성체 쥐의 안구 치료 전달 및 고급 조직 회수(Ocular Therapeutic Delivery and Advanced Tissue Retrieval in adult rats)

이 연구는 성체 쥐의 망막과 시신경에 치료제를 전달하는 방법론을 제시합니다. 또한, 성체 쥐의 시신경과 망막을 하향식으로 일괄적으로 수집하기 위해 독특한 조직 회수 방법이 도입되었습니다.

망막과 시신경을 포함한 눈의 후부에 대한 치료 전달은 혈액-뇌 및 혈액-망막 장벽의 존재로 인해 복잡합니다. 쥐와 같은 작은 동물 모델은 다양한 안구 병리를 연구하는 데 활용됩니다. 후안으로의 치료적 전달은 까다롭지만, 이를 달성하는 것은 안구 질환을 치료하는 데 필수적이며, 그 중 많은 부분이 중개 관련성을 위해 소동물 모델에서 검증을 필요로 합니다. 따라서 성체 쥐에 사용하기 위한 유리체강내 주사(IVI)와 후궁 주사(RBI)의 두 가지 후방 치료 전달 기술이 제시됩니다. 또한, 눈과 시신경을 일괄적으로 제거하는 방법이 다양한 조직학 및 분자 분석 기술을 위해 도입되었습니다. 해부 프로토콜은 신경 시각 시스템을 완전히 관찰하는 동시에 망막 및 시신경 조직의 사후 손상을 최소화합니다. 치료용 사이클로스포린이 망막과 시신경에 성공적으로 전달되었으며, IVI와 RBI를 모두 사용하여 주사 후 24시간 후에 검출 가능한 농도가 관찰되었습니다. 또한, 전체 눈 조직학적 조직 분석을 위해 망막 및 신경 샘플을 성공적으로 추출하여 망막과 더 넓은 신경-시각 시스템에 대한 포괄적인 관찰을 용이하게 했습니다.

눈의 복잡한 해부학적 구조 ^1,2, 특히 혈액-망막 장벽(BRB)^3,4,5의 존재로 인해 망막과 시신경에 치료제를 전달하는 것은 매우 어렵습니다. BRB는 전신 순환의 침입으로부터 망막을 보호하는 역할을 하지만, 전신 치료 순환이 BRB ^6,7에 의해 차단되는 경우가 많기 때문에 치료 투여에 대한 도전적인 반대자입니다. 작은 친유성 분자는 BRB를 통해 쉽게 확산될 수 있지만, 더 크고 친수성 분자는 망막에 접근하기가 더 어렵습니다⁶. 유리체강내(IVI) 및 후강근(RBI) 주사는 BRB에 의해 부과된 한계를 극복하여 안구 조직에 약물을 전달할 수 있습니다. IVI는 눈의 내부 환경에 치료제를 투여함으로써 유망한 절충안을 제시한다 ^8,9. 이 방법은 약물이 유리체를 통과하여 BRB를 우회하고 시신경(⁷)에 도달하기 위해 망막과 맥락막을 통해 확산되어야 합니다. RBI는 눈 뒤에서 retrobulbar 공간¹⁰으로 전달됩니다. 치료제는 후구(retrobulbar space)의 조직과 땀샘을 통한 확산에 의해 전달될 수 있으며, 망막에 직접 들어가지 않고도 시신경 및 주변 구조에 영향을 미쳐 BRB의 무결성을 유지할 수 있습니다. 유리체강내 및 후궁 주사 모두 약물을 직접 또는 간접적으로 눈에 전달함으로써 치료 약물의 국소 농도를 높일 수 있으며, 이는 국소 또는 전신 투여(경구 또는 정맥 주사)에 비해 효과를 향상시킵니다². 이는 많은 안구 질환에서 볼 수 있듯이 빠른 작용이나 높은 효능이 필요한 치료에 특히 중요합니다. 표적 투여는 또한 신체의 나머지 부분이 약물에 노출되는 것을 제한하여 표적을 벗어난 효과의 위험을 줄이고 약물을 국소, 경구 또는 정맥 투여할 때 발생할 수 있는 잠재적인 부작용을 최소화하는 데 도움이 됩니다¹¹.

결막하주사(subconjunctival), 후방시테논(posterior subtenon), 망막하주사(subretinal)와 같은 다른 안구 주사법은 나름의 장점과 한계가 있다 ^2,5. 후방 서브테논 주사는 높은 약물 농도를 안구 조직에 전달하는 것으로 관찰되었습니다. 그러나, 장부 주사는 안와 정관(orbital vasscularture)보다 공막(scleral)에 더 가깝습니다 ^5,12. 이와는 대조적으로, RBI는 치료제를 후결막(posterior subtenon) 또는 결막하(subconjunctival¹³)보다 시신경에 더 가깝게 배치한다. 이는 시신경 병리학이 다른 안구 주사 유형보다 RBI 전달 치료제를 선호한다는 것을 의미할 수 있습니다. 후장부 주사는 사시, 하이프마, 안압 상승 등의 위험이 있다⁵. 안압 상승은 IVI, 결막하 주사, 망막하 주사에서도 보고된 위험 인자이다². 이러한 주사 유형은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 반복적인 투여가 필요한 경우가 많습니다². 망막하 주사, 결막하 주사, IVI와 관련된 다른 위험 요인으로는 백내장 형성, 망막 출혈, 망막 박리, 염증 등이 있다². 이러한 IVI, 망막하 주사 및 결막하 주사는 안구^{내 2}차 주사이기 때문에 RBI 주사보다 더 침습적입니다. RBI는 바늘을 눈구에 직접 넣지 않고 치료제를 후구(retrobulbar) 공간에 배치하기 때문에 덜 침습적인 것으로 간주될 수 있습니다. 국소 투여와 같은 다른 덜 침습적인 치료 전달 전략은 충분한 약물 전달에 미치지 못하며, 안^{구 표면에 유지}되는 약물의 5% 미만이 ^2,5.

