The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

HINWEIS: Alle in dieser Methode beschriebenen Blutentnahmeverfahren wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der UNT Institutional Review Board (IRB) für den Menschen zugelassen. Alle Probanden gaben schriftliche Zustimmung für die Blutentnahme, die in dem vorliegenden Verfahren verwendet wurde, um sicherzustellen, dass sie scheinbar gesunden, normalen Körpergewicht und frei von Krankheiten. 1. Reagenz Source &amp; Vorbereitung <ol><li> Verwendung CD66b-APC (Klon # G10F5; DF = 1: 50) und CD45-APCeFluor780 (Klon # 2D1, DF = 1: 50) für diesen Test. HINWEIS: Vor der Studie, CD45 und CD66b-Antikörper wurden titriert, um die optimale Verdünnung zu bestimmen, die klar aufgelöst Granulozyten (CD45 + / + 66b) von anderen Leukozyten (CD45 + / 66b-) 11. Nach Zugabe der verdünnten Antikörper zur Anfärbung der Endverdünnung im Rohr 875. </li><li> Kauf und auftauen Lager S. aureus Biopartikeln mit pHrodo roten Farbstoff markiert. Auszusetzen bei einer Konzentration von 1 mg Biopartikeln pro ml in sterilem PBS. Aliquoten verdünnten Biopartikeln und bei -20 ° C eingefroren, bis in dem Assay verwendet. </li><li> Löse Dihydroethidium (DHE), der Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid in Gegenwart von Sauerstoff-freien Radikalen (dh die oxidative burst) in einer Endkonzentration von 10 g / ml überführt wird, in DMSO. </li><li> Mischungs N-Ethylmaleimid (zur zusätzlichen Phagozytose folgenden angegebenen Assay Inkubationsdauer zu verhindern) mit steriler PBS in einer 2-Schritt-Verdünnung von 200 mg / ml und 17,5 mg / ml. In dem Assay verwendet eine Endkonzentration von 15 mM. Beim Auftauen N-Ethylmaleimid, mit einem 37 ° C-Heizblock, da die N-Ethylmaleimid nicht in Lösung bleiben. </li><li> Nach dem Schlussfixierungsschritt verwenden 7AAD zu Kern-DNA zu färben. Vor der Zugabe verdünnter Lager 7AAD 1:10 mit sterilem PBS. </li></ol> 2. Blutentnahme <ol><li> Fragen Sie Themen, die im Labor nach einer O / N schnell (&gt; 8 Std) und abstenti ankommenauf von der körperlichen Aktivität (&gt; 12 h). </li><li> Nach der Reinigung der Haut mit einem Alkoholtupfer, legen Sie eine sterile Blutentnahme Nadel in eine periphere Armvene. </li><li> Sammeln Blut in Vakuumröhren, die im Handel mit Heparin-Natrium gefüllt sind. </li><li> Nach der Sammlung, ein steriles Heftpflaster auf die Patienten Arm. </li><li> Invertieren Blutröhrchen zu 10 mal zu mischen und dann auf einem Schüttler, bis die Analyse zu platzieren. </li></ol> 3. Phagozytose Assay-Technik <ol><li> Auftau S.aureus Biopartikel (RT), DHE (RT) und N-Ethylmaleimid (37 ° C). </li><li> In 20 l S.aureus Biopartikeln zu 4 Einzel 1,2-ml-Röhrchen, während der Arbeit in der sterilen Haube. </li><li> In 40 l DHE in jedes Röhrchen, das die Biopartikeln. </li><li> Klopfen Sie leicht die Rohre auf der Tischfläche, die Reagenzien in den Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> 100 L mischten Vollbluts in jedes Röhrchen, die mit Biopartikeln und DHE gefüllt worden ist. </li><li>Wischen Sie die Innenkante der Rohre mit einem Wattestäbchen, um jede verunreinigende Blut zu entfernen. </li><li> Mischen Sie das Blut und Reagenzien mit einer elektronischen Pipette eingestellt, um das Blut und Reagenzien für die drei Zyklen nach der Blut hinaus mischen. </li><li> Zeigen Teströhrchen in einem Eiskübel und decken den Inhalt vor Licht zu schützen. </li><li> Assayröhrchen für 10, 20 und 40 min inkubiert. Beginnen Sie mit dem 40-Minuten-Rohr, um sicherzustellen, alle Teströhrchen beenden zugleich. </li><li> Thaw N-Ethylmaleimid in 37ºC Perle Bad. </li><li> Pipette 15 l N-Ethylmaleimid (vorstehend in 1.4 beschrieben) in jedem Teströhrchen, inkubiere für 30 min. </li><li> Pipettieren Sie 10 l CD66b-APC und 10 l CD45-Antikörper APCeFluor780 verdünnt (siehe oben unter 1.1 beschrieben), 60 min. </li><li> Pipettieren Sie 750 L der WBC fix / RBC Lyse-Lösung in jedem Teströhrchen, Inkubation 60 min. </li><li> Zentrifuge (10 min bei 400 · g) Teströhrchen, um das Zellpellet zu sammeln. </li><li> Vakuum absaugen WBC Lyse / RBC Fixier-Lösung, so dass ein Rest fluid Volumen (100 L) über dem Zellpellet. </li><li> Pipettieren Sie 10 l verdünnt 7AAD-Lösung (oben in 1.5 beschrieben) und 50 l PBS in jedem Teströhrchen. </li><li> Einen