Administration thérapeutique oculaire et prélèvement tissulaire avancé chez le rat adulte

Cette étude présente une méthodologie pour l’administration de produits thérapeutiques dans la rétine et les nerfs optiques du rat adulte. De plus, une méthode unique de prélèvement tissulaire est introduite pour une collecte descendante en bloc du nerf optique et de la rétine chez un rat adulte.

L’administration thérapeutique au segment postérieur de l’œil, y compris la rétine et le nerf optique, est compliquée par la présence de barrières hémato-encéphalique et hémato-rétinienne. De petits modèles animaux, tels que les rats, sont utilisés pour étudier diverses pathologies oculaires. Bien que l’administration thérapeutique à l’œil postérieur soit un défi, sa réalisation est essentielle pour traiter les troubles oculaires, dont beaucoup nécessitent une validation dans de petits modèles animaux pour leur pertinence translationnelle. Par conséquent, deux techniques d’administration thérapeutique postérieure sont présentées : l’injection intravitréenne (IVI) et l’injection rétrobulbaire (RBI) pour une utilisation chez les rats adultes. De plus, une méthode d’ablation en bloc des yeux et des nerfs optiques est introduite pour diverses techniques d’analyse histologique et moléculaire. Le protocole de dissection permet une observation complète du système neuro-visuel tout en minimisant les lésions post-mortem des tissus rétiniens et des nerfs optiques. L’administration thérapeutique de la cyclosporine à la rétine et au nerf optique a été obtenue, avec des concentrations détectables observées vingt-quatre heures après l’injection à l’aide de l’IVI et de la RBI. De plus, des échantillons de rétine et de nerfs en bloc ont été extraits avec succès pour une analyse histologique complète des tissus oculaires, facilitant ainsi l’observation complète de la rétine et du système neuro-visuel au sens large.

L’administration de traitements à la rétine et au nerf optique est incroyablement difficile en raison de l’anatomie complexe de^l’œil1,2, en particulier de la présence de la barrière hémato-rétinienne (BRB)^3,4,5. Le BRB sert à protéger la rétine contre l’invasion de la circulation systémique, mais constitue un adversaire difficile à l’administration thérapeutique car la circulation thérapeutique systémique est souvent bloquée par le BRB ^6,7. Les petites molécules lipophiles peuvent facilement diffuser à travers le BRB, mais les molécules plus grosses et hydrophiles ont plus de mal à accéder à la rétine⁶. Les injections intravitréennes (IVI) et rétrobulbaires (RBI) permettent d’administrer des médicaments aux tissus oculaires, surmontant ainsi les limites imposées par le BRB. L’IVI constitue un compromis prometteur en administrant des traitements dans l’environnement interne de l’œil ^8,9. Cette méthode nécessite que le médicament traverse le vitré, contournant ainsi le BRB, et se diffuse à travers la rétine et la choroïde afin d’atteindre le nerf optique⁷. Le point produit est délivré derrière l’œil dans l’espace rétrobulbaire¹⁰. Les traitements peuvent être administrés par diffusion à travers les tissus et les glandes de l’espace rétrobulbaire, affectant le nerf optique et les structures environnantes sans pénétrer directement dans la rétine, ce qui maintient l’intégrité du BRB. En administrant des médicaments directement ou indirectement dans l’œil, les injections intravitréennes et rétrobulbaires peuvent atteindre des concentrations locales plus élevées du médicament thérapeutique, ce qui augmente son efficacité par rapport à l’administration topique ou systémique (orale ou intraveineuse)². Ceci est particulièrement important pour les traitements qui nécessitent une action rapide ou une puissance élevée, comme on le voit dans de nombreuses maladies oculaires. L’administration ciblée limite également l’exposition du reste du corps au médicament, ce qui réduit le risque d’effets non ciblés et aide à minimiser les effets indésirables potentiels qui peuvent survenir lorsque les médicaments sont administrés par voie topique, orale ou intraveineuse¹¹.

D’autres injections périoculaires, telles que les injections sous-conjonctivales, sous-ténon postérieures et sous-rétiniennes, ont leurs propres avantages et limites ^2,5. Il a été observé que les injections de sous-ténon postérieur délivrent des concentrations élevées de médicament aux tissus oculaires ; Cependant, l’injection de sous-ténon est plus proche de la sclérale que la vasculature orbitaire ^5,12. En revanche, le RBI place le thérapeutique plus près du nerf optique que le subténon postérieur ou le sous-conjonctival¹³. Cela peut signifier que les pathologies du nerf optique favorisent les traitements administrés par RBI par rapport aux autres types d’injection périoculaire. Les injections de sous-ténon postérieur présentent des risques associés, notamment le strabisme, l’hyphéma et une pression intraoculaire élevée⁵. Une pression intraoculaire élevée est également un facteur de risque signalé dans les injections IVI, sous-conjonctivales et sous-rétiniennes². Ces types d’injection nécessitent souvent un dosage répétitif afin d’obtenir l’effet thérapeutique souhaité². D’autres facteurs de risque associés aux injections sous-rétiniennes, aux injections sous-conjonctivales et à l’IVI comprennent la formation de cataracte, l’hémorragie rétinienne, le décollement de la rétine et l’inflammation². Ces injections IVI, sous-rétiniennes et sous-conjonctivales sont plus invasives que les injections RBI, car ces injections sont intraoculaires². Le RBI peut être considéré comme moins invasif car il place le thérapeutique dans l’espace rétrobulbaire, sans pénétrer directement l’aiguille dans le globe de l’œil. D’autres stratégies d’administration thérapeutique moins invasives, telles que l’administration topique, ne permettent pas d’administrer suffisamment de médicament, moins de 5 % du médicament étant conservé sur la surface oculaire ^2,5.

