The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

הערה: כל נהלי איסוף דם מתוארים בשיטה זו נערכו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו על ידי המועצה לביקורת המוסדית UNT (IRB) לבני אדם. כל הנבדקים נתנו הסכמה בכתב לאיסוף דם, אשר היה בשימוש בשיטה הנוכחית כדי להבטיח שהם היו בריאים לכאורה, של משקל גוף תקין, וללא מחלה. 1. מגיב מקור והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש CD66b-APC (# G10F5 שיבוט; DF = 1: 50) וCD45-APCeFluor780 (שיבוט # 2D1; DF = 1: 50) עבור assay זה. הערה: לפני המחקר, נוגדני CD45 וCD66b היו titered כדי לקבוע את הדילול האופטימלי שגרנולוציטים בבירור נפתרו (+ CD45 + / 66b) מכדוריות דם לבנות אחרים (CD45 + / 66b-) 11. על התוספת של הנוגדן המדולל למכתימים את הדילול הסופי בצינור היה 875. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש ולהפשיר מניית S. aureus bioparticles שכותרתו עם צבע אדום pHrodo. להשעות בריכוז של 1 מ &#39;גרם של bioparticles לכל מיליליטר ב PBS סטרילי. bioparticles לדלל aliquot וחנות קפוא ב -20 ° C עד בשימוש assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר dihydroethidium (DHE), אשר מומר ברומיד ethidium ניאון בנוכחותם של רדיקלים חופשיים של חמצן (כלומר, פרץ חמצוני), בDMSO לריכוז סופי של 10 g / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים N-ethylmaleimide (המשמש למניעת phagocytosis נוסף הבא משך הדגירה assay צוין) עם PBS סטרילי בדילול 2 צעד של 200 מ&quot;ג / מיליליטר ו -17.5 מ&quot;ג / מיליליטר בהתאמה. בassay, להשתמש ריכוז סופי של 15 מ&quot;מ. כאשר מפשיר N-ethylmaleimide, להשתמש גוש חום 37 מעלות צלזיוס, כמו N-ethylmaleimide לא יישאר בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב הקיבוע הסופי, להשתמש 7AAD להכתים DNA הגרעיני. לפני בנוסף, לדלל 7AAD מניית 1:10 עם PBS סטרילי. </li></ol> אוסף דוגמאות 2. דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאל נושאים להגיע למעבדה הבאה O / N (&gt; 8hr) המהיר וabstentiמפעילות גופנית (&gt; 12 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניקוי העור עם כרית הכנת אלכוהול, להכניס מחט סטרילית איסוף דם לוריד זרוע היקפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם לתוך צינורות פונו כי הם מלאים באופן מסחרי עם הפרין סודיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף, להחיל תחבושת דבק לזרועו של הנושא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך צינורות דם לערבב 10 פעמים ולאחר מכן למקם על כיסא נדנדה עד לניתוח. </li></ol> טכניקת 3. phagocytosis Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> bioparticles ההפשרה S.aureus (RT), DHE (RT), ו- N-ethylmaleimide (37 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 L של bioparticles S.aureus 4 1.2 מיליליטר צינורות בודדים בעת שעבדה בשכונה סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 L של DHE לכל צינור המכיל את bioparticles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את הצינורות על משטח הספסל כדי לאסוף את חומרים כימיים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של כל דם מעורב 100 L על צינור אחד שכבר מלא בbioparticles וDHE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">נגב את הקצה הפנימי של הצינורות עם המוליך כותנה שקצהו כדי להסיר כל דם מזהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הדם וחומרים כימיים עם pipet אלקטרוני להגדיר לערבב את הדם וחומרים כימיים לשלושה מחזורים לאחר תוספת דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות assay בדלי קרח ולכסות כדי להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות assay 10, 20, ו -40 דקות. התחל עם צינור 40-דקות כדי להבטיח את כל צינורות assay לסיים באותו הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה N-ethylmaleimide באמבטיה חרוז 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 15 L של N-ethylmaleimide (שתואר לעיל ב1.4) לתוך צינור אחד assay, דגירה במשך 30 דקות-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 10 L של CD66b-APC ו -10 L של CD45-APCeFluor780 נוגדנים מדוללים (שתוארו לעיל בסעיף 1.1), דגירה של 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 750 L של תיקון פתרון lyse / RBC WBC לתוך צינור אחד assay, דגירה של 60-דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (10 דקות ב 400 XG) צינורות assay כדי לאסוף