Tropfen Kalibrierung Perlen (~ 25 L) zu jedem Teströhrchen, Ort Kappen auf Teströhrchen, Wickelrohre in Folie und Platz im Kühlschrank. </li><li> Laden Sie das Probenröhrchen in die bildbasierte Durchflusszytometer und sammeln ein Minimum von 3.000 Granulozyten Ereignisse mit vordefinierten Parametern: Autosampler, Blau (488 nm, 60 mW), Rot (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) Laser (Abbildung 1). </li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Acquisition Method &amp; Template. Die Proben wurden auf einer bildbasierten Durchflusszytometer (A) erworben. Während der Akquisition wurden Dot-Plots von Hellfeld Seitenverhältnis gegen CD66b-APC getrennt Granulozyten aus Stachel Kalibrierung Perlen usin erzeugt100.2.292.0 Software (B) g INSPIRE v.. , Rot (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm, 8,5 mW) Laser, ein Minimum von 5.000 Granulozyten wurden für jeweils Proben mit einem Autosampler, blau (60 mW 488 nm) erworben. Bitte beachten Sie, dass eine Reihe von Histogrammen bei der Erfassung der Lasereinstellungen und andere Aspekte der Datenerfassung überwachen vorhanden sind. Alle diese Histogramme sind optional und nur erforderlich, wenn die Laborstandardverfahren verlangt, dass sie die Qualitätskontrolle. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> 4. Probenerfassung und -analyse <ol><li> Verwenden Sie die automatische Softwarekompensation Assistent des IDEAS-Software, um eine Kompensationsmatrix, um Raw-Bilddateien (RIF) anwenden und erstellen kompensieren abgebildeten Dateien (CIF). </li><li> Laden einzelnen CIF-Dateien in IDEAS-Software und die folgende Grundstücke, die Granulozyten-Untergruppen zu identifizieren: </li&gt; <li> Stellen Anfangs Tore, um die Zellen, die berücksichtigt wurden mit Hilfe eines Histogramms für Hellfeld Gradienten RMS (2A) im Fokus sein zu identifizieren. Machen Sie diese Bestimmung für jede Patientenprobe unter Verwendung der nicht-stimulierten Kontrolle als Referenzstandard. </li><li> Verwenden Sie sekundäre Grundstücke zu trennen Singulett-Zellen aus Schutt und Dubletten mit einem Punktediagramm der Hellfeld-Aspektverhältnis (Verhältnis von Zellenhöhe vs. Breite) vs. Hellfeldbereich (2B). Machen Sie diese Bestimmung für jede Patientenprobe unter Verwendung der nicht-stimulierten Kontrolle als Referenzstandard. </li><li> Sobald eine saubere Population von Zellen identifiziert worden waren, stellen Sie eine Dot-Plot von CD45 gegen CD66b (2C), um positiv zu identifizieren Granulozyten (CD45 + / 66b +). Erstellen Sie eine Tochter Plot (Abbildung 3) von hellen Detail Intensität für S. aureus (x-Achse) vs. hellen Detail Intensität für oxidativen Burst (DHE, y-Achse), um Untergruppen von aktivierten Granulozyten identifiziert. Sammeln bright Feldbilder in Kanal 1 und 9, Biopartikeln in Kanal 2, DHE in Channel 4, Channel 5 in 7AAD, CD66b in Kanal 11 und CD45 in Kanal 12. </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Analysevorlage. Diese Zahl die Reihe der Grundstücke, die erzeugt wurden, um Zellen, die im Blickpunkt (A) wurden identifiziert, Einzelzellen (B), Granulozyten (C). Zusätzliche Flächen wurden verwendet, um die drei Teilmengen von aktivierten Granulozyten vs. inaktiven Granulozyten identifiziert. All die Zusammensetzung der erworbenen Bilddateien wurde mit IDEAS v.6 Software abgeschlossen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Das vorliegende Verfahren stellt eine Verfeinerung der bestehenden Methoden zur Bewertung der Granulozyten-Funktion mit Hilfe der Durchflusszytometrie 1,3,4,12-14. Die kritischen Schritte des Assays sind in der Regel auf das richtige Mischen der Blutprobe mit den Biopartikeln und DHE hängen. Unvollständige Mischung wird zu ungenauen Ergebnissen führen. Während eine vollständige Durchmischung kritisch ist, sollte die Mischmethode sanftes Natur sein. Es wird vorgeschlagen, dass das Mischen unter Verwendung einer elektronischen Pipette mit einer Mischfunktion, anstatt einem Wirbelmischer durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt im Assay ist, immer sicher, dass kein Blut Verunreinigung der oberen Hälfte der Teströhrchen. Das Restblut kann mit einem sterilen Wattestäbchen entfernt werden. Die vollständige Entfernung ist wichtig, weil dies versäumt, so kann die