Name: assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2016-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
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Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.

모든 동물은 스크립스 연구소에 의해 설립 된 윤리 지침에 따라 처리 하였다. 사출 용 재료 1. 준비 <ol><li> 33 G 바늘과 주사기를 소독 : C. ο 115 분해 및 오토 클레이브 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)의 상승에 의해 주사 바늘을 준비합니다. </li><li> 10 분 - 5 상온에서 형광 표지 된 입자를 녹여. 칼슘 / 마그네슘 2+와 멸균 PBS에서 50 ㎎ / ㎖ 용액에 재구성하여 주입 입자 용액을 준비합니다. 참고 : 식균 작용 분석을위한 검증 된 곰팡이 원산지 AF488 표지 입자는이 프로토콜 21-23에 사용됩니다. 최적의 흡수를 들어, 신선하고 즉시 주입하기 전에 입자를 준비합니다. 주 2 : 입자 농도는 각각의 특정 실험을 위해 최적화 될 수있다. </li></ol> 구슬 솔루션 2. 유리체 강내 주입 참고 : 두 페이지eople 방식으로, 주입을 수행하기 위해 요구되도록 다른 사람이로드 된 주사기를 통과하고, 상기 플런저를 가압하는 동안, 마우스를 길게 안구의 초점을 유지할 수있는 주입을 수행하는 사람. <ol><li> 20 μL / 체중 10 g의 투여 량으로 100 ㎎ / ㎖ 케타민 10 ㎎ / ㎖의 자일 라진 복강 내 주사하여 쥐를 마취. 주입 전에 마취의 수준을 평가하기 위해 발가락 핀치를 사용합니다. 참고 : 아이소 플루 란은 골수 세포 기능에 큰 효과가있다, 따라서,이 분석을 통해 그것의 사용은 24, 25을 피해야한다. </li><li> 0.5 μL의 형광 표지 된 입자 용액과로드 바늘. </li><li> 옆으로 수술 현미경 (그림 1A-B)에서 마우스를 놓습니다. 마우스의 더 나은 위치에 대한 부드러운 소재, 예를 들면, 젤 팩을 사용합니다. 눈이 아직 열려 있지있는 젊은 쥐를 들어, 부드럽게 fissu을 만들어 좋은 45 오 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀을 엽니 다이로부터 눈꺼풀 것이다 결국 오픈 슬릿을 따라 다시. <ol><li> 안구가 소켓에서 약간 튀어 있도록 각도 오 (45) 미세 집게의 도움으로 조심스럽게, 눈꺼풀 주위에 압력을 적용합니다. 그냥 귀 위의 두 손가락과 턱으로 머리를 잡고 조심스럽게 소켓에서 약간 눈을 유지하기 위해 눈꺼풀에 병렬로 피부를 스트레칭. 목 (그림 1B)에 너무 가까이 파악하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> (각막과 공막을 연결하는 지점) 각막 윤부에서 주사기의 바늘을 삽입, 안구 천공합니다. 이 색소 마우스의 회색 원으로 표시됩니다. 유리 체액의 작은 볼륨을 추방하고 주입하기 위해 약간의 바늘을 철회. 부드럽게 한 손으로 다른과 바늘로 마우스를 보유해야 주입을 수행하는 사람; 두 번째 사람은 천천히 플런저를 밀어해야합니다. </li><li> 천천히 주사기를 철회. 적용을 눈 보습은 수화 눈을 유지하기 위해 삭제합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 설치류는 열 패드를 통해 새장에 복구하고 동물을 계속 모니터링 할 수 있습니다. 새끼와 함께 작업을하면, 호흡과 자발적 운동 할 때까지 다른 경고 동물 케이지에 동물을 반환하지 않습니다. 성인과 함께 작업하는 경우가 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지, 다른 경고 동물 케이지에 쥐를 반환하지 않습니다. </li></ol> 망막 조직의 3 수확 주 : 형광 표지 된 입자 주입하지 눈의 망막 조직을 유세포 분석 대조군으로 수집되어야한다. 분석은 단일 망막을 사용하여 수행 될 수 있지만, 최적의 성능을 위해 두 개의 망막 함께 풀링한다. <ol><li> 형광 표지 된 입자의 유리체 강내 주입 후 망막 조직 3 시간을 수집합니다. 