את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לשאוב את פתרון lyse WBC / תיקון RBC, עוזב fl שיירנפח uid (100 ליטר) מעל התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 10 L של פתרון המדולל 7AAD (שתואר לעיל ב 1.5) ו -50 ליטר של PBS לתוך צינור אחד assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של חרוזים כיול (~ 25 L) על צינור אחד assay, כובעי מקום בצינורות assay, צינורות לעטוף בנייר כסף, ומכניס למקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צינור המדגם לתוך הזרם מבוסס תמונת cytometer ולאסוף מינימום של 3,000 אירועי granulocyte באמצעות פרמטרים שהוגדרו מראש: autosampler, הכחול (ננומטר 488; 60 mW), אדום (640 ננומטר; 100 NW), SSC (ננומטר 785; 8.5 לייזרי mW) (איור 1). </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> איור 1. רכישת שיטה ותבנית. דוגמאות נרכשו על זרימה מבוססת תמונה cytometer (). במהלך רכישה, מגרשי נקודה של יחס ממדים מואר שדה לעומת CD66b-APC נוצרו לגרנולוציטים הופרדו מחרוזי כיול ממוסמר using INSPIRE v. 100.2.292.0 תוכנה (B). מינימום של 5,000 גרנולוציטים נרכש עבור כל דגימות באמצעות autosampler, כחולה (488 ננומטר; 60 mW), אדום (640 ננומטר; 100 NW), SSC (785 ננומטר; 8.5 mW) לייזרים. אנא שים לב כי מספר היסטוגרמות נמצא במהלך הרכישה לפקח הגדרות לייזר והיבטים אחרים של נתונים לאסוף. כל היסטוגרמות אלה הם אופציונליים ונחוצים רק אם נהלי עבודה במעבדה מחייבים אותם כבקרת איכות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 4. לדוגמא רכישה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באשף פיצוי תוכנה האוטומטי של תוכנת הרעיונות ליישם מטריצת פיצויים לקבצי גלם תמונה (RIF) וליצור לפצות קבצי הדמיה (CIF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון קבצי CIF בודדים בתוכנת רעיונות וליצור החלקות הבאות כדי לזהות את תת granulocyte: </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת שערים ראשוניים לזהות תאים שנחשבו להיות בפוקוס באמצעות היסטוגרמה לRMS הבהיר שיפוע שדה (איור 2 א). לקבוע זאת עבור כל דגימת מטופל באמצעות שליטת unstimulated כסטנדרט התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במגרשים משניים לתאי גופייה נפרדים מפסולת וכפילויות באמצעות עלילת נקודה של יחס בהיר היבט שדה (יחס בין גובה תא לעומת רוחב) לעומת אזור שדה הבהיר (איור 2). לקבוע זאת עבור כל דגימת מטופל באמצעות שליטת unstimulated כסטנדרט התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאוכלוסייה נקייה של תאים שזוהתה, להקים עלילת נקודה של CD45 לעומת CD66b (איור 2 ג) כדי לזהות באופן חיובי גרנולוציטים (+ CD45 + / 66b). צור עלילת בת (איור 3) בעוצמה פירוט בהירה לS. aureus (ציר x) לעומת עוצמת פירוט בהירה לפרץ חמצוני (DHE, ציר y) לזהות תת קבוצות של גרנולוציטים הופעלו. לאסוף brתמונות שדה ight בערוץ 1 ו -9, bioparticles בערוץ 2, בערוץ 4 DHE, 7AAD בערוץ 5, CD66b בערוץ 11, וCD45 בערוץ 12. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> איור 2. ניתוח תבנית. נתון זה הסדרה של מגרשים שנוצרו כדי לזהות תאים שהיו בפוקוס (), תאים בודדים (B), גרנולוציטים (C). חלקות נוספות המשמשות לזיהוי שלוש תת קבוצות של גרנולוציטים הופעלו נגד גרנולוציטים לא פעילים. כל הניתוח של קבצי תמונה שנרכשו הושלם באמצעות תוכנת v.6 רעיונות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes.">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li><li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response.">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li><li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li><li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li><li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-year+school-based+diet/exercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children.">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status.">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li><li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate-intensity,+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults.">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li><li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise:+implications+for+infection+risk.">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative.">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li><li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li><li