endgültige Testvorbereitung mit nicht lysierten roten Blutkörperchen verunreinigen. Vor der Verwendung dieser Methode eine angemessene Entschädigung Kontrollen sollten hinzugefügt, um sp steuernectral Überlappung zwischen den verwendet, um die verschiedenen Aspekte der Granulozytenfunktion identifizieren Reagenzien. Für diese Methode Entschädigung Kontrollen umfassen sammeln Blutproben, die die 40 min Inkubation Assay vorgeschlagen haben und die Kennzeichnung mit einem einzigen Marker (dh E. coli, DHE, etc.). Nach der Markierung werden einzelne positive Ereignisse gesammelt und einer Kompensationsmatrix wird mit Hilfe eines automatisierten Assistenten in der IDEEN-Analyse-Software generiert. Es ist kritisch, dass, wenn dieser Test verwendet wird, geeignete Kompensationssteuerungen abgeschlossen sind, um eine ordnungsgemäße Testleistung zu gewährleisten. Die Analyse wird mit Hilfe der Funktion Finder und Co-Lokalisation Assistenten zu erkennen, dass helle Detail Intensität ist die beste Variable, um die Bevölkerung zu trennen und zu identifizieren, wie viel Überschneidung zwischen oxidativen Burst und Phagozytose Signale vorhanden erreicht. Insbesondere die Verwendung von bildbasierten Zytometrie vorgesehen die Fähigkeit aktivierten Granulozyten in drei Teilmengen zu trennen. Tseine Teilmenge Aufteilung wurde mit hellen Detail Intensität der Phagozytose gegen oxidativen Burst bestimmt. Neben der Untersuchung dieser singulären Zellfunktionen wurden die Zellen, die sowohl Veranstaltungen zur gleichen Zeit in der gleichen anatomischen Lage (Co-Lokalisation) zeigten identifiziert. Granulozyten, die in die &quot;high-aktiv&quot; Untergruppe fiel das einzige Phänotyp, die im Einklang Kolokalisation zwischen Phagozytose und oxidativen Burst demonstriert. Diese Identifizierung aktivierter Granulozyten-Untergruppen ist der größte Bereich, in dem Problembehandlung erforderlich ist. Es ist sehr wichtig für ein neuer Benutzer sich Zeit zu nehmen, um die Probe Prozess-Workflow in IDEAS zu verstehen und die Mechanik der Anschnitt die Zellpopulationen mit dem bildgebenden Komponente zu verstehen. Andere Änderungen, die ein Benutzer kann versuchen, zu machen sind die Auswahl der anderen oder einen zusätzlichen Test Inkubationszeiten. Das gegenwärtige Verfahren schlägt die Verwendung von Zeitdauern von 10-40 min; jedoch in Abhängigkeit von dem experimentellen Modell, wenn dieses Verfahrenverwendet werden soll, kann es notwendig mehr Assay Dauern auszuwählen. Eine solche Veränderung würde müssen individuell bewertet werden. Ferner wurde bestimmt, daß die Dauer der Inkubation werden eine signifikante Wirkung auf das Aussehen der drei Untergruppen aktiviert. Die in diesem Bericht beschriebenen Ansatz stellt eine Erweiterung, welche Informationen bereits erhalten werden konnten bezüglich Granulozytenfunktion 3,4,13,15. Andere Labors haben die Bedeutung der Beurteilung von Veränderungen in Granulozytenfunktion als Teil einer umfassenden Bewertung der Immunität und Krankheit 15 bis 17 gezeigt. Trotz des Potentials dieses Assays ist es nicht ohne Einschränkungen. Eine der Haupteinschränkungen mit hohem Probendurchsatz assoziiert Kosten und Zeitbedarf. Wenn ein Studiendesign erfordert eine große Anzahl von Proben in einem gegebenen Tag, können diese schwierig zu verarbeiten sein. Die Verarbeitung wird durch den Einsatz von elektronischen Pipetten und Dispenser gestrafft,aber diese neigen dazu, teuer zu sein und sind nicht notwendigerweise in jedem Labor. Unsere Forschungsbereich konzentriert sich auf eine Studie, wie Bewegung und Ernährungsgewohnheiten beeinflussen die Gesundheit des Immunsystems und Funktion 6,8-10,18-20. Diese Ziele haben signifikante praktische Bedeutung für eine Vielzahl von Bereichen der menschlichen Gesundheit. Über die Untersuchung der Bewegung und Futterverwertung der Phagozytose Verfahren in diesem Manuskript konnte gezeigt werden, die in anderen Bereichen der klinischen Immunologie, wo die Überwachung der Phagozytose Funktion ist entscheidend für die Behandlungsergebnisse. Die vorliegende Test ist der erste von vielen, dass immunologische Tests mit dem Potenzial, indem sie Vorteile der einzigartigen Bildinformationen, die von einer bildbasierten Durchflusszytometer werden können, können neu erfunden werden.

