게 다양한 영양 및 운동 치료 patte의 효과에 초점을 맞추고있다선천성 면역 기능 6-9 RNS. 이 원고의 입증 방법은 임상 면역학 분야 내에서 실제적인 의미를 가지고있다. 본 방법은 동시에 세균 입자 및 산화 버스트의 식균 작용을 측정 할 수있는 이미지 기반의 유세포 전력을 활용. 이 방법을 사용하여, 하나의 화상 해석 계 부분에 의해 제공되는 변수를 사용하여 활성화 과립구를 분리 할 수​​있다. 이러한 개별 서브 세트들은 과립구 세포에서 이미지를 평가 한 후에 만​​ 식별 할 수 있었다. 또한 분석 배양 시간은 세 개의 활성화 서브 세트 (10) 사이의 전이에 영향을 미쳤다. 따라서, 다수의 인큐베이션 시간의 사용 방법은 다음과 같은 특정 실험 치료 과립구 함수의 변화를 테스트 할 수 있다는 그럴듯​​. 이 원고의 목적은 식균 작용과 동시에 oxidat을 측정하는 영상 기반 유동 세포 계측법을 이용하여 평가 함수 과립구의 방법을 설명했다필자는 버스트.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>used for blood collection</td></tr><tr><td>WBC Fixative / RBC Lysis solution</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>clone G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>clone 2D1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;S. aureus&lt;/i&gt; bioparticles</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmalemide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematology Analyzer</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96-channel pipet</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Incubator</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Workstation</td><td>Dell Computers</td><td>Various</td><td>Used for IDEAS analysis</td></tr></tbody></table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

이미지 기반의 유동 세포 계측법을 사용하면 우리가 세 가지 활성화 부분 집합 (그림 3)에 활성화 과립구의 동질 집단을 분리하는 것을 허용했다. 이 방법에서는 가장 효과적인 방법은 세 가지 활성화 부분 집합을 산화 버스트 대 (황색 포도상 구균) (DHE) (; 그림 4 그림 3) 식균 작용에 대한 밝은 세부 강도를하려하는 것입니다 해결하기 위해. 또한, 아이디어 소프트웨어의 공동 현지화 마법사의 사용은 매우 활성화 과립구의 특징 기호입니다 동시 식균 작용과 산화 버스트의 존재의 정량 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> 활성화 된 과립구 부분 집합의 그림 3. 식별. 세포 표면 마커 (CD45 + / 66B의 +)를 사용하여 과립구의 식별 한 후, 딸 플롯은 밝은 상세 INTEN으로 생성 된산화 버스트 밝은 상세 강도 대 식세포 작용에 대한 SITY. 이러한 접근법 비활성 (보라색), 저 활성의 백분율 (적색, A), 적당한 활성 사용 (청색, B), 및 높은 활성 상태 (노랑, C) 과립구 구했다. 게이팅이 기술은 또한 다양한 서브 세트 과립구 활성화의 상대적인 농축에 분석 배양 시간의 효과를 평가하기 위해 사용되었다. &quot;고 활성&quot;과립구의 가장 높은 비율은 40 분 배양 다음과 같은 존재. 획득 한 이미지 파일의 모든 분석은 아이디어의 6 절 소프트웨어를 사용하여 완성되었다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 과립구 활성화의 세 개의 서로 다른 서브 세트의 존재를 입증하는 이외에, 그것은 분석 배양 시간 과립구 활성화 각 서브 세트의 상대적인 풍부함을 좌우하는 것이 입증되었다. 구체적으로는, 40 분 INCubation는 &quot;높은 활성&quot;과립구의 가장 큰 비율의 결과. 적어도 세 개의 검정 인큐베이션 기간을 적용하여, 주어진 임상 치료의 시간적 과립구 활성화 상태를 변경하는 방법을 결정하는 것이 가능할 수있다. 이를 식균 작용 및 산화 버스트의 동시 측정의 함수로서 상이한 동작 과립구 서브 세트를 식별하기 위해 이미지 기반 유동 세포 계측법을 이용하여 제 발행 방법이다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> 세포 마커의 그림 4. 대표 이미지. 높은 활성 (A)로 분류 세포의 이미지 갤러리, 중등도 활동 (B), 낮은 활성 (C)이 그림에 제시되어있다.는 S.aureus의 bioparticles은 CH03에 산화 버스트는 CD66b가에, 측면 산란은 CH06에, 핵에 대한 7AAD은 CH05에, CH04에CH11, 및 CD45은 CH12에 있습니다. 또한, 산화 버스트 대 식세포 작용 (CH03) (CH04)의 공동 현지화 병합 이미지가 표시됩니다. 병합 이미지의 노란색 분야가 식균 작용과 산화 버스트가 동시에 동일한 해부학 적 공간에서 발생하는 나타낸다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기<em&gt; 체외</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.4K 조회수.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

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Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

연구

면역학 및 감염병학

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

인간의 혈액에서 측정 과립구와 단핵구 식균 작용 및 산화 버스트 활동

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

신경과학

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

생물학

Analyzing Basophil Activation in the Presence of a Test Allergen using Flow Cytometry

Source: Do&#241;a, I. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62600">Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we demonstrate the test to evaluate basophil activation in the presence of a test allergen using flow cytometry.

유세포 분석을 사용한 테스트 알레르겐이 있는 상태에서 호염병 활성화 분석

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Sample preparation

	Collect ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Source: Murinello, S. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54677">Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

유세포 분석을 사용한 유리체 내 전달 형광 입자의 미세아교세포 흡수 측정

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기

요약

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