L’IVI est une technique de premier plan dans les modèles précliniques qui est utilisée pour sa capacité à délivrer des agents thérapeutiques directement dans le segment postérieur de l’œil. L’IVI délivre le médicament directement dans l’humeur vitrée, ce qui en fait une technique d’administration privilégiée pour le traitement localisé¹⁴. La technique IVI permet au thérapeutique de contourner la barrière hémato-rétinienne, qui est un obstacle courant à la pénétration des médicaments dans la rétine¹⁴. L’IVI introduit la possibilité d’une inflammation et de lésions des structures oculaires, de sorte qu’une adhésion méticuleuse à la procédure doit être employée¹⁴. Pour minimiser le décollement de la rétine et la formation de cataracte, Chiu et al. décrivent une approche IVI qui met l’accent sur une insertion en biseau à 45 degrés et une injection au niveau du par plana, en évitant le cristallin, la rétine, le muscle oculaire et les vaisseaux¹⁵. Dans cette technique, une aiguille de 30 G est insérée dans la sclérotique nasale pour une administration thérapeutique¹⁵. L’IVI est toujours associée à des risques en raison de son caractère invasif. Les risques potentiels comprennent le décollement de la rétine, la formation d’une cataracte, une endophtalmie ou une hémorragie¹⁶. La nature invasive des techniques d’IVI augmente également la pression intraoculaire, comme le montre une expérience sur des yeux porcins réalisée par Ikjong Park et ^al.16. L’étude montre des changements dans la pression intraoculaire au cours des différentes étapes de l’insertion de l’aiguille et de l’injection de liquide. Ils signalent une variation substantielle de la pression intraoculaire au cours de la procédure¹⁶.

Les RBI ont été utilisés avec succès dans des études antérieures comme moyen d’administration thérapeutique aux rongeurs. L’une de ces études a comparé les effets de divers analogues de la prostaglandine administrés via RBI¹⁷. Des rats albinos ont reçu un RBI avec une aiguille de 26 G de 0,1 mL injectée à travers la zone latérale du fornix inférieur à un angle de 45 degrés¹⁷. Le protocole utilisé dans cette étude a été adapté d’une méthode décrite précédemment dans laquelle les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale (IP) de chloralhydrate¹⁸. Une autre étude menée sur des rats a comparé des gouttes topiques à des injections rétrobulbaires¹⁹. Les rats ont été anesthésiés par une injection IP de kétamine/xylazine, et le RBI a été administré par une aiguille de 30 G¹⁹. Contrairement aux méthodes de sédation précédemment discutées, une étude observant les effets de RBI sur la graisse orbitaire a utilisé de l’isoflurane par inhalation pour calmer les rats avant RBI²⁰. Bien que ces études donnent un aperçu des anesthésiques et des spécifications de l’aiguille qui pourraient être efficaces, le positionnement et la manipulation des animaux pendant la procédure ne sont pas discutés.

Diverses études chez la souris effectuent également des RBI pour les méthodes d’administration thérapeutique. Une étude a comparé l’IBR à l’injection latérale de la veine caudale pour induire avec succès le syndrome néphrotique²¹. Une deuxième étude a également comparé les deux mêmes techniques d’injection dans l’administration de produits de contraste pour l’imagerie cardiaque²². Les souris ont été anesthésiées avec de l’isoflurane par inhalation et injectées dans la face médiale de l’œil²². Les deux études ont adapté leur méthode RBI à partir d’un protocole précédemment écrit. Il est important de noter que ce protocole a nommé leur injection comme rétro-orbitaire, mais a décrit le lieu d’injection comme l’espace rétrobulbaire derrière l’œil. Les auteurs de ce protocole ont utilisé l’isoflurane par inhalation comme méthode de sédation préférée, notant l’activation rapide et le temps de récupération des souris²³. Dans le cas d’un RBI, l’œil était partiellement dépassé de l’orbite en appliquant une pression sur la peau autour de l’œil²³. Ensuite, l’aiguille a été introduite au niveau du biseau médial du canthus vers le bas à un angle de 30 degrés et a été insérée jusqu’à ce qu’elle atteigne la base de l’œil²³. Des précautions doivent être prises lors de l’application d’une pression sur l’animal, car un blocage accidentel du flux sanguin ou un collapsus trachéal peut survenir²³. L’injecteur est également aveugle à la pointe de l’aiguille lors de l’insertion, et par conséquent, endommager l’œil est un risque associé. ²³ Endommager l’œil lors de l’administration d’un traitement est un risque critique dans cette expérience, car causer des lésions supplémentaires sape directement les résultats de l’étude. Il convient également de noter que la technique de positionnement et de manipulation décrite précédemment a été appliquée à des souris et ne comprenait pas de commentaires sur l’applicabilité aux rats.