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus.">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li><li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis:+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections.">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li><li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro.">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay.">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold/Flu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise.">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain.">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה הנוכחית מייצגת עידון של שיטות קיימות להערכת תפקוד granulocyte באמצעות זרימת cytometry 1,3,4,12-14. השלבים הקריטיים של assay זה נוטים להיות קשור לערבוב נכון של דגימת הדם עם bioparticles וDHE. ערבוב שלם יביא לתוצאות לא מדויקות. בעוד ערבוב מלא הוא קריטי, שיטת הערבוב צריכה להיות עדינה בטבע. הוא הציע כי הערבוב להתבצע באמצעות pipet אלקטרוני עם פונקצית ערבוב ולא מיקסר מערבולת. עוד צעד קריטי בassay הוא תמיד כדי להבטיח שאין דם מזהם את חיצו העליון של צינור assay. דם שיורית זו ניתן להסיר באמצעות המוליך כותנה שקצה סטרילי. הסרה מלאה היא חשובה משום שכישלון לעשות זאת עלולה לזהם את הכנת assay הסופית עם תאי דם אדום-lysed un. לפני השימוש בשיטה זו בקרות פיצוי הולמות יש להוסיף לשלוט על spחפיפה בין ectral חומרים כימיים המשמשים לזיהוי ההיבטים השונים של תפקוד granulocyte. לשיטה זו, בקרות פיצוי כרוכות לאסוף דגימות דם שהוצעו הדגירה assay 40 דקות ולאחר מכן תיוג עם סמן יחיד (כלומר, E. coli, DHE, וכו &#39;). לאחר תיוג, אירועים חיוביים יחידים נאספים ומטריצת פיצוי מופקת באמצעות אשף אוטומטי בתוכנת ניתוח רעיונות. זה קריטי, כי אם נעשה שימוש assay זה, בקרות פיצוי הולמות הושלמו כדי להבטיח ביצועי assay נכונים. ניתוח מתבצע באמצעות אשפי מאתר התכונה ושיתוף לוקליזציה לזהות שעוצמת פירוט בהירה היא משתנה הטוב ביותר להפריד בין האוכלוסיות וגם לזהות כמה חפיפה קיימת בין פרץ חמצוני ואותות phagocytosis. באופן ספציפי, השימוש בcytometry מבוסס תמונה סיפק את היכולת להפריד גרנולוציטים הופעלו לשלוש תת קבוצות. Tפירוט משנו נקבע באמצעות עוצמת פירוט בהירה של phagocytosis לעומת פרץ חמצוני. בנוסף לבחינת פונקציות תא היחידה אלה, תאים שהציגו שני אירועים באותו הזמן באותו מיקום האנטומי (שיתוף לוקליזציה) זוהו. גרנולוציטים שנפלו לקבוצת המשנה &quot;גבוה-האקטיבי&quot; היו פנוטיפ היחיד שהפגין שיתוף לוקליזציה עקבית בין phagocytosis ופרץ חמצוני. זיהוי זה של תת granulocyte מופעל הוא האזור הגדול ביותר שבו יש צורך בפתרון בעיות. זה מאוד חשוב עבור משתמש חדש כדי לקחת את הזמן כדי להבין את זרימת העבודה תהליך הדגימה ברעיונות ולהבין את המכניקה של gating אוכלוסיות תאים באמצעות רכיב ההדמיה. שינויים אחרים שהמשתמש יכול לנסות ולהפוך כוללים מבחר של פעמים דגירה assay חלופיות או נוספות. השיטה הנוכחית מצביעה על השימוש בתקופות של 10-40 דקות; עם זאת, בהתאם לדגם הניסיוני שבה שיטה זו היאכדי לשמש, זה עשוי להיות נחוץ כדי לבחור משכי assay עוד. כגון שינוי היית צריך להיות מוערך על בסיס פרטני. עוד נקבע כי משך הדגירה assay יש השפעה משמעותית על המראה של שלוש תת קבוצות הופעלו. הגישה המתוארת בדוח זה מייצגת הארכת איזה מידע ניתן להשיג בעבר לגבי תפקוד granulocyte 3,4,13,15. מעבדות אחרות לא הוכיחו את החשיבות של הערכת שינויים בתפקוד granulocyte כחלק מהערכה מקיפה של חסינות ומחלות 15-17. למרות הפוטנציאל של assay זה זה לא בלי מגבלות. אחת המגבלות העיקריות הוא דרישת עלות וזמן הקשורים גבוה מדגם עיבוד תפוקה. כאשר עיצוב מחקר דורש מספר רב של דגימות ביום נתון, אלה יכולים להיות קשים לעיבוד. עיבוד הוא יעיל על ידי השימוש במכשירים אלקטרוני וpipets,אבל אלה נוטים להיות יקרים ולא בהכרח זמינים בכל מעבדה. האזור שלנו של מחקר מתמקד במחקר של כמה פעילות גופנית והרגלי תזונה משפיעים על בריאות מערכת חיסונית ולתפקד 6,8-10,18-20. יש יעדים כגון השלכות מעשיות משמעותיות עבור מגוון רחב של תחומי בריאות אדם. מעבר ללימוד השפעות הפעילות הגופנית ולתזונה בשיטת phagocytosis הפגינה בכתב יד זה יכול להיות שימושית בתחומים אחרים של אימונולוגיה קלינית בי הניטור של תפקוד phagocytosis הוא קריטי לתוצאות טיפול. Assay הנוכחי הוא הראשון מני רבים שמבחנים אימונולוגיים עם הפוטנציאל להיות מחדש שהומצאו על ידי לקיחת יתרונות של מידע ההדמיה הייחודי שיכול להיות יכול מזרימה מבוססת תמונה cytometer.

