The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

NOT: Bu yöntemde açıklanan tüm kan toplama işlemleri Helsinki Bildirgesi çerçevesinde yapılan ve insan denekler için UNT kurumsal inceleme kurulu (KİK) tarafından onaylanmıştır. Tüm denekler, kan normal vücut ağırlığının, görünüşte sağlıklı olmasını sağlamak için, mevcut yöntemde kullanılan toplama, ve hastalık ücretsiz yazılı izin verdi. 1. Reaktif Kaynak &amp; Hazırlık <ol><li> Kullanım CD66b APC (klon # G10F5, DF = 1: 50) ve CD45-APCeFluor780 (klon # 2D1 = 1 DF: 50) Bu deney için. NOT: Bu çalışma öncesinde, CD45 ve CD66b antikorları optimum seyreltme belirlemek için titre edildi diğer lökositler açıkça çözülmesi granülositler (CD45 + / 66b +) (CD45 + / 66b-) 11. Boyama için seyreltilmiş antikorun ilave edilmesi üzerine tüpündeki son seyreltme 875 idi. </li><li> Satınalma ve stok S. çözülme aureus pHrodo kırmızı bir boya ile etiketlenmiştir bioparticles. 1 m&#39;lik bir konsantrasyonda askıya almasteril PBS içerisinde ml başına bioparticles g. Deneyde kullanılıncaya kadar kısım seyreltilmiş bioparticles ve mağaza -20 ° C&#39;de donduruldu. </li><li> Ug / ml, 10 nihai konsantrasyona kadar DMSO içinde, oksijen serbest radikal (örneğin, oksidatif patlama) mevcudiyetinde floresan etidyum bromite dönüştürülür dihydroethidium (DHE&#39;nin) içinde çözülür. </li><li> 200 mg / ml / ml 17.5 mg 2 adımlı sulandırma içinde steril PBS ile (belirli bir deney kuluçkalama süresi, aşağıdaki ek fagositoz önlemek için kullanılır), N-etilmaleimit karıştırın. Tahlilinde, 15 mM&#39;lik bir son konsantrasyon kullanılır. N-etilmaleimid çözülme sırasında N-etilmaleimid çözeltisi içinde kalmaz gibi, bir 37 ° C ısı bloğu kullanın. </li><li> Son tespit aşamasından sonra, nükleer DNA leke 7AAD kullanın. Önce eklenmesine, steril PBS ile stok 7AAD 01:10 sulandırmak. </li></ol> 2. Kan Numune Toplama <ol><li> Bir O / N hızlı (&gt; 8 saat) ve abstenti aşağıdaki laboratuvarda gelmesi konuları sorfiziksel aktivite (&gt; 12 saat) üzerinde. </li><li> Bir alkol hazırlık pad ile cilt temizlendikten sonra, bir periferik kol damarına bir steril kan toplama iğne takın. </li><li> Ticari sodyum heparin ile doldurulur boşaltılmış tüpler içine kan toplayın. </li><li> Toplandıktan sonra, deneğin koluna bir yapışkan bandaj uygulanır. </li><li> 10 kez karıştırın ve daha sonra analize kadar bir rocker yerleştirmek için kan tüpleri ters çevirin. </li></ol> 3. fagositoz Analiz tekniği <ol><li> Çözülme S. aureus bioparticles (RT) DHE&#39;nin (RT) ve N-etilmaleimit (37 ° C). </li><li> Steril kaput çalışırken 4 ayrı 1.2 ml tüplere S.aureus bioparticles 20 L ekleyin. </li><li> Bioparticles ihtiva eden her tüpe DHE 40 L ekleyin. </li><li> Yavaşça tüpün dibinde reaktifler toplamak için tezgah yüzeyinde tüpleri dokunun. </li><li> Bioparticles ve DHE dolu olan her bir tüpe karıştırılmış tam kan 100 ilave edin. </li><li>Herhangi bir kirletici kan çıkarmak için pamuklu bir uçlu bir aplikatör ile tüplerin iç kenarını silin. </li><li> Kan ilave edildikten sonra üç çevrim boyunca kan ve reaktifleri karıştırmak için ayarlanmış bir elektronik pipetiyle kan ve reaktifler karıştırılır. </li><li> Bir buz kovası tahlil tüplerini yerleştirin ve ışıktan korumak için kapak. </li><li> 10, 20 ve 40 dakika için deney tüpleri inkübe edin. Tüm deney tüpleri aynı anda bitirmek sağlamak için 40 dk tüp ile başlayın. </li><li> Çözülme N-etilmaleimid 37 ° C boncuk banyosunda. </li><li> Pipet her tahlil tüpüne (1.4 olarak yukarıda tarif edilmiştir), N-etilmaleimit 15 uL, 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Pipet CD66b-APC 10 L ve CD45-APCeFluor780 (1,1 yukarıda tarif edilen) ile seyreltildi antikorlar, 10 uL, 60 dakika inkübe edilir. </li><li> Pipet, her tahlil tüpü içine lökosit düzeltme / eritrosit lize çözeltisi 750 uL, 60 dakika inkübe edilir. </li><li> Santrifüj tahlil tüpleri (400 xg de 10 dakika) hücre pelet toplamak için. </li><li> Vakum bir kalıntı fl bırakarak, WBC lize / RBC düzeltme çözümü aspirehücre peleti üzerinde kimliği hacmi (100 uL). </li><li> Seyreltilmiş 7AAD (1,5 yukarıda tarif edilmiştir) çözeltisi, her deney tüpüne PBS içinde 50 L pipetleyin 10 L&#39;dir. </li><li> Buzdolabında bir folyo deney tüpleri, sarma borular kalibrasyon boncuk (~ 25 L) içinde her tahlil tüpüne yer kapaklar damla ve yer ekleyin. </li><li> Sitometrede görüntü tabanlı akışına örnek tüp yükleyin ve önceden tanımlanmış parametreler kullanılarak 3.000 granülosit olayların en az toplamak: Otonumuneleyici, mavi (488 nm; 60 mW), kırmızı (640 nm; 100 nW), SSC (785 nm; 8.5 mW) lazerler (Şekil 1). </li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Toplama Yöntemi ve Şablon. Örnekler (A) sitometrede bir görüntü tabanlı akış elde edildi. Iktisap sırasında, CD66b-APC vs Parlak Alan Aspect Ratio dot araziler istimal çivili kalibrasyon boncuk ayrılmış granülositlere üretildig INSPIRE v. 100.2.292.0 yazılım (B). Kırmızı, (640 nm; 100 nW), SSC (785 nm; 8.5 mW) lazerler; 5.000 granülosit az mavi bir otomatikörnekleyici&#39;den (60 mW 488 nm) kullanarak her numuneler için elde edildi. Histogramlar bir dizi lazer ayarları ve diğer veri toplamak yönlerini izlemek için satın alma sırasında mevcut olduğunu unutmayınız. Bu histogram tüm isteğe bağlı ve laboratuar standart işletim prosedürleri kalite kontrolü gibi onları gerektiriyorsa, sadece ihtiyaç vardır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 4. Numune Toplama ve Analiz <ol><li> Görüntülü dosyaları telafi (CIF) ham görüntü dosyaları (RIF) bir tazminat matris uygulamak ve oluşturmak için FİKİRLER yazılım otomatik yazılım tazminat sihirbazını kullanın. </li><li> FİKİRLER yazılım bireysel CIF dosyaları yükleyin ve granülosit alt kümeleri tanımlamak için aşağıdaki araziler oluşturmak: </li&gt; <li> Parlak bir alan degrade RMS (Şekil 2A) için bir histogram kullanarak odak olarak kabul edildi hücreleri belirlemek için ilk kapıları oluşturulması. Bir referans standart olarak uyarılmamış kontrol kullanılarak Her bir hasta örneği için, bu tayini yapmak. </li><li> Vs parlak bir alan bölgede (Şekil 2B) parlak bir alan boy oranı (genişlik vs hücre yüksekliği oranı) bir nokta arsa kullanarak enkaz ve ikili ayrı gömleğin hücrelere ikincil araziler kullanın. Bir referans standart olarak uyarılmamış kontrol kullanılarak Her bir hasta örneği için, bu tayini yapmak. </li><li> Hücrelerin temiz bir nüfus tespit edildiğini bir kez, olumlu (CD45 + / 66b +) granülositleri tanımlamak için CD66b vs CD45 (Şekil 2C) bir nokta arsa kurmak. S. parlak detay yoğunluğu bir kızı arsa (Şekil 3) oluştur aureus vs oksidatif patlama (DHE&#39;nin, y-ekseni) için parlak detay yoğunluğu (x ekseni) devreye granülosit alt kümelerini belirlemek için. Br toplayınKanal 1 ve 9 ight alan görüntüleri, Kanal 2 bioparticles, DHE Channel 4, 7AAD Kanal 5, CD66b Kanal 11, ve CD45 yılında Kanal 12. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Analiz Şablon. Bu rakam, odaklama (A) &#39;da olduğu hücreleri tanımlamak için oluşturulan parsellerin dizi, tek hücreler (B), granülositler (° C). Ek araziler aktive granülositler vs inaktif granülosit üç alt kümelerini belirlemek için kullanılmıştır. Elde edilen görüntü dosyalarının tüm analiz FİKİRLER v.6 yazılımı kullanılarak tamamlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes.">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li><li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response.">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li><li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li><li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li><li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-year+school-based+diet/exercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children.">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status.">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li><li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate-intensity,+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults.">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li><li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise:+implications+for+infection+risk.">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative.">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li><li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li><li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus.">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li><li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis:+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections.">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li><li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro.">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay.">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold/Flu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise.">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain.">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yöntem 