참고 : 입자 용액의 주입 후 시간이 각각의 특정 실험에 최적화 될 수 있지만, 우리는 3 시간 주사 후, 입자의 흡수는 O 대부분의 계층에서 볼 수 있다는 것을 발견망막 (그림 1C-D) 바. </li><li> 경추 탈구로 쥐를 희생. </li><li> 부드럽게 안구를 proptose하기 좋은 45 오 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀에 눌러 안구를 수집합니다. 안구 및 풀 뒤 집게를 놓습니다. </li><li> 해부 현미경으로 망막을 해부하다. 칼슘 / 마그네슘 2+ PBS 소량을 함유하는 페트리 접시에 안구 전송. 페트리 접시의 건조 지역에서 극상 집게의 끝 각막 윤부에서 안구를 관통. </li><li> 각막 윤부 둘레의 약 절반이 절단 될 때까지, 좋은 45 오 각도 집게의 도움으로 안구를 잡고 각막 윤부 주위에 잘라 봄 가위를 사용합니다. </li><li> 벌금 45 오 각도 집게로 안구를 잡고 PBS로 안구를 가져온다. 좋은 45 오 각도 집게의 두 번째 쌍으로 떨어져 각막과 공막 눈물. 렌즈와 망막이 나올 나는 것의 ntact. </li><li> 렌즈와 망막을 분리합니다. 망막 모아서 칼슘 / 마그네슘 2+ PBS 2 ㎖을 함유하는 5.4 ml의 폴리스티렌 시험관에 옮긴다. </li></ol> 4. 단일 세포 현탁액을 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 약간의 수정과 신경 조직 분리 키트를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 요약하면, 최대 피펫 팅 및 P1000 피펫과 함께 아래로 흔들어없이 37 ℃로 효소 소화를 수행하여 씹다 망막. </li></ol> 유세포 분석 5. 염색 단일 세포 현탁액 <ol><li> 염색 완충액 200 μL에 재현 탁 셀은 U 바닥 96 웰 플레이트 및 전사 (0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 0.09 %의 아 지드 화 나트륨을 가진 둘 베코 인산염 완충 염수). 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 참고 : 나트륨 아 지드는 인간과 환경에 유해한입니다. 적절한 개인 보호 장비 a를 사용하여차 지역 규정에 따라 폐기물을 폐기합니다. </li><li> 상층 액을 버리고 싱크대 위에 접시를 반전. 5 ㎍ / 항 - 마우스 CD16 / CD32 항체 ml의 웰 당을 포함하는 얼룩 버퍼의 25 μL로 된 Fc 수용체에 resuspend 세포를 차단합니다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 항 - 마우스 Ly6C-APC-Cy7 0.5 ㎍ / ml의 항 - 마우스 Ly6G-PE-Cy7 0.5 ㎍ / ㎖의 항 - 마우스 CD11b를-AF650의 2.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 25 μl를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. </li><li> 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 상층 액을 버리고 접시를 반전. 염색 버퍼의 200 μl의 세포를 재현 탁하여 씻으십시오. </li><li> 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 요오드화 프로피 듐 (PI), 0.5 ㎍ / ml를 함유 염색 완충액 200 μL에 재현 탁. 1.2 ml의 마이크로 타이 튜브에 전송합니다. </li><li> 의 이전 200 μL와 PI 및 수영장 0.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 추가 100 μL와 우물을 씻으십시오1.2 ml의 마이크로 타이 튜브. 염색 된 세포 300 μl의 총 부피를 얻을 수있다. </li></ol> 6. 유세포 분석 <ol><li> 기존의 세 가지 레이저 (보라색, 파란색과 빨간색 레이저)를 사용하여, PE,를 PerCP-Cy5.5, BV510, 그리고 매우 밝은 형광 AF488 입자에서 상당한 파급에 의한 PI 염료을 피하십시오. 그것은 (대신를 PerCP-Cy5.5 채널의 mCherry 채널)은 PE 표지 항체 및 PI 수 있습니다로 (그림 2)를 사용,이 분석을 최적화하기 위해 네 번째 (노란색) 레이저를 사용합니다. 