IVI는 전임상 모델에서 두드러진 기법으로, 치료제를 안구 후부에 직접 전달하는 능력으로 인해 사용됩니다. IVI는 이 약물을 유리체액에 직접 전달하기 때문에 국소 치료에 선호되는 전달 기법이다¹⁴. IVI 기법은 약물이 망막으로 침투하는 것을 막는 흔한 장애물인 혈액-망막 장벽을 우회할 수 있도록 한다¹⁴. IVI는 염증과 안구 손상의 가능성을 유발하므로 절차를 꼼꼼하게 준수해야 한다¹⁴. 망막 박리와 백내장 형성을 최소화하기 위해, Chiu 등은 수정체, 망막, 안구 근육 및 혈관을 피하면서 평면 평면에서 45도 경사 삽입 및 주입을 강조하는 IVI 접근법을 설명한다¹⁵. 이 기술에서는 30G 바늘을 비강 공막에 삽입하여 치료 전달을 수행합니다¹⁵. IVI는 침습적 특성으로 인해 여전히 위험과 관련이 있습니다. 잠재적 위험으로는 망막 박리, 백내장 형성, 안구내염 또는 출혈 등이 있다¹⁶. IVI 기법의 침습적 특성은 또한 안압을 증가시키는데, 이는 박익종 등이 수행한 돼지 눈 실험에서 볼 수 있다.¹⁶. 이 연구는 바늘 삽입과 수액 주입의 여러 단계에서 안압의 변화를 보여줍니다. 그들은 시술 중 안압에 상당한 변화가 있다고 보고했다¹⁶.

RBI는 이전 연구에서 설치류에 대한 치료 전달 수단으로 성공적으로 활용되었습니다. 그러한 연구 중 하나는 RBI¹⁷을 통해 제공된 다양한 프로스타글란딘 유사체의 효과를 비교했습니다. 알비노 쥐는 45도 각도로 하포닉스의 측면 영역을 통해 삽입된 0.1mL 주사액의 26G 바늘로 RBI를 투여했습니다¹⁷. 이 연구에 사용된 프로토콜은 클로랄하이드레이트의 복강내(IP) 주사를 통해 쥐를 마취시키는 이전에 설명된 방법을 채택했습니다¹⁸. 쥐를 대상으로 한 또 다른 연구에서는 국소 점안액과 후궁 주사를 비교했다¹⁹. 쥐는 케타민/자일라진의 IP 주사를 통해 마취되었고, RBI는 30G 바늘을 통해 투여되었다¹⁹. 앞서 논의된 진정 방법과는 대조적으로, RBI가 안와 지방에 미치는 영향을 관찰한 한 연구에서는 RBI²⁰ 이전에 쥐를 진정시키기 위해 흡입 이소플루란을 사용했다. 이러한 연구는 어떤 마취제와 바늘 사양이 성공할 수 있는지에 대한 통찰력을 제공하지만, 시술 중 동물의 위치 및 취급에 대해서는 논의되지 않습니다.

생쥐를 대상으로 한 다양한 연구에서도 치료 전달 방법에 대한 RBI를 수행합니다. 1건의 연구에서는 RBI를 신증후군을 성공적으로 유발하기 위해 RBI와 외측 꼬리 정맥 주사를 비교했다²¹. 두 번째 연구에서는 심장 영상 촬영을 위한 조영제 투여에서 동일한 두 가지 주입 기법을 비교했다²². 마우스는 흡입용 이소플루란으로 마취하고 눈의 내측에 주사하였다²². 두 연구 모두 이전에 작성된 프로토콜에서 RBI 방법을 조정했습니다. 이 프로토콜은 주사를 retro-orbital로 명명했지만 주입 위치를 눈 뒤의 retrobulbar 공간으로 설명했다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 저자는 흡입 이소플루란을 선호되는 진정 방법으로 사용했으며, 마우스의 빠른 활성화 및 회복 시간에 주목했습니다²³. RBI의 경우, 눈 주위 피부에 압력을 가하여 눈이 소켓에서 부분적으로 돌출되었습니다²³. 그런 다음, 바늘을 내측 안각 베벨 쪽에서 30도 각도로 아래로 향하게 삽입하고 눈의 기저부에 도달할 때까지 삽입하였다(²³). 동물에게 압력을 가할 때는 우발적인 혈류 차단이나 기관 붕괴가 발생할 수 있으므로 주의해야 한다²³. 또한 인젝터는 삽입 시 바늘 끝을 볼 수 없으므로 눈을 손상시킬 수 있습니다. ²³ 치료 투여 시 눈을 손상시키는 것은 이 실험에서 치명적인 위험인데, 추가적인 손상을 일으키는 것은 연구 결과를 직접적으로 훼손하기 때문이다. 또한, 앞서 설명한 포지셔닝 및 핸들링 기술은 마우스에서 수행되었으며 랫드에 대한 적용 가능성에 대한 언급을 포함하지 않았다는 점에 유의해야 합니다.