Il existe de nombreuses façons de tenter l’ablation du nerf optique et de la rétine. L’une de ces méthodes a exploré l’ablation des nerfs optiques et des yeux en bloc, préservant ainsi un chiasma optique intact²⁴. Cette méthode est la plus comparable à l’étude actuelle, car les yeux et les nerfs optiques individuels sont également conservés pour l’ablation en bloc ; Cependant, le chiasma optique est séparé. Il serait de la plus haute importance de faire preuve de prudence dans cette procédure en raison de la complexité de la procédure. Dans la méthode actuelle, nous commençons la dissection via le crâne caudal et travaillons rostralement afin de fournir un accès de manière à limiter les dommages aux nerfs optiques et à permettre à l’ensemble du nerf de rester intact. De plus, le maintien de l’intégrité du nerf et de son attachement à l’œil est crucial pour le processus d’intégration, car les lésions de chaque partie du nerf peuvent correspondre à une observation pathologique^{différente24}. L’orientation du nerf optique est importante à prendre en compte car la façon dont il est intégré permet différentes coupes efficaces, ce qui peut être important pour l’analyse histologique.

Un appareil sur mesure connu sous le nom de table d’opération ophtalmique de laboratoire pour petits animaux (SALOOT, une plateforme de chirurgie ophtalmique) est composé d’une série de matériaux imprimés en 3D pour fournir une anesthésie et maintenir l’animal dans une position stable pour les injections thérapeutiques oculaires. La conception SALOOT permet la stabilité de la tête et des structures oculaires pour les procédures ophtalmiques, ce qui améliore la vitesse et la reproductibilité des opérations tout en permettant l’administration d’anesthésie gazeuse et le piégeage des particules expirées. Le SALOOT est un bloc imprimé en trois dimensions doté d’une réduction concave pour maintenir le corps du rat avec une région plus étroite à l’avant pour maintenir la tête de l’animal dans un cône nasal avec une entrée d’isoflurane. Sous le cône de nez se trouve un petit réservoir et une sortie d’échappement. Les méthodes suivantes ont été développées pour l’administration oculaire thérapeutique et la récupération précise de tissu oculaire ; Ils ont été conçus pour étudier les tissus après un traumatisme oculaire, il est donc crucial de délimiter les effets du traumatisme, de l’injection, du traitement et de la dissection pour éviter une interprétation confuse des résultats.

Cet article présente deux méthodes d’injection thérapeutique oculaire, l’injection intravitréenne et l’injection rétrobulbaire, pour une utilisation chez le rat adulte. De plus, une méthode de prélèvement tissulaire est présentée pour l’ablation en bloc du nerf optique et de la rétine intacts d’un rat adulte. Ces techniques permettent d’étudier les effets oculaires et péri-oculaires de la pathologie induite et du traitement.

Toutes les expériences ont été menées conformément à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de l’Ohio. Des rats Sprague Dawley mâles pesant ~200 g et âgés d’environ 2 mois ont été utilisés pour cette étude²⁵. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Injection intravitréenne (IVI)

1. Fixez l’isoflurane et les déchets aux ports de fixation SALOOT. Anesthésier l’animal à l’aide des procédures standard d’isoflurane conformément à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et au protocole approuvé de l’IACUC.
   REMARQUE : Alternativement, si l’animal était déjà sous anesthésie à la suite d’une autre séance d’essai ophtalmique (c.-à-d. mélange de kétamine et de xylazine, 90 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine), transférez l’animal dans la plateforme de chirurgie ophtalmique et titrez l’anesthésie avec de l’isoflurane (rapport 3 oxygène : 3 isoflurane) pour assurer le maintien d’une profondeur d’anesthésie adéquate.
2. Placez la plateforme de chirurgie ophtalmique avec l’animal anesthésié sous un microscope opératoire en direct. Évaluez la profondeur de l’anesthésique par le réflexe de retrait de la pédale.
3. Placez une à deux gouttes de solution ophtalmique de chlorhydrate de tétracaïne à 0,5 % dans l’œil ou les yeux opérés. Appliquez une pommade ophtalmique topique lubrifiante telle que l’hypromellose 0,3 % sur l’œil controlatéral si aucune manipulation ne doit être effectuée.
   1. Ensuite, utilisez une à deux gouttes de povidone iodée à 5 % sur la surface oculaire et, à l’aide d’un coton-tige, appliquez de la povidone iodée sur la peau entourant l’œil.
4. À l’aide d’une seringue de 10 μL munie d’une aiguille de 33 g à pointe 4 d’une longueur de 10 mm et d’un angle de 15 degrés, prélever 0,9 % de chlorure de sodium bactériostatique. Rincez la seringue et l’aiguille avec la solution saline avant de tremper l’aiguille dans un stérilisateur à billes chaudes.
   1. Laissez-le refroidir avant de continuer. Une fois l’aiguille refroidie, prélevez le traitement d’intérêt à la quantité souhaitée (4 μL).
      REMARQUE : Pour les études de validation de concept, de l’encre de tatouage non diluée et du colorant Evan’s Blue dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ont été utilisés. La poudre Blue d’Evan a été mélangée avec du PBS jusqu’à ce qu’elle soit opaque. Pour les études de validation de concept thérapeutique, les concentrations suivantes ont été utilisées : ibudilast à 1 mg/mL, acide tauroursodésoxycholique (TUDCA) 5 mg/mL, cyclosporine injectable, 250 mg/mL et anakinra 100 mg/0,67 mL. Les poudres thérapeutiques ont été diluées dans une solution saline bactériostatique à 0,9 %.
5. À l’aide d’une pince ophtalmique fine avec les dents, saisissez doucement le tissu scléral au niveau du limbe pour le stabiliser. Il y aura un léger anneau rouge autour de l’iris. Utilisez cet anneau comme point de repère, insérez l’aiguille, côté biseauté vers le bas, et injectez-le dans l’œil postérieur.
   REMARQUE : Assurez-vous d’incliner l’aiguille vers la rétine et n’insérez l’aiguille qu’aux 2/3 de la largeur (Figure 1). Assurez-vous que l’aiguille ne raye pas le cristallin, car cela entraînerait la formation de cataracte.
6. Une fois le thérapeutique injecté, retirez lentement l’aiguille. Fermez l’œil et maintenez la pression pendant au moins 10 à 15 s avant de rincer avec une solution saline.
7. Arrêtez de donner de l’isoflurane à l’animal et retirez-le de la plateforme de chirurgie ophtalmique. Déposez une goutte d’hypromellose 0,3 % dans chaque œil, puis laissez l’animal récupérer sur un coussin chauffant.