Granulozyten stellen einen Bestandteil des körpereigenen angeborenen Immunsystems, die die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Antigene zur Verfügung stellt. Frühere Verfahren zur Beurteilung Granulozytenfunktion fokussiert auf die Phagozytose Kapazität oder oxidativen Burst mit separaten Methoden, so dass es schwierig ist, festzustellen, wie kollektiv Granulozyten 1-4 verändert. Fortschritte auf dem Gebiet der Durchflußzytometrie in der Herstellung von Tischgeräten in der Lage, hochauflösende, Mehrfarbenbilder von Zellen in einem Hochdurch Weise 5 geführt. Die Fähigkeit zur Bildgebung mit traditionellen Flow kombinieren Zytometrie stellt eine Weiterentwicklung, die die technologische Plattform benötigt, um im Rahmen der bestehenden Flusszytometrie Methoden innovativ und extrahieren Sie neue Informationen über das Immunsystem bietet. In den letzten zehn Jahren hat unser Labor unter anderem stark von der Wirkung von verschiedenen Ernährungs- und Bewegungs Behandlungen Patte fokussiertrns auf angeborene Immunfunktion 6-9. Die in dieser Handschrift zeigte Methode hat praktische Auswirkungen im Bereich der klinischen Immunologie. Das vorliegende Verfahren nutzt die Leistung von bildbasierten Durchflusszytometrie, um gleichzeitig die Phagozytose von Bakterien und Partikeln oxidativen Burst. Mit dieser Vorgehensweise ist man in der Lage aktivierten Granulozyten mit Variablen durch die bildbasierte Teil der Analyse bereitgestellt trennen. Diese Teilmengen nur erkennbar, nachdem die Beurteilung der Zellbilder auf den einzelnen Granulozyten. Weitere Assays Inkubationszeit betroffen den Übergang zwischen den drei Untergruppen Aktivierungs 10. Somit ist es plausibel, dass die Verwendung von mehreren Inkubationszeiten erlauben ein Verfahren, um die Änderung in Granulozytenfunktion nach einem spezifischen experimentellen Behandlung zu testen. Der Zweck dieses Manuskripts wurde die Bereitstellung eines Verfahrens zur Beurteilung Granulozytenfunktion mithilfe bildbasierten Durchflusszytometrie, um gleichzeitig die Phagozytose mit oxidat demonstrierenive platzen.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>used for blood collection</td></tr><tr><td>WBC Fixative / RBC Lysis solution</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>clone G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>clone 2D1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;S. aureus&lt;/i&gt; bioparticles</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmalemide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematology Analyzer</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96-channel pipet</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Incubator</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Workstation</td><td>Dell Computers</td><td>Various</td><td>Used for IDEAS analysis</td></tr></tbody></table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Verwendung bildbasierten Durchflusszytometrie uns erlaubt, eine homogene Population von aktivierten Granulozyten in drei verschiedene Untergruppen der Aktivierung (Figur 3) zu trennen. Bei diesem Verfahren wird der wirksamste Weg, um die drei Aktivierungsmengen zu lösen, ist durch Auftragen hellen Detail Intensität für Phagozytose (S. aureus) gegen oxidativen Burst (DHE) (Figur 3; Figur 4). Auch wird die Verwendung des Co-Lokalisation Assistenten in IDEAS-Software für die Quantifizierung der Anwesenheit von gleichzeitigen Phagozytose und oxidativen Burst, die ein Markenzeichen Zeichen der hoch aktivierten Granulozyten ist erlaubt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Bezeichnung des Aktiv Granulozyten-Subsets. Nach der Identifizierung von