참고 : 옐로우 레이저를 사용할 수없는 경우, 다른 채널에서 죽은 세포 제외 염료를 사용합니다. </li><li> PI 부정적인 세포 (PI-)에 게이트 죽은 세포 (그림 2B)를 제외합니다. </li><li> 죽은 세포, CD11b를 양성 세포 (CD11b를 +)에 게이트를 제외하면이 모든 골수 세포 (그림 2C)를 포함한다. </li><li> Ly6C에 CD11b를 + 인구, 게이트 내 - / Ly6G는 - 제외 할호중구 (CD11b를 + / Ly6G +)와 단핵구 (CD11b를 + / Ly6C +도 2D). 미세 아교 세포 (- / Ly6G - 여기 CD11b를 + / Ly6C로 정의 단순화를 위해)에 게이팅 후,이 명확 인구가 볼 수 있어야합니다; 음 하나는 형광 표지 된 입자 긍정적. 식세포 입자를 촬영 한 것입니다 AF488 + (그림 2E)는 그러므로 있습니다. 주 : 양수 또는 Ly6C Ly6G 양성 집단의이 염색 방법을 사용하여 입자의 흡수를 측정하기 위하여 분석 될 수있다. 식세포는 CD11b + 세포의 비율은 식세포 미세 아교 세포의 비율 (그림 2 층)과 잘 상관 관계. 이 균성 호중구 및 단핵 세포뿐만 아니라, 미세 아교 세포를 포함 불구 유세포 경험이없는 연구자 단독는 CD11b 염색과 간단한 분석이 수행 될 수있다. / Ly6G - -이 CD11b를 + / Ly6C 내 &lt;/ SUP&gt; 인구, 마커 F4 / 80과 CX3CR1 염색에 의해 판단 이러한 세포가&gt; 99 % 미세 아교 세포이다; 이러한 마커를 추가하지만 우리의 손에 필요하지 않습니다 수 있습니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 방법의 세 가지 중요한 단계가 있습니다 형광 표지 된 입자 (1) 유리체 강내 주입; (2) 수확 망막 조직의 제조; (3) 세포 계측 분석을 흐른다. 우리는 연구자들이 우리가 여기서 제시하는 방법을 수행하기 전에 유리체 강내 주사를 연습하는 것이 좋습니다. 알비노 마우스 (예를 BALB / c) 및 착색 된 용액 (예를 들어, 형광 표지 된 입자) 바늘로 쉽게 시각화 주사 용액에 사용될 수있다. 유리체 강내 주사는 도전하고 수행이되지 않을 경우 제대로 편견과 변수의 결과로 이어질 것입니다. 가난한 사출 기술과 관련된 일반적인 문제는 출혈과 염증이 발생할 수 있습니다 망막에 렌즈 및 / 또는 손상의 천공 있습니다. 안구 외상의 위험을 최소화하기 위해, 설치류 최소한 헤드 운동 안정된 위치에 있어야한다. 안구 침투 주사기 천천히 삽입 타격하지 않도록 너무 멀리 가압되어야렌즈. 또 다른 일반적인 합병증은 눈 밖으로 주입 물질의 역류이다. 이를 방지하기 위해 상기 플런저 사출 후에 안구는 눈구멍으로 후퇴하도록 허용되어야하며, 주사기를 서서히 후퇴한다 천천히 눌려져한다. 가장 강내 주사는 낮은 수준의 미세 아교 세포를 활성화하지만, 치료 및 치료 군 들간의 차이를 측정 할 수있다. 이는 적절한 제어 (예를 들어, 비 도전 쥐) 기준 식세포 레벨을 확립하기 위해 각각의 실험에 사용하는 것이 필수적이다. 연습이 필요이 방법의 또 다른 측면은 망막 박리된다. 표본에서 유사한 단일 세포의 준비를 보장하기 위해, 망막 조직은 신속하고 최소한의 가능한 조직 중단 수집해야합니다. 수집을 용이하게 - PBS의 해부의 마지막 단계를 수행 (3.7 3.4 참조). 마지막으로, 유동 세포 계측법 정확하게 망막 조직을 제조하는 것이 중요하다. 활성화 된 미세 아교 세포가 된 Fc를 상향 조절항체의 Fc 부분에 결합하는 수용체 이에 비특이적 7을 발생할 수있다. 된 Fc 블록은 비특이적 염색을 방지하기 위해 수행되어야한다. 적절한 형광 및 설정 보상의 선택은 또한 27 중요합니다. 우리는 정기적으로이 실험을 위해 10 ~ 20 출생 후의 일 세 마우스를 사용합니다. 그러나이 프로토콜은 성인 마우스 (도 3c)에서 소교 식세포 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다. 모든 약 5 %의 성인 (보다 - (모든 CD11b를 + 세포의 50 %를 약 40)으로 인해 hyaloid 혈관의 존재에 참고, 중, 외래 골수 세포 (Ly6C + 또는 Ly6G +)의 인구는 젊은 쥐에서 더 눈에 띄는 CD11b를 + 세포). 연구진은 실험에 가장 적합한 나이를 결정해야한다. 여기에 제시된 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 탐식 레벨 강력한 검출을 허용한다. 