2. Injection rétrobulbaire (RBI)

1. Fixez l’isoflurane et les déchets aux ports de fixation SALOOT. Anesthésier l’animal à l’aide des procédures standard d’isoflurane.
   REMARQUE : Alternativement, si l’animal était déjà sous anesthésie à la suite d’une autre séance d’essai ophtalmique (c.-à-d. mélange de kétamine et de xylazine, 90 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine), transférez l’animal dans la plateforme de chirurgie ophtalmique et titrez l’anesthésie avec de l’isoflurane (rapport 3 oxygène : 3 isoflurane) pour assurer le maintien d’une profondeur d’anesthésie adéquate.
2. Placez la plateforme de chirurgie ophtalmique avec l’animal anesthésié sous un microscope opératoire en direct. Évaluez la profondeur de l’anesthésique par le réflexe de retrait de la pédale.
3. Placez une à deux gouttes de solution ophtalmique de chlorhydrate de tétracaïne à 0,5 % dans l’œil ou les yeux opérés. Appliquez une pommade ophtalmique topique lubrifiante (hypromellose 0,3 %) sur l’œil controlatéral si aucune manipulation ne doit être effectuée.
   1. Ensuite, utilisez une à deux gouttes de povidone iodée à 5 % sur la surface oculaire et, à l’aide d’une lance oculaire, appliquez de la povidone iodée sur la peau entourant l’œil.
4. Munissez-vous d’une seringue à insuline de 0,5 mL à l’aide d’une aiguille de 28 G. Établissez la thérapeutique d’intérêt à la quantité souhaitée (100 μL).
   REMARQUE : Pour les études de validation de concept, de l’encre de tatouage non diluée et du colorant Evan’s Blue dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ont été utilisés. La poudre Blue d’Evan a été mélangée avec du PBS jusqu’à ce qu’elle soit opaque. Pour les études de validation de concept thérapeutique, les concentrations suivantes ont été utilisées : ibudilast à 10 mg/mL, TUDCA à 50 mg/mL, cyclosporine injectable à 250 mg/mL et anakinra à 100 mg/0,67 mL. Les poudres thérapeutiques ont été diluées dans une solution saline bactériostatique à 0,9 %.
5. À l’aide d’une pince ophtalmique fine avec les dents, saisissez doucement la paupière inférieure pour la stabiliser. Insérez l’aiguille, côté biseau vers le bas, à un angle à mi-chemin entre 6 et 7 heures le long du bord orbitaire inférieur jusqu’à ce que l’arrière de la cavité oculaire soit ressenti. Tirez légèrement l’aiguille vers l’arrière, puis injectez lentement le médicament (Figure 2).
6. Retirez doucement et lentement l’aiguille. Ensuite, fermez l’œil et maintenez la pression pendant au moins 10 à 15 secondes avant de rincer avec une solution saline.
7. Arrêtez de donner de l’isoflurane à l’animal et retirez-le de la plateforme de chirurgie ophtalmique. Déposez une goutte d’hypromellose 0,3 % dans chaque œil, puis laissez l’animal récupérer sur un coussin chauffant.