시신경과 망막을 제거하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 그러한 방법 중 하나는 시신경과 눈을 일괄적으로 제거하여 온전한 시신경을 보존하는 방법을 탐구했습니다²⁴. 이 방법은 개별 눈과 시신경도 일괄적으로 제거하기 위해 보존된다는 점에서 현재 연구와 가장 유사합니다. 그러나 시신경은 분리되어 있습니다. 이 절차에서는 절차가 복잡하기 때문에 주의를 기울이는 것이 가장 중요합니다. 현재 방법에서는 꼬리 두개골을 통해 해부를 시작하고 시신경 손상을 제한하고 전체 신경이 손상되지 않은 상태로 유지될 수 있는 방식으로 접근을 제공하기 위해 주둥이로 작업합니다. 더욱이, 신경을 온전하게 유지하고 눈에 부착하는 것은 신경의 각 부분에 대한 손상이 다른 병리학적 관찰에 해당할 수 있기 때문에 포매 과정에 매우 중요하다²⁴. 시신경의 방향은 시신경이 삽입되는 방식이 다양한 단면을 허용하기 때문에 고려하는 것이 중요하며, 이는 조직학적 분석에 중요할 수 있습니다.

소동물 실험실 안과 수술대(SALOOT, 안과 수술 플랫폼)로 알려진 맞춤형 장치는 일련의 3D 프린팅 재료로 구성되어 마취를 제공하고 안구 치료 주사를 위해 동물을 안정적인 자세로 고정합니다. SALOOT 설계는 안과 시술을 위한 머리와 안구 구조의 안정성을 허용하여 수술의 속도와 재현성을 향상시키는 동시에 가스 마취 전달 및 호기 미립자 청소를 가능하게 합니다. SALOOT는 이소플루란 주입구가 있는 콧방울 안에 동물의 머리를 고정하기 위해 앞쪽에 더 좁은 영역이 있는 쥐 몸체를 고정하는 오목한 축소 기능을 특징으로 하는 3차원 인쇄 블록입니다. 노즈 콘 아래에는 작은 저장소와 배기 배출구가 있습니다. 치료적 안구 전달 및 정확한 안구 조직 회수를 위해 다음과 같은 방법이 개발되었습니다. 그들은 안구 외상 후 조직을 연구하기 위해 설계되었으므로 외상, 주사, 치료 및 해부의 효과를 설명하여 결과에 대한 혼란스러운 해석을 피하는 것이 중요합니다.

이 기사는 성인 쥐에 사용하기 위한 두 가지 안구 치료 주사 방법, 유리체강내 주사와 후구강 주사를 제시합니다. 또한, 성체 쥐에서 온전한 시신경과 망막을 일괄적으로 제거하기 위한 조직 회수 방법이 제시됩니다. 이러한 기술을 통해 유도 병리 및 치료의 안구 및 안구 주위 효과를 조사할 수 있습니다.

모든 실험은 안과 및 시각 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었으며 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 체중이 ~200g이고 생후 약 2개월인 수컷 Sprague Dawley 쥐가 사용되었습니다²⁵. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 유리체강내 주사(IVI)

1. 이소플루란과 폐기물 리드를 SALOOT 부착 포트에 부착합니다. ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research 및 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 표준 이소플루란 절차를 사용하여 동물을 마취합니다.
   참고: 또는 동물이 이미 다른 안과 검사 세션에서 마취된 경우(예: 케타민/자일라진 혼합, 90mg/kg 케타민 및 10mg/kg 자일라진), 동물을 안과 수술 플랫폼으로 옮기고 이소플루란(산소 3: 이소플루란 3 비율)으로 마취를 적정하여 적절한 마취 깊이가 유지되도록 합니다.
2. 마취된 동물과 함께 안과 수술 플랫폼을 라이브 수술 현미경 아래에 놓습니다. 페달 철수 반사를 통해 마취 깊이를 평가합니다.
3. 0.5% 테트라카인 염산염 점안액을 눈이나 수술 중인 눈에 1-2방울 떨어뜨립니다. 조작을 수행하지 않을 경우 hypromellose 0.3%와 같은 윤활 국소 안과 연고를 반대쪽 눈에 바르십시오.
   1. 그런 다음 안구 표면에 5% 포비돈 요오드 1-2방울을 떨어뜨리고 면봉을 사용하여 포비돈 요오드를 눈 주변 피부에 바릅니다.
4. 길이 10mm, 각도 15도의 스타일 4팁이 있는 33G 바늘이 있는 10μL 주사기를 사용하여 0.9% 정균 염화나트륨을 추출합니다. 주사기와 바늘을 식염수로 세척한 후 바늘을 뜨거운 비드 살균기에 담그십시오.
   1. 계속하기 전에 식히십시오. 바늘이 냉각된 후 원하는 양(4μL)으로 관심 치료제를 추출합니다.
      참고: 개념 증명 연구를 위해 비희석 문신 잉크와 인산염 완충 식염수(PBS)에 함유된 Evan's Blue 염료를 사용했습니다. Evan's Blue 분말은 불투명해질 때까지 PBS와 혼합되었습니다. 치료적 개념 증명 연구를 위해 1mg/mL의 이부딜라스트, 타우로우르소데옥시콜산(TUDCA) 5mg/mL, 사이클로스포린 주사, 250mg/mL 및 아나킨라 100mg/0.67mL의 농도가 사용되었습니다. 치료용 분말을 0.9% 정균 식염수에 희석하였다.
5. 치아가 있는 미세한 안과 겸자를 사용하여 가장자리의 공막 조직을 부드럽게 잡고 안정화합니다. 홍채 주위에 희미한 붉은 고리가 있습니다. 이 링을 랜드마크로 사용하여 바늘을 삽입하고 베벨 면이 아래로 향하게 하여 눈 뒤쪽에 주입합니다.
   참고: 바늘을 망막 쪽으로 기울이고 바늘을 2/3 정도만 삽입하십시오(그림 1). 바늘이 렌즈를 긁지 않도록 하면 백내장이 발생할 수 있습니다.
6. 치료제를 주입한 후 천천히 바늘을 제거합니다. 눈을 감고 식염수로 씻어내기 전에 최소 10-15초 동안 압력을 유지하십시오.
7. 동물의 이소플루란을 중단하고 안과 수술 플랫폼에서 제거합니다. 각 눈에 하이프로멜로스 0.3% 한 방울을 떨어뜨린 다음 동물이 발열 패드에서 회복할 수 있도록 합니다.

2. 후궁 주사(RBI)

1. 이소플루란과 폐기물 리드를 SALOOT 부착 포트에 부착합니다. 표준 이소플루란 절차를 사용하여 동물을 마취합니다.
   참고: 또는 동물이 이미 다른 안과 검사 세션에서 마취된 경우(예: 케타민/자일라진 혼합, 90mg/kg 케타민 및 10mg/kg 자일라진), 동물을 안과 수술 플랫폼으로 옮기고 이소플루란(산소 3: 이소플루란 3 비율)으로 마취를 적정하여 적절한 마취 깊이가 유지되도록 합니다.
2. 마취된 동물과 함께 안과 수술 플랫폼을 라이브 수술 현미경 아래에 놓습니다. 페달 철수 반사를 통해 마취 깊이를 평가합니다.
3. 0.5% 테트라카인 염산염 점안액을 눈이나 수술 중인 눈에 1-2방울 떨어뜨립니다. 조작을 수행하지 않을 경우 반대쪽 눈에 윤활 국소 안연 연고(하이프로멜로스 0.3%)를 바르십시오.
   1. 그런 다음 안구 표면에 5% 포비돈 요오드 1-2방울을 떨어뜨리고 눈 창을 사용하여 포비돈 요오드를 눈 주변 피부에 바릅니다.
4. 28G 바늘이 있는 0.5mL 인슐린 주사기를 구합니다. 관심 치료제를 원하는 양(100μL)으로 추출합니다.
   참고: 개념 증명 연구를 위해 비희석 문신 잉크와 인산염 완충 식염수(PBS)에 함유된 Evan's Blue 염료를 사용했습니다. Evan's Blue 분말은 불투명해질 때까지 PBS와 혼합되었습니다. 치료적 개념 증명 연구를 위해 10mg/mL의 이부딜라스트, 50mg/mL의 TUDCA, 250mg/mL의 사이클로스포린 주사, 100mg/0.67mL의 아나킨라 농도가 사용되었습니다. 치료용 분말을 0.9% 정균 식염수에 희석하였다.
5. 치아가 있는 미세한 안과 겸자를 사용하여 아래 눈꺼풀을 부드럽게 잡고 안정시킵니다. 안구 뒤쪽이 느껴질 때까지 아래쪽 안와 가장자리를 따라 6시와 7시 방향 사이의 중간 방향으로 바늘을 비스듬히 삽입합니다. 바늘을 약간 뒤로 당긴 다음 치료제를 천천히 주입합니다(그림 2).
6. 바늘을 부드럽고 천천히 제거합니다. 그런 다음 눈을 감고 식염수로 씻어내기 전에 최소 10-15초 동안 압력을 유지하십시오.
7. 동물의 이소플루란을 중단하고 안과 수술 플랫폼에서 제거합니다. 각 눈에 하이프로멜로스 0.3% 한 방울을 떨어뜨린 다음 동물이 발열 패드에서 회복할 수 있도록 합니다.

3. 안구 조직 격리 해부

1. CO₂ 질식을 통해 동물을 안락사시킨 후 또는 승인된 IACUC 프로토콜에 달리 명시된 대로 동물을 흉골 누운 상태로 눕힙니다. 등쪽 목 위의 가로 피부 절개를 사용하여 귓바퀴 높이까지 확장합니다.
2. 대서양-후두 관절을 노출시키기 위해 등쪽 근육을 절개합니다. 마요네즈 가위를 사용하여 대서양-후두 관절을 절개하여 머리와 몸통을 분리합니다(그림 3). 둔기 해부를 사용하여 코 높이에서 등쪽 목까지 등쪽 두개골의 피부를 부드럽게 제거하고 양쪽 눈 주위의 피부는 그대로 둡니다.
3. 한 쌍의 중간 직선 지혈기 또는 바늘 드라이버를 두개골 기저부의 구멍에 삽입합니다. 지혈기를 사용하여 foramen magnum에서 양쪽의 측두 영역까지 연장된 측면 두개골을 부드럽게 절단합니다(그림 3).
   1. 두개골 상단을 제거할 때는 지혈을 뇌의 등쪽과 평행하게 유지한다. 이렇게 하면 뇌가 손상되지 않고 뼈 제거 과정에서 흠집이 나지 않습니다.
4. 편평한 주걱을 사용하여 뇌를 가로질러 부드럽게 반사하여 시신경을 노출시킵니다. 뇌의 무게로 인한 긴장이 시신경에 가해지지 않도록 주의해야 합니다.
5. 신경이 노출된 상태에서 중간 크기의 마이크로가위를 사용하여 시신경을 가로질러 작게 절개하여 뇌에서 두 신경을 모두 절단합니다. 이 시점에서 뇌는 조직학적 평가를 위해 4°C에서 24시간 동안 PBS(4% PFA)의 파라포름알데히드에 버리거나 배치할 수 있습니다.
6. 한 쌍의 작은 홍채 가위와 한 쌍의 톱니가 있는 안과 마이크로 집게를 사용하여 눈 주위의 여분의 조직(예: 눈꺼풀, 결합 조직 등)을 조심스럽게 제거합니다. 완료되면 눈은 안와에 위치해야 하지만 안구 외 근육과 땀샘만 남아 있어야 합니다.
7. 지혈기를 작은 홍채 가위와 함께 사용하여 안구를 절단하고 시신경이 시관을 통과할 때 시신경을 절단하지 않도록 세심한 주의를 기울이십시오. 지혈기로 안구 뒤쪽의 뼈를 조심스럽게 부러뜨리고 보다 정확한 제어를 위해 작은 해부 가위를 사용합니다.
8. 뼈를 제거한 후 마이크로 가위와 가는 집게로 안구 주위를 섬세하게 잘라 지방 패드, 땀샘 및 안구 외 근육을 제거합니다. 이 과정에서 시신경을 관찰하십시오.
9. 눈은 두개골 내부를 향해 꼬리 방향으로 부드럽게 반사될 수 있어야 합니다. 이 시점에서 작은 마이크로 가위와 가는 집게를 사용하여 두개골 아래쪽 융기선에 있는 신경을 둘러싼 결합 조직을 제거합니다.
10. 이 조직이 제거되면 눈과 전체 시신경을 두개골에서 일괄적으로 들어 올릴 수 있어야 합니다. 반대쪽 눈과 신경에 대해 이 단계를 반복합니다.
11. 또한 경막초와 같은 과도한 조직의 시신경과 눈을 청소합니다. 조직학적 분석을 위해 조직을 보존할 필요가 없는 경우 -80°C에서 보관하기 전에 드라이아이스 또는 액체 질소를 사용하여 급속 동결합니다.
12. 질량 분석의 경우 망막을 지구의 내부 영역과 분리해야 하고 시신경을 분리해야 합니다. 가장 가까운 외부 지점에서 시신경을 지구본과 분리합니다. 신경을 얼음 위의 냉동 튜브에 넣고 -80°C로 옮기십시오.
    1. 작동 현미경 아래 페트리 접시에 눈의 지구본을 놓습니다. 한 쌍의 작은 마이크로 가위로 가장자리를 절개하기 전에 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 눈을 안정적으로 고정하십시오.
    2. 지구의 전체 둘레를 포함하도록 절단면을 확장합니다. 지구본은 이등분되어야 하며 앞쪽 부분은 버릴 수 있습니다.
    3. 뒤쪽 부분을 안쪽이 위로 향하게 놓고 한 쌍의 미세한 안과 핀셋을 사용하여 얇은 크림색 조직을 제거합니다. 광학 디스크에 달라붙는 것처럼 보일 수 있습니다. 이 경우 마이크로 가위를 사용하여 디스크에서 망막을 잘라냅니다.
       참고: 그런 다음 망막 조직을 얼음 위의 냉동 튜브에 넣은 후 -80°C로 옮길 수 있습니다. 그런 다음 평가를 위해 조직을 질량 분석 시설로 옮길 수 있습니다.
13. 부분 관류를 사용한 면역조직학 염색의 경우, 손상되지 않은 눈을 페트리 접시에 놓습니다. 구부러진 집게를 사용하여 눈을 안정되게 한 다음 28G 바늘이 있는 인슐린 주사기를 바늘로 잡고 바늘이 망막 쪽으로 기울어지도록 가장자리에 삽입합니다. 림버스를 따라 다른 두 지점에서 이 단계를 반복합니다. 지구의 천공은 적절한 관류를 보장하고 적절한 고정을 돕는 데 도움이 됩니다.
    알림: 글로브는 셰이커로 전환하기 전에 최소 40분 동안 4% PFA로 고정하고 유체 이동을 용이하게 하기 위해 추가로 20분 동안 저속으로 교반해야 합니다.
14. 고정 단계가 완료되면 PFA를 제거하고 PBS로 교체합니다. 바이알을 부드러운 셰이크에 15분 동안 놓고 이 단계를 반복하여 두 번째 15분 PBS 헹굼을 합니다.
15. 최종 PBS 헹굼 주기 후 PBS를 흡입하고 PBS의 30% 자당 용액으로 교체한 다음 24시간 동안 냉장 보관합니다. 자당 배양 단계에 이어 조직학적 평가를 위해 OCT에 조직을 삽입한다²⁶.

RBI와 IVI 모두에 대한 바늘의 배치와 크기를 최적화하기 위해 주입 염료(Evans Blue 염료)와 문신 잉크(그림 2B)를 사용하여 사체 동물에 대한 예비 파일럿 실험을 수행했습니다. 문신 잉크는 희석되지 않았고 Evans Blue 분말은 액체가 불투명해질 때까지 PBS에 혼합되었습니다. 우리는 이상적인 RBI는 28G 바늘을 6시와 7시 방향 사이의 중간에 안구 뒤쪽이 느껴질 때까지 아래쪽 안와 가장자리를 따라 비스듬히 삽입하는 것이라고 결론지었습니다. 이것은 시신경에 구멍을 뚫지 않고 신경에 가까운 안와 뒤쪽으로 염료를 전달했습니다. 이와 유사하게, 이 파일럿 사체 염료 시험은 IVI 주사와 함께 진행되었지만, 33G 바늘과 함께 문신 잉크의 점성이 너무 높아 Evans Blue 염료만 사용되었습니다. 주사 프로토콜이 결정되면 200g(n = 18)의 수컷 색소 Long-Evans 쥐를 사용하여 개념 증명 생체 내 치료 연구를 수행했습니다. 또한, RBI 안전성을 결정하기 위해 수컷 Long-Evans 쥐(n = 2)를 사용하여 빛에 적응된 플래시 시각 유발 전위(fVEP)를 수행했습니다. 기준선 fVEP 값을 기록한 다음 오른쪽 눈(OD)에 식염수 주사(100μL) 7일 후 fVEP를 다시 한 번 실시했습니다. 왼쪽 눈(OS)은 주사를 맞지 않았습니다. fVEP는 백색 섬광(200cd.s/m²)과 1000ms26의 자극 간격을 사용하여 30cd/^m2 배경에 대해 신호를 얻는 기존 프로토콜에 따라 수행되었습니다. fVEP 진폭은 눈이나 시점 사이에 유의미한 변화가 없었습니다(그림 4). 통계 분석은 95% 신뢰 구간의 2파 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. 집단 상호작용을 결정하기 위해 GraphPad Prism에서 Tukey의 다중 비교 검정을 수행했다²⁶.