Granulozyten mit Zelloberflächenmarker (CD45 + / 66b +), eine Tochter Grundstück wurde mit hellen ausführlich inten erzeugtVielfalt für die Phagozytose vs. hell Detail Intensität für oxidativen Burst. Mit diesem Ansatz Anteil der inaktiven (lila), low-aktiv (rot, A), mittel-aktiv (blau, B) und high-aktiv (gelb, C) Granulozyten bestimmt. Dieses Gating-Technik wurde auch verwendet, um die Wirkung der Test Inkubationszeit auf die relative Menge der verschiedenen aktivierten Granulocyten Untergruppen auszuwerten. Der höchste Prozentsatz von &quot;high-aktiv&quot; Granulozyten vorhanden war, nach der 40-minütigen Inkubation. All die Zusammensetzung der erworbenen Bilddateien wurde mit IDEAS v.6 Software abgeschlossen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Neben dem Nachweis der Anwesenheit von drei unterschiedlichen Teilmengen von aktivierten Granulozyten, wurde demonstriert, dass das Assay Inkubationszeit beeinflusst die relative Häufigkeit jeder aktivierten Granulozyten Subset. Insbesondere wird das 40 min incubation führte zur größten Anteil der &quot;high-aktiv&quot; Granulozyten. Von denen mindestens drei Assay Inkubation Dauern kann es möglich sein, zu bestimmen, wie ein bestimmter klinischer Behandlung ändert die zeitliche Aktivierungsstatus von Granulozyten. Dies ist der erste veröffentlichte Verfahren unter Verwendung der bildbasierten Durchflusszytometrie an verschiedene aktivierte Granulozyten Teilmengen in Abhängigkeit von gleichzeitigen Messungen der Phagozytose und die oxidative Burst identifizieren. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Bilder von Cellular Markers. Eine Fotogalerie von Zellen als high-aktiv (A) klassifiziert, moderate aktiven (B) und low-aktiv (C) ist in dieser Figur dargestellt. S.aureus Biopartikeln sind in CH03 ist oxidativen Burst in Ch04, 7AAD für den Kern in CH05, Seitenstreuung ist in Ch06, CD66b ist inCh11 und CD45 ist in Ch12. Es wird auch ein co-lokalisiert merge Bild der Phagozytose (CH03) gegen oxidativen Burst (Ch04) angezeigt. Gebiete gelb in der Zusammenführung Bild anzuzeigen, dass die Phagozytose und oxidativen Burst in der gleichen anatomischen Raum zur gleichen Zeit auftreten. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten<em&gt; In-vitro-</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.4K Aufrufe.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Serie: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Neurowissenschaften

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Ein Flow Cytometry-basierte Assay, Verbindungen zu identifizieren, die Bindung von Eindringmittel beschriftet CXC-Chemokin-Liganden 12 an CXC-Chemokin-Rezeptor 4 stören

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Biologie

Analyzing Basophil Activation in the Presence of a Test Allergen using Flow Cytometry

Source: Do&#241;a, I. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62600">Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we demonstrate the test to evaluate basophil activation in the presence of a test allergen using flow cytometry.

Analyse der Basophilenaktivierung in Gegenwart eines Testallergens mittels Durchflusszytometrie

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Sample preparation

	Collect ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Source: Murinello, S. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54677">Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Messung der Mikrogliaaufnahme von intravitreal abgegebenen fluoreszierenden Partikeln mittels Durchflusszytometrie

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten

Zusammenfassung

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