3. Dissection d’isolement du tissu oculaire

1. Une fois que l’animal a été euthanasié par asphyxie au CO₂ ou comme indiqué dans le protocole approuvé de l’IACUC, placez l’animal en décubitus sternal. Utilisez une incision cutanée transversale sur le cou dorsal, s’étendant jusqu’au niveau du pavillon de l’oreille.
2. Disséquer la musculature dorsale pour exposer l’articulation atlanto-occipitale. À l’aide de ciseaux à mayonnaise, on peut inciser l’articulation atlanto-occipitale, en séparant la tête du corps (figure 3). À l’aide d’une dissection émoussée, retirez délicatement la peau du crâne dorsal du niveau du nez jusqu’au cou dorsal, en laissant la peau autour des deux yeux intacte.
3. Insérez une paire d’hémostatiques droits moyens ou de tourne-aiguilles dans le foramen magnum à la base du crâne. Utilisez les hémostats pour percer doucement le crâne latéral qui s’étend du foramen magnum à la région temporale des deux côtés (Figure 3).
   1. Lorsque vous enlevez le haut du crâne, gardez les hémostats parallèles à la face dorsale du cerveau. Cela garantira que le cerveau reste intact et n’est pas entaillé lors du processus d’ablation de l’os.
4. À l’aide d’une spatule plate, réfléchissez doucement le cerveau rostralement pour exposer les nerfs optiques. Des précautions doivent être prises pour que la tension du poids du cerveau ne soit pas appliquée aux nerfs optiques.
5. Avec les nerfs exposés, prenez une paire de microciseaux moyens et faites une petite incision à travers le chiasma optique, sectionnant les deux nerfs du cerveau. À ce stade, le cerveau peut être jeté ou placé dans du paraformaldéhyde dans du PBS (4 % de PFA) pendant 24 h à 4 °C pour une évaluation histologique.
6. À l’aide d’une paire de petits ciseaux à iris et d’une paire de micro-pinces ophtalmiques dentées, retirez soigneusement l’excès de tissu (c’est-à-dire les paupières, le tissu conjonctif, etc.) autour de l’œil. Une fois terminé, l’œil doit être situé dans l’orbite oculaire, mais avec seulement le muscle et les glandes extraoculaires encore présents.
7. À l’aide des hémostats en conjonction avec les petits ciseaux à iris, coupez l’orbite oculaire, en prenant grand soin de ne pas couper le nerf optique lorsqu’il passe dans le conduit optique. Cassez soigneusement l’os à l’arrière de la cavité oculaire avec les hémostats, et pour un contrôle plus précis, utilisez les petits ciseaux de dissection.
8. Une fois l’os retiré, coupez délicatement autour de l’orbite oculaire avec une paire de microciseaux et des pinces fines pour retirer les coussinets adipeux, les glandes et les muscles extraoculaires. Assurez-vous d’être attentif aux nerfs optiques pendant ce processus.
9. L’œil doit pouvoir être doucement réfléchi caudalement vers l’intérieur du crâne. À ce stade, utilisez de petits microciseaux et des pinces fines pour retirer le tissu conjonctif entourant le nerf sur la crête inférieure du crâne.
10. Une fois ce tissu retiré, l’œil et le nerf optique complet devraient pouvoir être soulevés du crâne en bloc. Répétez ces étapes pour l’œil et le nerf controlatéraux.
11. De plus, nettoyez le nerf optique et l’œil de l’excès de tissu tel que la gaine durale. Si les tissus n’ont pas besoin d’être conservés pour l’analyse histologique, il faut les congeler à l’aide de glace carbonique ou d’azote liquide avant de les conserver à -80 °C.
12. Pour la spectrométrie de masse, la rétine doit être isolée de la région interne du globe et le nerf optique doit être isolé. Séparez le nerf optique du globe au point extérieur le plus proche. Placez le nerf dans un cryotube sur de la glace avant de le transférer à -80 °C.
    1. Placez le globe de l’œil sur une boîte de Pétri sous un microscope opératoire. Utilisez une paire de pinces incurvées pour maintenir l’œil stable avant de faire une incision au niveau du limbe avec une paire de petits microciseaux.
    2. Étendez la coupe pour englober toute la circonférence du globe. Le globe doit être coupé en deux et la partie antérieure peut être jetée.
    3. Placez la partie postérieure à l’intérieur vers le haut et, à l’aide d’une pince à épiler ophtalmique fine, retirez le mince tissu de couleur crème. Il peut sembler coller au disque optique. Si cela se produit, utilisez les microciseaux pour couper la rétine du disque.
       REMARQUE : Le tissu rétinien peut ensuite être placé dans un cryotube sur de la glace avant de passer à -80 °C. Les tissus peuvent ensuite être transférés à l’installation de spectrométrie de masse pour évaluation.
13. Pour une coloration immunohistologique par perfusion partielle, placez l’œil intact sur une boîte de Pétri. Utilisez une paire de pinces incurvées pour maintenir l’œil stable avant de prendre une seringue à insuline avec une aiguille de 28 G et de l’insérer au niveau du limbe, avec l’aiguille inclinée vers la rétine. Répétez cette étape à deux autres points le long du limbe. La ponction du globe aide à assurer une perfusion adéquate et aide à une fixation appropriée.
    REMARQUE : Le globe doit être fixé à 4 % de PFA pendant au moins 40 min avant de passer à un agitateur et de l’agiter à basse vitesse pendant 20 minutes supplémentaires pour faciliter le mouvement du fluide.
14. Une fois l’étape de fixation terminée, retirez le PFA et remplacez-le par du PBS. Placez les flacons sur une légère agitation pendant 15 minutes, puis répétez cette étape pour un deuxième rinçage PBS de 15 minutes.
15. Après le dernier cycle de rinçage PBS, aspirez le PBS et remplacez-le par une solution de saccharose à 30 % dans du PBS, puis réfrigérez pendant 24 h. Après l’étape d’incubation du saccharose, incorporer le tissu dans l’OCT pour l’évaluation histologique²⁶.

Des expériences pilotes préliminaires ont été réalisées sur des cadavres à l’aide d’un colorant par injection (colorant Evans Blue) et d’une encre de tatouage (figure 2B) afin d’optimiser l’emplacement et la taille de l’aiguille pour l’IBR et l’IVI. L’encre de tatouage n’était pas diluée, puis la poudre d’Evans Blue était mélangée à du PBS jusqu’à ce que le liquide devienne opaque. Nous avons conclu que le RBI idéal consistait en une aiguille de 28 G insérée à un angle à mi-chemin entre 6 et 7 heures le long du bord orbital inférieur jusqu’à ce que l’arrière de la cavité oculaire soit ressenti. Celui-ci a délivré les colorants à l’arrière de l’orbite, près du nerf, sans perforer le nerf optique. De même, cet essai pilote de colorant sur cadavre a été suivi de l’injection IVI, mais seul le colorant Evans Blue a été utilisé car l’encre de tatouage était trop visqueuse en conjonction avec l’aiguille 33 G. Une fois les protocoles d’injection déterminés, des études thérapeutiques in vivo de validation de principe ont été réalisées sur des rats Long-Evans mâles pigmentés à 200 g (n = 18). De plus, des potentiels évoqués visuels du flash adaptés à la lumière (fVEP) ont été effectués à l’aide de rats Long-Evans mâles (n = 2) pour déterminer l’innocuité des RBI. Les valeurs de base de la fVEP ont été enregistrées, puis 7 jours après l’injection de solution saline (100 μL) dans l’œil droit (OD), la fVEP a de nouveau été effectuée. L’œil gauche n’a reçu aucune injection. Les fVEP ont été réalisés selon des protocoles préexistants, dans lesquels les signaux ont été obtenus sur un fond de 30 cd/m² à l’aide d’un flash blanc (200 cd.s/m²) et d’un intervalle interstimulus de 1000 ms²⁶. Les amplitudes du fVEP n’ont montré aucun changement significatif entre les yeux ou les points temporels (Figure 4). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’une ANOVA à deux vagues avec un intervalle de confiance de 95 %. Les tests de comparaisons multiples de Tukey ont été effectués dans GraphPad Prism pour déterminer les interactions de groupe²⁶.

Pour déterminer l’efficacité de l’administration thérapeutique oculaire, les thérapies neuroprotectrices d’intérêt suivantes ont été obtenues : ibudilast à 10 mg/mL (RBI) et 1 mg/mL (IVI), acide tauroursodésoxycholique (TUDCA) 50 mg/mL (RBI) et 5 mg/mL (IVI), cyclosporine injectable, 250 mg/mL, cyclosporine topique, 0,05 % et anakinra 100 mg/0,67 mL. La cyclosporine a été administrée par RBI (n = 2), IVI (n = 2) et par voie topique (n = 3). L’anakinra, l’ibudilast et le TUDCA ont été administrés par RBI (n = 2) et IVI (n = 2). Les médicaments ont été sélectionnés pour leur potentiel en tant que thérapies neuroprotectrices à utiliser dans un modèle de neuropathie optique traumatique chez le rat. La cyclosporine a été utilisée en particulier parce qu’elle était très visqueuse et, par conséquent, difficile à injecter par rapport à d’autres traitements. Les tissus ont été obtenus 24 h après l’injection selon la méthode indiquée précédemment. Les tissus ont été analysés par spectrométrie de masse (TUDCA, ibudilast et cyclosporine) ou par analyse protéomique (anakinra) (Pharmacoanaytic Shared Resource CORE de l’OSU). Les rétines et les nerfs de contrôle ont été collectés et évalués par spectrométrie de masse et analyse protéomique. Des échantillons traités à des fins thérapeutiques ont ensuite été évalués et comparés à des témoins afin de déterminer les niveaux relatifs de médicament trouvés dans chacun des tissus d’intérêt. Les échantillons d’Anakinra RBI ont été retirés de l’analyse en raison de la réponse de sursaut de l’animal pendant l’injection, même sous anesthésie profonde. En raison de cette réponse à la douleur, l’administration de RBI Anakinra peut ne pas être une approche thérapeutique optimale.

La cyclosporine a été détectée dans la rétine et le nerf optique 24 h plus tard par les deux mécanismes d’injection ; Cependant, l’administration topique n’a pas été détectée dans l’un ou l’autre type de tissu. Dans le groupe d’injection IV, la rétine avait une concentration de 383 ppb et le nerf optique avait <5 ppb. La voie d’injection de RB a observé 16 ppb dans la rétine et 49 ppb dans le nerf optique (Tableau 1). TUDCA n’a été détecté ni dans la rétine ni dans le nerf optique 24 h après l’injection, pour l’une ou l’autre des voies d’injection. L’ibudilast a été détecté dans le tissu du nerf optique d’un seul animal après l’injection de RB (<5 ppb). L’étude pilote d’injection thérapeutique a indiqué que les deux protocoles d’injection sont capables d’administrer des médicaments à la rétine et au nerf optique, comme en témoigne la présence de cyclosporine dans les deux types de tissus après les deux méthodes d’injection. Cette étude indique également que la cyclosporine a donné des concentrations élevées dans les tissus cibles d’intérêt. Une hypothèse est que l’ibudilast et le TUDCA ont peut-être atteint la rétine et le nerf optique, mais que leur demi-vie dans l’environnement oculaire a peut-être été trop courte pour être détectée 24 heures après l’injection. Il se peut que les médicaments aient un impact neuroprotecteur à ce moment-là ; cependant, d’autres études seraient nécessaires pour confirmer la pharmacocinétique de ces médicaments dans les régions interne (IVI) et extraoculaire (RBI).

Cette étude pilote a également soutenu le protocole d’isolement des tissus oculaires grâce à l’ablation réussie de l’ensemble du nerf optique et des yeux. Les rétines et les nerfs optiques ont été analysés avec succès dans le cadre de l’étude pilote sur l’administration thérapeutique (tableau 1). De plus, grâce à l’utilisation de cette dissection d’isolement du tissu oculaire, les yeux et les nerfs optiques en bloc ont pu être collectés pour l’immunohistochimie (Figure 5). Des échantillons en bloc ont été prélevés sur deux rats Sprague Dawley mâles, comme indiqué ci-dessus. Les échantillons ont été noyés dans l’OCT et sectionnés longitudinalement sur un cryostat de 10 μm d’épaisseur. Les échantillons ont été incubés dans du PBS pour éliminer l’OCT, puis incubés dans du sérum d’âne normal 1:20 dans du PBS plus Triton-X-100 (PBT) à température ambiante pendant 2 h. Des coupes ont ensuite été incubées avec les anticorps suivants : anti-β-tubuline (1:1000 ; MAB5564 ; Millipore, Burlington, MA) et la protéine acide fibrillaire anti-gliale (GFAP ; 1:50 ; N° Z0334 ; DAKO, Santa Clara, CA) en PBT pendant la nuit à 4°C, rincé au PBS, et incubé chez l’âne anti-souris Alexa 488 et l’âne anti-lapin Alexa 594 (1:200) en PBT pendant la nuit à 4 °C. Les sections ont été rincées et montées dans un support de montage plus DAPI. Les échantillons ont été imagés à l’aide d’un microscope à fluorescence à champ large ou d’un microscope confocal à l’aide de réglages cohérents²⁶. La tête intacte du nerf optique a pu être visualisée (Figure 5A,B) et colorée avec succès pour les marqueurs d’intérêt suivants : β-tubuline (vert), protéine acide fibrillaire gliale (GFAP ; rouge) et marqueur nucléaire DAPI (bleu). Cette méthode de dissection a permis d’obtenir des échantillons complets de nerf optique, comme le montre la figure 5C.

Figure 1 : Schéma de la technique d’injection intravitréenne (IV). Une seringue de 10 μL avec une aiguille de 33 G, d’une longueur de 10 mm et d’un angle de 15 degrés est insérée aux 2/3 de la hauteur dans l’œil au niveau du limbe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Image schématique et représentative de la technique d’injection rétrobulbaire (RB). (A) Image schématique de l’injection RB. Une seringue à insuline de 0,5 mL munie d’une aiguille de 28 G est insérée le long du bord orbitaire inférieur à un angle compris entre 6 et 7 heures. L’aiguille est avancée jusqu’à ce que l’arrière de la cavité oculaire soit palpé, puis légèrement tirée vers l’arrière avant l’injection. (B) Image représentative de la technique d’injection RB utilisant la même aiguille avec de l’encre de tatouage noire lors d’essais pilotes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Schéma des principaux points de dissection lors de l’isolement du tissu oculaire. Les lignes pointillées indiquent les points d’incision. (A) Rat présenté dorsalement avec l’articulation atlanto-occipitale marquée. (B) Crâne de rat affiché dorsalement avec d’importantes marques d’incision notées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Potentiels évoqués visuels flash (fVEP) de cohortes traitées au sérum physiologique RBI. (A) Amplitudes moyennes de la fVEP des yeux droits traités au sérum physiologique RBI et des yeux gauches témoins/non traités. Aucune différence significative n’a été détectée dans l’amplitude des formes d’onde fVEP entre les groupes ou entre les yeux. (B) Yeux droits (OD) formes d’onde fVEP d’yeux traités par RBI salin au départ, puis sept jours après l’injection (n = 2 échantillons d’animaux). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Micrographies épifluorescentes de la tête du nerf optique (A, B) et d’un échantillon oculaire en bloc (C) de rongeurs prélevés après la dissection d’isolement du tissu oculaire. (A,B) Des têtes de nerfs optiques intactes ont été prélevées sur les animaux et ont été colorées avec des marqueurs pour la β-tubuline (vert), la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP ; rouge) et le marqueur nucléaire DAPI (bleu) à un grossissement de 20x. (C) Échantillon oculaire en bloc montrant le globe intact et le nerf optique complet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Injections pilotes thérapeutiques. La présence dans la rétine et le nerf optique des agents thérapeutiques suivants a été étudiée 24 h après l’administration : cyclosporine (topique, IVI, RB), TUDCA (RB et IVI), ibudilast (RB et IVI) et Anakinra (RB et IVI). La cyclosporine a été détectée dans la rétine et le nerf optique après les deux voies d’injection, ce qui indique que nos protocoles d’injection RB et IV sont capables d’administrer un médicament oculaire à la rétine et au nerf optique.

Les défis complexes associés à l’administration de traitements à la rétine et au nerf optique, principalement en raison de la barrière imperméable posée par le BRB, soulignent l’importance de cette étude ^3,4. L’exploration des techniques d’IVI et d’IBR met non seulement en évidence des approches innovantes pour surmonter ces obstacles, mais met également l’accent sur les implications plus larges pour les soins oculaires et le développement thérapeutique. Ces résultats démontrent que l’IVI et l’IRB peuvent faciliter l’administration ciblée de produits thérapeutiques directement dans les tissus oculaires affectés. Cette approche ciblée est essentielle pour atteindre des concentrations thérapeutiques qui sont souvent inaccessibles par des voies d’administration systémiques ou topiques ^2,11, améliorant ainsi l’efficacité des traitements pour diverses maladies oculaires.

L’analyse comparative de ces techniques d’injection révèle leurs avantages uniques : l’IVI permet un accès direct aux couches vitrée et rétinienne interne²⁷, tandis que la RBI permet la diffusion vers le nerf optique sans compromettre l’intégrité du BRB²⁸. Ces informations contribuent à une compréhension plus nuancée de la meilleure façon d’administrer des agents thérapeutiques spécifiques, améliorant ainsi les résultats du traitement pour les patients souffrant de maladies oculaires. Les méthodes d’administration IVI et RBI décrites ici ont permis d’administrer avec succès des traitements, tels que la cyclosporine, aux tissus critiques, soulignant le potentiel de développement de thérapies oculaires efficaces.