그러나, 우리는 그 세 네 생물에게 추천Al을 각각의 실험에 사용되는 복제하고, 적어도 3 개의 독립적 인 실험을 수행한다. 이 프로토콜에서 사용되는 입자는 식세포 분석 21-23 대한 검증되었지만 추가 검증이 필요한 경우, 특정 식세포 마커 입자의 면역 공동 지역화 수행 될 수있다. 이 방법의 하나의 잠재적 인 제한은 입자 미세 아교 세포의 차동 접근이다. 정상 망막, 미세 아교 세포는 두 개의 층, 깊은 외측 얼기 층 및 유리체 7에 근접할수록 표면 내측 얼기 층에 있습니다. 자극시, 또는 노화 동안, 미세 아교 세포는 모든 망막 층에 걸쳐 마이그레이션 할 수 있습니다. 이 방법에서, 형광 표지 된 입자 유리체 내에 주입된다. 세 시간 주입 한 후이 망막 전반에 걸쳐, 특히 vitreal 표면을 따라 입자의 축적을 초래한다. 연구진은 더 concentrati을 최적화 할 수있다그들의 실험 주입 후 입자 또는 시간에. 이 유리체에 가까운 근접에서 미세 아교 세포가 입자에 쉽게 액세스 할 가능성이 높습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 입자가 망막에 걸쳐 확산과 아마도 제한된 비드 액세스 (그림 1C-E)에, 모든 계층에 걸쳐하지만 망막 색소 상피 (RPE) 세포에서 미세 아교 세포에 의해 흡수되는 것으로 나타났다. 우리는 (나이가 누적 될 수 있습니다) 망막 미세 아교 세포가 입자에 액세스 할 지 여부를 결정 못하고있다. 이 연구자 중요한 경우,이 프로토콜은 입자의 조심 망막 주입 후에 수행 될 수있다. 또 다른 중요한 고려 사항은 CNS의 다른 지역의 망막 미세 아교 세포 및 미세 아교 세포 사이 본질적 다양한 동작이있을 수 있다는 것이다. 또한 뇌의 특정 영역이 다른 질환 감수성있는 것으로 알려져있다. 예를 들어, 파킨슨 병에서 흑질 신경 세포 주로 Alz로에 동시에 영향HEIMER 병은, 해마 신경 세포는 대부분 (28)의 영향을받습니다. 특정 질환의 병리학을 연구 할 때 즉, 뇌 영역이 중요한 요소가 될 것으로 예상된다. 여기에 설명 된 것과 유사한 프로토콜은 망막과 뇌 미세 아교 세포의 탐식 반응에 잠재적 인 차이를 탐구하는 두개 내 주사 후 수행 될 수있다. 망막은 혈액 망막 장벽 (20)의 존재를 포함하는 뇌의 다른 지역과 많은 공통 기능을 가지고 있습니다. 망막 미세 아교 세포 및 뇌 미세 아교 세포는 같은 난황 전구 세포에서 유래와 형태 및 세포 표면 마커의 발현 7,29과 관련하여 매우 유사하게 나타납니다. 또한, 몇몇 뇌 질환 (예, 알츠하이머 병, 뇌졸중, 및 다발성 경화증)이 망막도 20에 영향을 나타내는 안구 증상이있다. 연구자들은 잠재적 인 지역적 차이에주의해야하지만, 우리는이에 대한 정보 모델이라고 생각모든 미세 아교 세포의 연구, 소교 식균 작용을 연구하는 모든 신경 과학자가이 프로토콜을 사용할 수 있음을 시사한다. 눈이 분석을 수행하는 뚜렷한 장점은 여러 기술들은 다양한 망막 신경 인성 응력을 유도하기 위해 개발되었고, 스트레스 반응은 표준 프로토콜을 사용하여 (30), 생체 내에서 모니터링하고 정량화 될 수 있다는 것이다. 여기에 설명 된 분석을 신경성 스트레스를 유도하고 수행함으로써, 연구진은 정도에 차이가 모욕의 광범위한 스펙트럼에 걸쳐 미세 아교 세포의 기능을 분석 할 수 있습니다. 정렬 기술 유세포과 결합 될 때 마지막으로,이 프로토콜은 식세포 미세 아교 세포 (예, qPCR에, 세포 배양, 프로테오믹스)의 깊이 분석을 허용 할 수있다 면역 위에 이점을 갖는다. 입자의 흡수 이전 식세포 기능 모두 시험 관내 및 생체 내 시스템에서 측정에 사용되었다. 라라 자세 히 입자, 수확 및 뇌 조직, 냉동 절편, 면역, 이미징 및 사후 영상 분석 (18)의 동결 두개 내 주입을 포함했다. 여기에 제시된 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 식세포의 기능을 훨씬 빠르게 정량화 수 있습니다. 이는 고감도 미세 아교 세포는 생리 문맥 탐식 기능의 평가를 허용 이들 미세로부터 제거되지 않는 시험 관내 시스템에 비해 이점을 갖는다. 구체적으로는 다른 세포 유형의 결함 (예, 신경 세포에서 유전자의 유전 적 절제가) 미세 아교 세포의 식세포 기능에 영향을 미치는 방법의 테스트를 사용하도록 설정해야합니다. 그것은 또한 식세포 세포 집단의 정량 빠르고, 정확한 검출을 가능 유세포 사용하여 생체 내 분석을 통해 이전의 이점을 갖는다.