안구 치료 투여의 효능을 확인하기 위해 다음과 같은 관심 신경 보호 치료제를 얻었습니다: 10mg/mL(RBI) 및 1mg/mL(IVI)의 이부딜라스트, 50mg/mL(RBI) 및 5mg/mL(IVI)의 타우로우르소데옥시콜산(TUDCA), 사이클로스포린 주사, 250mg/mL, 사이클로스포린 국소, 0.05% 및 아나킨라 100mg/0.67mL. 사이클로스포린 은 RBI (n=2), IVI(n=2) 및 국소적으로(n=3) 투여했다. Anakinra, ibudilast 및 TUDCA는 RBI(n = 2) 및 IVI(n = 2) 를 통해 투여되었습니다. 약물은 외상성 시신경병증의 쥐 모델에 사용하기 위한 신경 보호 치료제로서의 잠재력 때문에 선택되었습니다. 특히 사이클로스포린(Cyclosporine)이 사용되었는데, 이는 점성이 높아 다른 치료제에 비해 주사가 어려웠기 때문입니다. 조직은 앞서 언급한 방법에 따라 주입 후 24시간 후에 획득하였다. 조직은 질량분석법(TUDCA, ibudilast, cyclosporine) 또는 단백질체학 분석(anakinra)(OSU의 Pharmacoanaytic Shared Resource CORE)을 통해 분석되었습니다. 대조 망막과 신경을 수집하고 질량 분석법(Mass Spectrometry)과 단백질체학 분석을 통해 평가했습니다. 그런 다음 치료용으로 처리된 샘플을 평가하고 대조군과 비교하여 각 관심 조직에서 발견된 약물의 상대적 수준을 확인했습니다. Anakinra RBI 샘플은 깊은 마취 상태에서도 주사 중 동물의 움찔거림 반응으로 인해 분석에서 제거되었습니다. 이러한 통증 반응으로 인해 RBI Anakinra 투여는 최적의 치료 방법이 아닐 수 있습니다.

사이클로스포린은 두 주사 메커니즘을 통해 24시간 후 망막과 시신경 모두에서 검출되었습니다. 그러나 국소 전달은 두 조직 유형 모두에서 검출되지 않았습니다. IV 주사 그룹에서 망막의 농도는 383ppb, 시신경의 농도는 <5ppb였습니다. RB 주입 경로는 망막에서 16ppb, 시신경에서 49ppb를 관찰했습니다(표 1). TUDCA는 주사 후 24시간 후 두 주사 경로 중 하나에 대해 망막 또는 시신경에서 검출되지 않았습니다. Ibudilast는 RB 주입 후 한 동물의 시신경 조직에서만 검출되었습니다(<5ppb). 치료 파일럿 주사 연구는 두 주사 방법 모두 두 가지 주사 방법 후 두 조직 유형 모두에서 사이클로스포린이 존재하는 것으로 입증된 바와 같이 두 주사 프로토콜 모두 망막과 시신경에 약물을 전달할 수 있음을 보여주었습니다. 이 연구는 또한 사이클로스포린이 관심 대상 조직 내에서 높은 농도를 산출했음을 나타냅니다. 한 가지 가설은 이부딜라스트와 TUDCA가 망막과 시신경에 도달했을 수 있지만, 안구 환경에서의 반감기가 너무 짧아서 주사 후 24시간이 지나면 검출되지 않았을 수 있다는 것입니다. 이 시기에 약물이 신경 보호 효과를 가질 수 있습니다. 그러나 내부(IVI) 및 안구외(RBI) 영역 모두에서 이러한 약물의 약동학을 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

이 파일럿 연구는 또한 전체 시신경과 눈의 성공적인 제거를 통해 안구 조직 분리 프로토콜을 지원했습니다. 망막과 시신경은 치료 전달 파일럿 연구에서 분석을 위해 성공적으로 획득되었습니다(표 1). 또한 이 안구 조직 격리 박리를 활용하여 눈과 시신경을 일괄적으로 수집하여 면역조직화학을 수행할 수 있었습니다(그림 5). En-bloc 샘플은 위에서 설명한 바와 같이 두 마리의 수컷 Sprague Dawley 쥐로부터 수집되었습니다. 샘플을 OCT에 삽입하고 10μm 두께의 저온 유지 장치에서 세로로 절단했습니다. 샘플을 PBS에서 배양하여 OCT를 제거한 다음 PBS와 Triton-X-100(PBT)의 1:20 일반 당나귀 혈청에서 실온에서 2시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 절편을 다음 항체와 함께 배양했습니다: 항-β-튜불린(1:1000; MAB5564; Millipore, Burlington, MA) 및 anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP; 1:50; Z0334; DAKO, Santa Clara, CA)를 4°C에서 하룻밤 동안 PBT로 배양하고 PBS로 헹구고 당나귀 안티 마우스 Alexa 488 및 당나귀 안티 토끼 Alexa 594 (1:200)에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. 섹션을 헹구고 장착 매체와 DAPI에 장착했습니다. 샘플은 일관된 설정을 사용하여 광시야 형광 현미경 또는 컨포칼 현미경에서 이미지화되었습니다²⁶. 온전한 시신경두를 시각화할 수 있었고(그림 5A,B) β-tubulin(녹색), 신경교섬유산성 단백질(gapial fibrillary acidic protein, GFAP, 빨간색) 및 핵 마커 DAPI(파란색)와 같은 관심 마커에 대해 성공적으로 염색할 수 있었습니다. 이 해부 방법은 그림 5C에서 볼 수 있듯이 전체 시신경 샘플을 얻을 수 있었습니다.