De plus, grâce à ce processus de développement de méthode thérapeutique, l’isoflurane par inhalation a été choisi comme méthode de sédation pour ce protocole RBI et IVI, car il agit rapidement à la fois dans l’activation et la récupération. Le SALOOT fournit un soutien et une stabilisation cruciaux au rongeur, tout en permettant un taux uniforme d’anesthésique inhalé. Comme nous l’avons vu précédemment, certains risques associés à l’infection par l’intestin résident comprennent des dommages possibles à l’œil en raison de l’insertion aveugle d’une aiguille, ainsi qu’un blocage du flux sanguin ou un collapsus trachéal dû à la technique de pression décrite dans le protocole d’injection rétrobulbaire pour les souris²³. Pour aider à atténuer ces risques, ce protocole utilise des pinces ophtalmiques pour saisir la paupière inférieure de l’animal afin de le stabiliser, renonçant ainsi à la technique de pression et éliminant soit le blocage du flux sanguin, soit le collapsus trachéal. Cette technique permet également un meilleur contrôle de l’animal lors de l’insertion de l’aiguille. L’utilisation de pinces combinée à l’utilisation du microscope opératoire en direct permet de minimiser le risque d’insertion à l’aveugle, ce qui permet à l’opérateur de mieux visualiser l’emplacement de l’aiguille. De plus, la plate-forme chirurgicale fournit un soutien crucial de la tête, ce qui empêche le crâne de bouger lors de l’insertion de l’aiguille. La plate-forme chirurgicale offre également une élévation de la tête par rapport au reste du corps, ce qui permet à la tête d’être dans une position plus horizontale, et comme la plate-forme dispose de raccordements à l’isoflurane et à l’oxygène, le niveau d’anesthésie n’est jamais compromis lors du positionnement. La technique IVI a été adoptée pour sa capacité unique à contourner le BRB en injectant des produits thérapeutiques directement dans l’humeur vitrée. La technique introduit la possibilité de lésions oculaires en raison de sa nature invasive, mais le risque est minimisé en s’assurant soigneusement que l’aiguille ne raye pas le cristallin, en retirant lentement l’aiguille et en appliquant une pression sur l’œil pendant 10 à 15 secondes après l’injection.

Cette méthode unique de prélèvement et d’analyse des échantillons de nerfs rétiniens et optiques en bloc a permis de prélever et d’analyser avec succès des échantillons de nerfs rétiniens. L’isolement de l’œil et du nerf en bloc a été réalisé, ce qui permet d’évaluer l’ensemble du système visuel, comme en témoignent la tête du nerf optique et la coloration par immunofluorescence de l’œil complet (Figure 5). Cette méthode permet une visualisation descendante du cerveau, des nerfs optiques et des globes, ce qui permet de préserver plus facilement la structure globale et l’intégrité de nos tissus.

Cette étude présente des limites potentielles, notamment l’utilisation d’un seul sexe animal et une taille d’échantillon relativement petite. Les injections de RB sont également associées à la limitation inhérente des fuites thérapeutiques. Après l’injection de RB, les traitements peuvent migrer de l’espace rétrobulbaire vers l’avant du globe. Cette technique visait à minimiser cette limitation inhérente en modifiant l’angle d’insertion et en gardant l’aiguille aussi près que possible de l’arrière de l’orbite. De plus, il a été déterminé que le maintien d’une légère pression après l’administration thérapeutique pendant 10 à 15 s aidait à empêcher les traitements de migrer hors de l’espace rétrobulbaire.

Ces méthodes seront utilisées dans des travaux futurs pour l’intervention thérapeutique dans un modèle de blessure oculaire traumatique chez le petit animal. Les méthodes IVI ont été étendues pour être utilisées chez les poussins et les souris ; Cependant, la taille de l’aiguille et les volumes thérapeutiques doivent être ajustés. Pour les poussins, une aiguille à insuline de 28-29 G et 20 μL de volume thérapeutique se sont avérés optimaux²⁹, mais chez les souris, il a été déterminé qu’une aiguille de 31 G et 2 μL de volume thérapeutique étaient idéaux. La technique IVI a peu changé avec la traduction à d’autres animaux. Pour la traduction de la RBI à d’autres espèces, la taille et le volume de l’aiguille devraient être adaptés, mais la technique globale devrait rester traduisible tant que les différences anatomiques inhérentes entre les espèces sont prises en compte.

Les connaissances obtenues à partir de petits modèles animaux sont inestimables pour faire progresser la compréhension des mécanismes d’administration des médicaments et optimiser les protocoles de traitement. En fin de compte, cette recherche jette les bases de thérapies plus efficaces qui pourraient améliorer considérablement la qualité des soins optiques, faisant des progrès vers la préservation de la vision et l’amélioration des résultats dans la pratique clinique.

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Ce travail a été partiellement financé par les subventions W81XWH-15-1-0074 et W81XWH-22-1-0989 du ministère de la Défense des États-Unis. Les opinions ou affirmations contenues dans ce document sont les opinions personnelles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme officielles ou comme reflétant les opinions du ministère de l’Armée ou du ministère de la Défense. Cette subvention de recherche a été financée en partie par l’Ohio Affiliate of Prevent Blindness Young Investigator Student Fellowship Award for Females Scholars in Vision Research. Nous sommes reconnaissants du soutien de la Fondation Ross. Les services ont été rendus dans le cadre du programme de base de recherche en sciences de la vision de l’OSU sous P30EY032857. Nous tenons à remercier le laboratoire et les ressources animales de l’Université d’État de l’Ohio (ULAR). De plus, nous tenons à remercier Michelle Mosko, Emma Lally, Sam Duckworth et Eve Howard, membres du laboratoire de premier cycle de Reilly. Nous tenons également à remercier Bongsu Kim d’avoir contribué à la conception de SALOOT, ainsi qu’Elizabeth Urbanski et Ryan Webb. Les figures 1, 2A et 3 ont été créées avec BioRender.com.