גרנולוציטים מייצגים רכיב אחד של המערכת החיסונית של הגוף המולדת, אשר מספקת את קו הגנה הראשון נגד אנטיגנים פולשים. שיטות קודמות להערכת תפקוד granulocyte התמקדו בקיבולת phagocytosis או פרץ חמצוני בשיטות נפרדות, ולכן קשה לקבוע באופן קולקטיבי איך גרנולוציטים השתנו 1-4. התקדמות בתחום הזרימה cytometry הביאו בייצור של מכשירים המעבדתיים מסוגלים ברזולוציה גבוהה, הדמיה צבע רב של תאים באופן תפוקה גבוהה 5. היכולת לשלב הדמיה עם זרימה מסורתית cytometry מייצגת התקדמות שמספקת את הפלטפורמה הטכנולוגית הדרושה כדי לחדש בתוך זרימה הקיימת cytometry שיטות ולחלץ מידע חדש על המערכת החיסונית. במהלך עשר השנים האחרונות, המעבדה שלנו, בין יתר, התמקדה בחריפות על ההשפעה של patte התזונתי וטיפולי מימוש השוניםRNS על תפקוד מערכת חיסון מולדים 6-9. יש השיטה הוכיחה בכתב היד הזה השלכות מעשיות בתחום האימונולוגיה קלינית. השיטה הנוכחית ממנפת את הכח של הזרימה cytometry מבוסס תמונה למדוד phagocytosis של חלקיקי חיידקים ופרץ חמצוני בו זמנית. שימוש בגישה זו, אחד הוא מסוגלת להפריד גרנולוציטים מופעלים באמצעות משתנים הניתנים על ידי החלק מבוסס דמותו של הניתוח. תת אלה היו רק זיהוי לאחר הערכת התמונות הסלולריות על גרנולוציטים הבודדים. זמן הדגירה assay נוסף השפיע על המעבר בין תת הפעלת שלוש 10. לכן, זה מתקבל על הדעת ששימוש במספר רבה של פעמים דגירה עשוי לאפשר שיטה לבחון את השינוי בתפקוד granulocyte הבא טיפול ניסיון ספציפי. המטרה של כתב היד הזה הייתה להדגים שיטה של ​​פונקצית granulocyte הערכה באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה למדוד phagocytosis עם oxidat בו זמניתive פרץ.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>used for blood collection</td></tr><tr><td>WBC Fixative / RBC Lysis solution</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>clone G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>clone 2D1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;S. aureus&lt;/i&gt; bioparticles</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmalemide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematology Analyzer</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96-channel pipet</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Incubator</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Workstation</td><td>Dell Computers</td><td>Various</td><td>Used for IDEAS analysis</td></tr></tbody></table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה אפשר לנו להפריד בין אוכלוסייה הומוגנית של גרנולוציטים הופעלו לשלוש תת קבוצות שונות הפעלה (איור 3). בשיטה זו, הדרך היעילה ביותר לפתור את שלוש תת קבוצות ההפעלה היא על ידי התוויית עוצמת פירוט בהיר לphagocytosis (S. aureus) לעומת פרץ חמצוני (DHE) (איור 3; איור 4). כמו כן, שימוש באשף שיתוף הלוקליזציה בתוכנת רעיונות יאפשר לכימות של הנוכחות של phagocytosis בו זמנית ופרץ חמצוני, וזה סימן היכר של גרנולוציטים הופעלו מאוד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> זיהוי איור 3. של תת granulocyte הופעל. לאחר זיהוי של גרנולוציטים באמצעות סמנים על פני קרום תא (+ CD45 + / 66b), עלילת בת נוצרה עם inten פירוט הבהירsity לphagocytosis לעומת עוצמת פירוט בהירה לפרץ חמצוני. שימוש בגישה זו, אחוז לא פעיל (סגול), נמוך-אקטיבי (אדום,), מתון-אקטיבי (כחולה, B), וגרנולוציטים גבוהים פעילים (צהובים, C) נקבעו. טכניקת gating זה היה בשימוש גם על מנת להעריך את ההשפעה של זמן הדגירה assay בשפע היחסי של תת granulocyte הופעל השונים. האחוז הגבוה ביותר של גרנולוציטים &quot;גבוהים-אקטיביים&quot; היה נוכח הבא הדגירה 40 דקות. כל הניתוח של קבצי תמונה שנרכשו הושלם באמצעות תוכנת v.6 רעיונות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בנוסף הוכחת הנוכחות של שלוש תת קבוצות שונות של גרנולוציטים הופעלו, זה היה הראה כי זמן הדגירה assay השפיע השפע היחסי של כל תת-קבוצה גרנולוציטים הופעלה. באופן ספציפי, inc 40 דקותubation הביא את האחוז הגדול ביותר של גרנולוציטים &quot;גבוהים-אקטיביים&quot;. על ידי ובם לפחות שלושה משכי דגירה assay זה עשוי להיות אפשרי כדי לקבוע כיצד טיפול קליני ניתנו משנה את מצב ההפעלה הזמני של גרנולוציטים. זוהי השיטה הראשונה שפורסמה באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה לזהות תת granulocyte הופעל שונים כפונקציה של מדידות בו זמנית של phagocytosis ופרץ חמצוני. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> איור 4. נציגי תמונות של סמנים תאיים. גלריית תמונות של תאים שסווגו כגבוה פעיל (), מתון-אקטיבי (B), ונמוך-אקטיבי (C) מוצגות בנתון זה. Bioparticles S.aureus נמצאות בCh03 , פרץ חמצוני הוא בCh04, 7AAD לגרעין הוא בCh05, פיזור הצד הוא בCh06, CD66b הוא בCh11, וCD45 הוא בCh12. כמו כן, תמונת מיזוג-מקומי שיתוף של phagocytosis (Ch03) לעומת פרץ חמצוני (Ch04) מוצגת. תחומי צהובים בתמונה המיזוג לציין כי פרץ phagocytosis והחמצונים מתרחשים באותו המקום האנטומי באותו הזמן. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro at JoVE.com

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte<em&gt; במבחנה</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

image-based-flow-cytometry-technique-to-evaluate-changes-granulocyte

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.4K Views.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Video: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Neuroscience

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה כדי לזהות תרכובות לשבש קשירה של ליגנד כימוקין שכותרתו Fluorescently CXC 12 לקולטן כימוקין CXC 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Biology

Analyzing Basophil Activation in the Presence of a Test Allergen using Flow Cytometry

Source: Do&#241;a, I. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62600">Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we demonstrate the test to evaluate basophil activation in the presence of a test allergen using flow cytometry.

ניתוח הפעלת בזופילים בנוכחות אלרגן בדיקה באמצעות ציטומטריית זרימה

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Sample preparation

	Collect ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Source: Murinello, S. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54677">Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

מדידת ספיגה מיקרוגליאלית של חלקיקים פלואורסצנטיים המועברים תוך ויטראלית באמצעות ציטומטריית זרימה

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video