그림 1: 유리체강내(IV) 주입 기술의 개략도. 33G 바늘, 길이 10mm, 각도 15도의 10μL 주사기를 윤부에서 눈의 2/3 지점에 삽입합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 후퇴불바(RB) 주입 기술의 개략도 및 대표 이미지. (A) RB 주입의 개략적인 이미지. 28G 바늘이 있는 0.5mL 인슐린 주사기를 6시에서 7시 방향 사이에 각도를 맞춰 아래쪽 안와 가장자리를 따라 삽입합니다. 바늘은 안구 뒤쪽이 느껴질 때까지 전진한 다음 주입하기 전에 약간 뒤로 당깁니다. (B) 파일럿 시험 중 검은색 문신 잉크와 동일한 바늘을 사용하는 RB 주입 기술의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 안구 조직 분리 중 주요 해부 지점의 개략도. 점선은 절개 지점을 나타냅니다. (A) 대서양-후두 관절이 표시된 등쪽으로 표시된 쥐. (B) 중요한 절개 자국이 표시된 등쪽에 표시된 쥐의 두개골. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: RBI 식염수 처리 코호트의 섬광 시각 유발 전위(fVEP). (A) 식염수 RBI 처리된 오른쪽 눈(OD) 및 대조군/비치료 왼쪽 눈(OS)의 평균 fVEP 진폭. 그룹 간 또는 눈 간의 fVEP 파형 진폭에서 유의미한 차이는 감지되지 않았습니다. (B) 기준선에서 그리고 주입 후 7일째에 식염수 RBI 처리된 눈의 오른쪽 눈(OD) fVEP 파형(n = 2개의 동물 샘플). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 안구 조직 격리 해부 후 수집된 설치류의 시신경두(A, B) 및 전체 눈 샘플(C)의 상피 형광 현미경 사진. (A,B) 동물에서 온전한 시신경두를 채취하여 20배 배율로 β-튜불린(녹색), 신경교섬유산성 단백질(GFAP, 빨간색) 및 핵 마커 DAPI(파란색)에 대한 마커로 염색했습니다. (C) 온전한 구체와 전체 시신경을 보여주는 en bloc eye 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 치료용 파일럿 주사. 투여 후 24시간 후에 망막과 시신경에 존재하는 것에 대해 조사한 치료제는 다음과 같다: 사이클로스포린(국소, IVI, RB), TUDCA(RB 및 IVI), 이부딜라스트(RB 및 IVI), 및 아나킨라(RB 및 IVI). 사이클로스포린은 두 주사 경로 후 망막과 시신경 모두에서 검출되었으며, 이는 당사의 RB 및 IV 주사 프로토콜이 망막과 시신경에 안구 약물을 전달할 수 있음을 나타냅니다.

주로 BRB에 의해 제기된 불침투성 장벽으로 인해 망막과 시신경에 치료제를 전달하는 것과 관련된 복잡한 어려움은 이 연구의 중요성을 강조합니다 ^3,4. IVI와 RBI 기법에 대한 탐구는 이러한 장애물을 극복하기 위한 혁신적인 접근법을 강조할 뿐만 아니라 안과 치료 및 치료 개발에 대한 광범위한 함의를 강조합니다. 이러한 연구 결과는 IVI와 RBI가 모두 감염된 안구 조직에 치료제를 직접 표적 전달할 수 있음을 보여줍니다. 이러한 표적 접근법은 전신 또는 국소 투여 경로를 통해서는 종종 달성할 수 없는 치료 농도를 달성하는 데 필수적이며^{, 2,11} 이를 통해 다양한 안구 질환에 대한 치료 효과를 향상시킬 수 있습니다.

IVI는 유리체층과 내부 망막층에 직접 접근할 수 있고(²⁷), RBI는 BRB의 무결성을 손상시키지 않으면서 시신경으로 확산할 수 있다²⁸. 이러한 통찰력은 특정 치료제를 전달하는 가장 좋은 방법에 대한 보다 미묘한 이해에 기여하여 궁극적으로 안구 질환으로 고통받는 환자의 치료 결과를 개선합니다. 여기에 기술된 IVI 및 RBI 전달 방법은 사이클로스포린과 같은 치료제를 중요 조직에 성공적으로 전달하여 효과적인 안과 치료제 개발의 가능성을 강조했다.