1,3,4,12-14 flow sitometri kullanılarak granülosit fonksiyonunun değerlendirilmesi için mevcut yöntemler arıtma temsil eder. Bu deneyde kritik adım bioparticles ve DHE kan numunesinin uygun karıştırma ile ilişkili olma eğilimindedir. Eksik karıştırma doğru sonuçlara neden olur. Tam karıştırma kritik olsa da, karıştırma yöntemi doğada yumuşak olmalıdır. Bir karıştırma fonksiyonu yerine, bir girdaplı karıştırıcı ile bir elektronik pipet kullanılarak gerçekleştirilebilir karıştırma önerilmektedir. Tahlilde bir başka kritik adım her zaman tahlil borusunun üst yarısını kirlenmesine neden kan yoktur sağlamaktır. Bu kalıntı kan steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak temizlenebilir. Başarısızlık un-lize kırmızı kan hücreleri ile son tahlil hazırlık kirletebilir bunu çünkü tamamen çıkarılması önemlidir. Bu yöntemi, uygun dengeleme kontrol kullanmadan önce sp kontrol etmek için ilave edilmelidirgranülosit fonksiyonu çeşitli yönlerini tanımlamak için kullanılan reaktifler arasında ectral örtüşme. Bu yöntem için, dengeleme kontrol 40 dakika deney inkübasyon önerilen ve daha sonra tek bir işaretleyici ile etiketleme gibi kan örnekleri toplamak içerir (yani, E. coli, DHE&#39;nin, vs.). Etiketlemeden sonra, tek pozitif vaka toplanmış ve bir telafi matris Fikirler analiz yazılımı içinde otomatik bir sihirbaz kullanarak oluşturulur. Bu deney kullanılırsa, uygun tazminat kontrolleri Uygun test performansının sağlanması için tamamlanmış olması önemlidir. Analiz parlak detay yoğunluğu popülasyonları ayırmak için en iyi değişken olduğunu belirlemek ve aynı zamanda çok örtüşme oksidatif patlama ve fagositoz sinyalleri arasında mevcut nasıl tanımlamak için özellik bulucu ve ortak yerelleştirme sihirbazları kullanılarak gerçekleştirilir. Özellikle, görüntü tabanlı sitometri kullanımı üç alt kümeleri içine aktif granülositleri ayırmak yeteneği sağladı. TOnun alt kümesi arıza oksidatif patlama vs fagositoz parlak detay yoğunluğu kullanılarak belirlenmiştir. Tekil hücre fonksiyonlarını incelemek ek olarak, aynı anatomik konum (eş-lokalizasyonu) &#39;de, aynı zamanda her iki olayı sergilenen hücreler tespit edilmiştir. &quot;Yüksek-aktif&quot; alt kümesi içine düştü granülositler fagositoz ve oksidatif patlama arasında tutarlı ortak yerelleştirme gösterdi tek fenotip vardı. Aktive granülosit alt gruplarının Bu tanımlama giderme gerekli büyük alandır. Yeni bir kullanıcı FİKİRLER örnek süreç iş akışı anlamak için zaman ayırın ve görüntüleme bileşenini kullanarak hücre popülasyonlarının yolluk mekaniğini anlamak için çok önemlidir. Bir kullanıcı yapmak isteyebilir Diğer değişiklikler alternatif veya ek tahlil inkübasyon sürelerinde seçimini içerir. Mevcut yöntem 10-40 dakika süreleri kullanımını önerir; Bununla birlikte, deney modeline bağlı olarak, bu yöntem, buradakullanılmak üzere, daha uzun deney süreleri belirlemek için gerekli olabilir. Böyle bir değişiklik bireysel olarak değerlendirilmesi gerekir. Ayrıca bu tahlil inkübasyon süresi üç aktive alt kümelerinin görünümü üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu raporda açıklanan yaklaşım daha önce granülosit fonksiyonu 3,4,13,15 ilgili elde edilebilir hangi bilgilerin bir uzantısı temsil eder. Diğer laboratuvarlar dokunulmazlık ve hastalığın 15-17 kapsamlı bir değerlendirmesinin bir parçası olarak granülosit fonksiyonu değişiklikleri değerlendirmek önemini göstermiştir. Bu tahlilin potansiyeline rağmen bu da kısıtlı tarafları yok değildir. Büyük sınırlamalar biri yüksek numune hacmi işleme ile ilişkili maliyet ve zaman talebidir. Bir çalışma tasarımı, belirli bir günde numune çok sayıda gerektirdiğinde, bu işleme tabi tutmak zor olabilir. İşleme elektronik pipetleri ve dağıtıcılar kullanımı ile aerodinamik,ancak bu pahalı olma eğilimindedir ve her laboratuarda mutlaka mevcut değildir. Araştırma alanımız egzersiz ve beslenme alışkanlıkları bağışıklık sistemi sağlığını etkileyen ve 6,8-10,18-20 işlev nasıl bir çalışma üzerinde duruluyor. Bu tür hedefler, insan sağlığı alanlarında çeşitli önemli pratik etkileri vardır. Fagositoz fonksiyonu izlenmesi tedavi sonuçlarının kritik olduğu egzersiz ve beslenme etkileri çalışmanın ötesinde, bu yazının gösterdiği fagositoz yöntemi klinik immünoloji diğer alanlarda yararlı olabilir. Bu deney potansiyeli ile immünolojik testler sitometrede bir görüntü tabanlı akıştan olabilir olabilir eşsiz görüntüleme bilgileri avantajlarını alarak yeniden icat edilmesi pek çok ilki.