이 방법의 전반적인 목표는 정확하게 평가하고 생체 내 미세 아교 식균 작용에 정량화하는 것입니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 조직 거주자 대식 세포이다. 이들은 조직의 항상성의 유지를 보장하기 위해 다양한 기능을 수행한다. 이러한 면역 감시, 신경 영양 인자의 분비의 중요한 중요성, 식세포 작용 (1)을 포함한다. 소교 식세포는 관련이없는 시냅스 (시냅스 가지 치기) 및 세포 사멸 뉴런 2-4의 제거 식균 작용으로 뇌와 망막의 개발하는 동안 몇 가지 중요한 사건의 열쇠입니다. 또한, 손상 또는 사멸 신경 세포 파편 및 침입 미생물 소교 식세포는 성인 1-5 CNS 항상성 유지에 필수적인 것으로 나타났다. 마지막으로, 소교 탐식 알츠하이머 병 및 나이 관련 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 병인에 연루되어있다이 결함이 있거나 불충분 식세포 용량이 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 드루 젠, 각각 6, 7의 축적에 기여할 수 있음을 제안하고있다 황반변. 소교 함수 단단히 특히 종양 성장 인자 β 또는 세포 간 상호 작용과 같은 가용성 인자에 의해 그 미세 환경에 의해 조절된다. 미세 아교 세포가 독점적으로 각각의 수용체 CD200R 및 CX3CR1을 표현하면서 뉴런은 구조적으로, 이러한 CD200 및 CX3CL1 등 여러 가지 세포 표면 리간드를 표현한다. 이 수용체는 세포 내 부분에 면역 수용체 티로신 기반 금지 모티브 (ITIMs)를 포함한다. 이러한 수용체는 신경 염증에 기여할 수있는 미세 아교 세포의 과도한 자극을 방지하기위한 중요한 억제제. 따라서, 정상적인 생리적 조건 하에서, 뉴런 및 미세 아교 세포 간의 세포 - 세포 상호 작용은 정지 상태에서 미세 아교 세포를 유지한다. 조직 손상 동안, 그러나, 뉴런 EXP을 하향 조절할 수있다이러한 리간드 ression, 미세 아교 세포 활성에 미치는 억제 효과를 제거하는 단계를 포함한다. (식균 작용 포함) 소교 기능 따라서 밀접하게 자신의 미세 환경 (8)에 연결되어 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지, 생리 학적 맥락에서 또는 완전히 자신의 CNS의 미세 환경을 복제하는 방식으로 미세 아교 세포의 식세포 작용을 연구하는 표준화 된 시험 법이 없습니다. 여러 분석은 차 미세 아교 또는 소교 세포주 표적 세포 (예를 들면, 신경 세포 사멸) 또는 형광 표지 구슬 배양 시험관에 미세 아교 세포의 탐식 활성을 측정하기 위해 개발되었다. 목표 흡수 후 형광 현미경 영상을 사용하거나 계측법 9-12 흐름 평가된다. 이러한 분석은 약물이나 유전자 조작이 유익한 동안, 완전히 생체 내 환경에서 복잡한을 복제하는 데 실패, 소교 식균 작용에 영향을 미칠 수있는 방법의 테스트를 할 수 있습니다. 소교 식균 작용을 검사하는 간접 방법생체 내에서보고되었다 : 이들은 미세 아교 세포 및 대상 식균 작용에 대한 (예를 들어, 손상된 신경 세포 나 시냅스 요소)의 물리적 인 근접성을 평가, 식세포 작용 (예를 들어, CD68)에 관여하는 것으로 생각 분자의 염색에 의해 수행, 또는 식세포의 면역 검출로되어있다 소교 세포 내 표적 (예를 들면, Aβ) 13-17. 두 연구는 생체 내에서 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하기 위해보다 직접적인 방법을 사용했다. 휴즈와 동료들은 두개 내 경로 (18)를 통해 전달 구슬의 소교 흡수를 측정하는 이미징 기술을 사용했다. 시에라는 등. 정량적으로 복잡한 이미징 기술 4를 사용 사멸 세포의 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하는 세련된 방법을 개발했다. 그러나 이러한 방법은 조직 준비, 절편, 이미징 및 분석을위한 복잡한 프로토콜을 포함한다. 우리는 이전에 알아 감광체의 식균 작용을 평가하기 위해 유세포 분석을 사용한문화 19 망막 색소 상피 (RPE) 세포에 의한 어 세그먼트. 여기서 우리는 신속하게 생체 내 미세 아교 세포의 식균 작용의 정량적 측정으로 망막 미세 아교 세포로의 형광 표지 된 입자 흡수를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다. 형광 표지 된 입자 (1) 체내 전달, (2) 수확 및 망막 조직의 준비, (3) 흐름 : 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 신뢰할 수있는 정량적 세 가지 중요한 단계의 바로 아래 6 시간 망막 미세 아교 식균 작용의 측정이 가능 세포 계측 분석. 우리가 개발 한 방법은 망막 소교 식균 작용을 평가하기위한 강력한 방법이며, 성공적으로 다양한 화합물 또는 유전자 조작 생리 설정이 키 소교 기능을 변경하는 방법을 테스트하기 위해 사용될 수있다. 중추 신경계의 전문 영역으로, 망막 미세 아교 세포 기능 (20)을 연구 쉽게 접근 할 수있는 모델 시스템입니다. 이 방법은 t에서 개발되었지만그는 눈에, 우리는 미세 아교 세포의 식세포 기능을 조사하는 모든 신경 과학자에 유용 할 수 있다고 생각합니다.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&amp;nbsp;syringe, 600 series</td><td>Sigma</td><td>26702</td><td></td></tr><tr><td>33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A (&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt;) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Z-23373</td><td>Prepare immediately before injection</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Need two</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td>Curved</td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit &amp;ndash; Postnatal Neurons</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-802</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-bottom Tube</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>96 well U-bottom plate</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Stain Buffer (BSA)</td><td>BD Biosciences</td><td>554657</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV650 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>101259</td><td></td></tr><tr><td>Ly6C-APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>128025</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G-PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>BD Biosciences</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-mouse CD16/32 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>101301</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

다음은 신속하고 확실하게 유세포 분석을 (도 2)를 이용하여 생리 환경에서 포식성 망막 미세 아교 세포의 수를 정량하는 방법을 설명한다.이 방법의 탐식 능력의 화합물 및 / 또는 유전자 조작의 효과를 테스트하기 위해 적용될 수있다 미세 아교 세포 (도 3A, 3B). (- 이십일 생후 10) 또는 성체 마우스 (도 3c) 또한 젊은 사용될 수있다. 리포 폴리 사카 라이드 다양한 선량 (LPS)의 복강 내 투여 하였다. 24 시간 LPS 챌린지 후, 여기에 설명 된 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 식세포 기능 (도 3A)을 평가하기 위해 사용되었다. (26) 예상되는 바와 같이, 차량 제어부 (도 3B)에 비해 1.42 mg의 복용량은 / kg의 LPS를 탐식 미세 아교 세포의 퍼센트에서 통계 학적으로 유의 한 증가를 유도. 망막 레이어에 형광 표지 된 입자를 나타내는 유리체 강내 주입 설치 및 대표 망막 섹션 : 그림 1. (A) 겔 팩 해부 현미경으로 위치된다. (B) 강내 주입, 눈의 위치를 나타내는 바와 같이 설치류가 유지된다. (C) 세 시간 주입 형광 표지 된 입자에 걸쳐 대부분의 망막 층을 볼 수있다 후에. (D , E) CX3CR1 GFP / GFP 마우스와 빨간색 형광으로 표지 입자는 미세 아교 세포에 의해 입자의 흡수를 시각화하는 데 사용되었다. 깊은 (D)에서 미세 아교 세포와 표면 (E) 층은 입자를 차지합니다. 스케일 바 -. 20 μm의 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54677/54677fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a><html><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54677/54677fig2.jpg" /> 그림 2 : 게이팅 전략 식세포 미세 아교 세포를 선택합니다 (A)는 P10 마우스에서 망막 조직에서 단일 세포 현탁액을 분석 (B) 죽은 세포를 (PI의 +)를 제외하면, (C)는 CD11b + 세포가 선택 (D)에... 만 미세 아교 세포에 대한 선택, CD11b를 + 호중구 (Ly6G +)와 단핵구 (Ly6C +)는 제외된다. (E) 식세포 미세 아교 세포가 형광 표지 된 입자를 촬영 한 것입니다. (F) 식세포는 CD11b + 세포의 수는 미세 아교 세포의 것과 유사하다 (CD11b를 + Ly6G - Ly6C -). N = 9, 3 개의 독립적 인 실험에서 풀링; 오차 막대는 ± SEM을 의미 나타냅니다.rget = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54677/54677fig3.jpg" /> 그림 3 :. 미세 아교 세포 탐식 기능이 LPS 도전 후 새끼들까지 잔치 및 성인 마우스에서 평가 될 수있다 (A) 젊은 마우스 (P10)을 24 시간 식균 작용을 평가하기 전에, 다양한 용량으로 복강 내 LPS에 도전했다 (B) 챌린지 1.42 밀리그램과 /. 차량 제어 (p = 0.0021)에 비해 kg은 포식 망막 미세 아교 세포의 증가 비율을 크게 가져. (C)이 프로토콜은 모두 성인 새끼 마우스의 망막 소교 식세포 기능을 측정 할 수있다. LPS와 도전하지 영 (P10) 마우스 (p = 0.019)에 비해 성인 쥐의 미세 아교 세포 탐식 상당히 작은 백분율이있다. n은 서너에서 풀링 9 -12,독립적 인 실험; 오차 막대는 ± SEM을 의미 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54677/54677fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

9.5K 조회수.  The Scripps Research Institute.  조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다. 

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Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

항원 특정 VIVO에서</emCFSE 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기<em&gt; 체외</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

의학

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. Innate immune cells, specifically mononuclear phagocytes, express overlapping cell surface markers, which makes identifying these populations a challenge. Multi-parameter flow cytometry allows for the simultaneous, quantitative analysis of multiple cell surface markers in order to differentiate monocytes, macrophages, microglia, and dendritic cells in mouse eyes. This protocol describes the enucleation of whole mouse eyes, ocular dissection, digestion into a single cell suspension, and staining of the single cell suspension for myeloid cell markers. Additionally, we explain the proper methods for determining voltages using single color controls and for delineating positive gates using fluorescence minus one controls. The major limitation of multi-parameter flow cytometry is the absence of tissue architecture. This limitation can be overcome by multi-parameter flow cytometry of individual ocular compartments or complimentary immunofluorescence staining. However, immunofluorescence is limited by its lack of quantitative analysis and reduced number of fluorophores on most microscopes. We describe the use of multi-parametric flow cytometry to provide highly quantitative analysis of mononuclear phagocytes in laser-induced choroidal neovascularization. Additionally, multi-parameter flow cytometry can be used for the identification of macrophage subsets, fate mapping, and cell sorting for transcriptomic or proteomic studies.

This protocol provides a method to digest whole eyes into a single cell suspension for the purpose of multi-parameter flow cytometric analysis in order to identify specific ocular mononuclear phagocytic populations, including monocytes, microglia, macrophages, and dendritic cells.

단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

신경과학

시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴을 위한 유세포분석 기반 분석

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

저자 스포트라이트: 정신신경면역학의 기술 혁신을 통한 이해 증진

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가

요약

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단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화