또한, 이러한 치료법 개발 과정을 통해 흡입 이소플루란(inhalational isoflurane)이 활성화와 회복이 모두 빠르기 때문에 본 RBI 및 IVI 프로토콜의 진정 방법으로 선택되었습니다. SALOOT는 설치류에게 중요한 지지와 안정화를 제공하는 동시에 흡입 마취제의 균일한 속도를 허용합니다. 앞서 논의한 바와 같이, RBI와 관련된 일부 위험에는 블라인드 바늘 삽입으로 인한 눈 손상 가능성, 마우스²³에 대한 retrobulbar injection 프로토콜에 설명된 압력 기술로 인한 혈류 차단 또는 기관 붕괴 가능성이 포함됩니다. 이러한 위험을 완화하기 위해 이 프로토콜은 안과 겸자를 사용하여 안정화를 위해 동물의 아래쪽 뚜껑을 잡으므로 압력 기술을 사용하지 않고 혈류 막힘이나 기관 붕괴가 발생하지 않도록 합니다. 이 기술은 또한 바늘이 삽입되는 동안 동물을 더 잘 제어할 수 있습니다. 라이브 작동 현미경의 사용과 결합된 겸자의 사용은 블라인드 삽입의 위험을 최소화하는 데 도움이 되어 작업자가 바늘 위치를 더 잘 시각화할 수 있도록 합니다. 또한 수술 플랫폼은 바늘을 삽입하는 동안 두개골이 움직이지 않도록 하는 중요한 머리 지지대를 제공합니다. 수술 플랫폼은 또한 신체의 나머지 부분에 대해 머리를 들어 올려 머리가 더 평평한 위치에 있을 수 있도록 하며, 플랫폼에는 이소플루란과 산소 연결이 있기 때문에 자세를 잡는 동안 마취 수준이 손상되지 않습니다. IVI 기법은 치료제를 유리체액에 직접 주입하여 BRB를 우회하는 독특한 능력 때문에 채택되었습니다. 이 기술은 침습적 특성으로 인해 안구 손상의 가능성이 있지만 바늘이 렌즈를 긁지 않도록 조심스럽게 확인하고 바늘을 천천히 제거한 다음 주사 후 10-15초 동안 눈에 압력을 가하면 위험을 최소화할 수 있습니다.

이 독특한 조직 회수 방법을 통해 망막 및 시신경 샘플의 성공적인 제거 및 분석이 가능했습니다. 눈과 신경을 일괄적으로 분리하여 시신경 머리와 전체 눈 면역 형광 염색으로 입증된 바와 같이 전체 시각 시스템을 평가할 수 있는 데 도움이 됩니다(그림 5). 이 방법을 사용하면 뇌, 시신경 및 지구를 하향식으로 시각화할 수 있으므로 조직의 전체 구조와 무결성을 더 쉽게 보존할 수 있습니다.

이 연구는 하나의 동물 성별만 사용하고 상대적으로 작은 표본 크기를 사용하는 등 잠재적인 한계가 있습니다. RB 주사는 또한 치료제 누출의 내재적 한계와 관련이 있습니다. RB 주사 후 치료제는 후구강 공간에서 지구 앞쪽으로 이동할 수 있습니다. 이 기술은 삽입 각도를 변경하고 바늘을 가능한 한 궤도 뒤쪽에 가깝게 유지함으로써 이러한 고유한 제한을 최소화하는 것을 목표로 했습니다. 또한, 치료 투여 후 10-15초 동안 가벼운 압력을 유지하는 것이 치료제가 후구강 공간 밖으로 이동하는 것을 방지하는 데 도움이 되는 것으로 확인되었습니다.

이러한 방법은 소동물 외상성 안구 손상 모델에 대한 치료 개입을 위한 향후 작업에서 활용될 것입니다. IVI 방법은 병아리와 생쥐에 사용하기 위해 확장되었습니다. 그러나 바늘 크기와 치료량을 조정해야 합니다. 병아리의 경우 28-29G의 인슐린 바늘과 20μL의 치료 용적이 최적인 것으로 밝혀졌지만,²⁹ 생쥐의 경우 31G 인슐린 바늘과 2μL의 치료 용적이 이상적인 것으로 확인되었다. IVI 기법은 다른 동물로 번역됨에 따라 거의 변화가 없었다. RBI를 다른 종으로 번역하려면 바늘 크기와 부피를 조정해야 하지만, 종 간의 고유한 해부학적 차이를 고려하는 한 전체 기술은 번역 가능한 상태로 유지되어야 합니다.

소동물 모델에서 얻은 통찰력은 약물 전달 메커니즘에 대한 이해를 증진하고 치료 프로토콜을 최적화하는 데 매우 중요합니다. 궁극적으로 이 연구는 광학 치료의 질을 크게 향상시킬 수 있는 보다 효과적인 치료법을 위한 토대를 마련하여 시력을 보존하고 임상 실습에서 결과를 개선하는 데 진전을 이룹니다.

저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.

이 연구는 미국 국방부 시력 연구 프로그램 상 W81XWH-15-1-0074 및 W81XWH-22-1-0989의 일부 자금 지원을 받았습니다. 여기에 포함된 의견 또는 주장은 저자의 개인적인 견해이며 공식적인 것으로 해석되거나 육군성 또는 국방부의 견해를 반영하는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 이 연구 보조금은 시력 연구의 여성 학자를 위한 실명 방지 젊은 연구자 학생 펠로우십 상(Ohio Affiliate of Prevent Blindness Young Investigator Student Fellowship Award for Females Scholars in Vision Research)의 일부 지원을 받았습니다. 로스 재단의 지원에 감사드립니다. 서비스는 P30EY032857 따라 OSU Vision Sciences Research Core Program에서 수행되었습니다. 오하이오 주립 대학 연구소 및 동물 자원(ULAR)에 감사드립니다. 또한 Reilly 학부 연구실 멤버인 Michelle Mosko, Emma Lally, Sam Duckworth, Eve Howard에게 감사드립니다. 또한 SALOOT 디자인에 기여한 김봉수 씨와 Elizabeth Urbanski, Ryan Webb에게도 감사드립니다. 그림 1, 그림 2A 및 그림 3 은 BioRender.com 로 만들어졌습니다.