Granülositler işgalci antijenlere karşı ilk savunma hattını sağlar vücudun doğal bağışıklık sisteminin bir bileşeni temsil eder. Granülosit fonksiyonu değerlendirmede Önceki yöntemler granülositler 1-4 değişti nasıl zor topluca tespit yapma, ayrı yöntem kullanılarak fagositoz kapasitesi veya oksidatif patlama üzerinde duruldu. Akış alanındaki gelişmeler, sitometrisi veren yüksek işleme kapasiteli bir şekilde 5 hücrelerin yüksek çözünürlüklü, renkli görüntüleme kapasitesine sahip tezgah üstü aletleri üretimi ile sonuçlanmıştır. Geleneksel akışı ile görüntüleme birleştirmek için yeteneği sitometri yöntemleri sitometri mevcut akış içinde yenilik ve bağışıklık sistemi ile ilgili yeni bilgiler elde etmek gerekli teknolojik bir platform sağlayan bir gelişmeyi temsil etmektedir. Son on yılda, diğerleri arasında, bizim laboratuar, hevesle çeşitli beslenme ve egzersiz tedavileri patte etkisi üzerinde durulmuşturDoğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu 6-9 RNS. Bu yazıda gösterdiği yöntem, klinik immünoloji alanındaki pratik etkileri vardır. Bu yöntem aynı zamanda bakteriyel parçacıklar ve oksidatif patlama fagositozunu ölçmek için görüntü tabanlı akış sitometri gücünü güçlendirir. Bu yaklaşımı kullanarak, bir analiz görüntü tabanlı bölümü tarafından sağlanan değişkenleri kullanarak aktive granülositleri ayırmak mümkün değildir. Bu alt kümeler bireysel granülositlere hücresel görüntüleri değerlendirirken sonra sadece tanımlanabilir vardı. Daha fazla tahlil inkübasyon süresi üç aktivasyon alt grupları 10 arasında geçişi etkilemiştir. Böylece, birden fazla inkübasyon sürelerinde kullanımı yöntemi, belirli bir deneysel tedavi aşağıdaki granülosit fonksiyonu değişikliği test etmek için izin verebilir olması akla yakındır. Bu yazının amacı, aynı anda oksidatif işlem ile fagositoz ölçmek için görüntü tabanlı akış sitometrik kullanarak değerlendiren granülosit fonksiyonu bir yöntem göstermektiive patladı.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>used for blood collection</td></tr><tr><td>WBC Fixative / RBC Lysis solution</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>clone G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>clone 2D1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;S. aureus&lt;/i&gt; bioparticles</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmalemide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematology Analyzer</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96-channel pipet</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Incubator</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Workstation</td><td>Dell Computers</td><td>Various</td><td>Used for IDEAS analysis</td></tr></tbody></table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Görüntü tabanlı akış sitometrik kullanarak bize üç farklı aktivasyon alt grupları (Şekil 3) içine aktif granülosit homojen bir nüfusa ayırmak için izin verdi. Bu yöntemde, en etkili yolu, üç aktivasyon alt kümelerini oksidatif patlama vs (S. aureus) (DHE&#39;nin) (Şekil 4 Şekil 3) fagositoz için parlak detay yoğunluğu çizerek olduğunu çözmek için. Ayrıca, FİKİRLER yazılım co-lokalizasyon sihirbazın kullanımı son derece aktif granülosit damgasını işaretidir eşzamanlı fagositoz ve oksidatif patlama varlığı, ölçümü için izin verecektir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> Aktif Granulosit Alt Grupları Şekil 3. Tanımlama. Hücre-yüzey belirteçleri (CD45 + / 66b +) kullanarak granülosit tanımlanmasından sonra, bir kızı arsa parlak detay niyet etme ile oluşturulmuşturoksidatif patlama için parlak detay yoğunluğu vs fagositoz için versitesi. Bu yaklaşım, etkin (mor), düşük aktif maddenin yüzdesi (kırmızı, A) orta aktif kullanarak (mavi, B) ve yüksek aktif (sarı, C), granülositler belirlenmiştir. Bu geçit tekniği de çeşitli aktif granülosit alt-görece bolluğu ile deney kuluçkalama süresi etkisini değerlendirmek için kullanıldı. &quot;yüksek-aktif&quot; granülosit yüzdesi en yüksek 40 dakika inkübasyon aşağıdaki mevcuttu. Elde edilen görüntü dosyalarının tüm analiz FİKİRLER v.6 yazılımı kullanılarak tamamlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Aktif granülosit üç farklı alt-gruplar varlığını gösteren ek olarak, bu deney, kuluçkalama süresi, her aktif granülosit alt-görece bolluğu etkilediği gösterilmiştir. Spesifik olarak, 40 dakika Inc.ubation &quot;yüksek-aktif&quot; granülosit büyük yüzdesi ile sonuçlanmıştır. En az üç tahlil inkübasyon süreleri dahil ederek verilen bir klinik tedavi granülosit zamansal aktivasyon durumunu nasıl değiştirdiğini belirlemek mümkün olabilir. Bu fagositoz ve oksidatif patlama, aynı anda ölçümlerin bir fonksiyonu olarak farklı aktif granülosit alt kümelerini tanımlamak için görüntü bazlı akış sitometrik kullanarak ilk yayınlanmış bir yöntemdir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> Hücresel Markerlerinin Şekil 4. Temsilcisi Görüntüler. Yüksek aktif (A) olarak sınıflandırılan hücrelerin bir resim galerisi, orta-aktif (B), ve düşük-aktif (C) Bu şekilde sunulmaktadır. S.aureus bioparticles Ch03 vardır oksidatif patlama CD66b olduğunu, yan dağılım Ch06 olduğunu, çekirdeğin için 7AAD Ch05 olduğunu, Ch04 içindeCH11 ve CD45 CH12 bulunmaktadır. Ayrıca, oksidatif patlama vs fagositoz (Ch03) (Ch04) eş-lokalize birleştirme görüntü gösterilir. Birleştirme görüntünün sarı Alanları bu fagositoz ve oksidatif patlama aynı anda aynı anatomik alanda yaşanıyor göstermek. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro at JoVE.com

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin<em&gt; İn Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

image-based-flow-cytometry-technique-to-evaluate-changes-granulocyte

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.4K Görüntüleme.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Video: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Nörobilim

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Biyoloji

Analyzing Basophil Activation in the Presence of a Test Allergen using Flow Cytometry

Source: Do&#241;a, I. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62600">Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we demonstrate the test to evaluate basophil activation in the presence of a test allergen using flow cytometry.

Flow Sitometri Kullanarak Bir Test Alerjeni Varlığında Bazofil Aktivasyonunun Analiz Edilmesi

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Sample preparation

	Collect ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Hücresel İmmünodiyagnostik

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Source: Murinello, S. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54677">Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İntravitreal Olarak Verilen Floresan Partiküllerin Mikroglial Alımının Ölçülmesi

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler