Administración Terapéutica Ocular y Recuperación Avanzada de Tejido en Ratas Adultas

Este estudio presenta una metodología para la administración de terapias en la retina y los nervios ópticos de la rata adulta. Además, se introduce un método único de recuperación de tejido para una colección en bloque de arriba hacia abajo del nervio óptico y la retina en una rata adulta.

La administración terapéutica al segmento posterior del ojo, incluyendo la retina y el nervio óptico, se complica por la presencia de barreras hematoencefálicas y hematorretinianas. Los modelos animales pequeños, como las ratas, se utilizan para estudiar diversas patologías oculares. Si bien la administración terapéutica al ojo posterior es un desafío, lograrlo es esencial para el tratamiento de los trastornos oculares, muchos de los cuales requieren validación en modelos de animales pequeños para su relevancia traslacional. Por lo tanto, se presentan dos técnicas de administración terapéutica posterior: inyección intravítrea (IVI) e inyección retrobulbar (RBI) para su uso en ratas adultas. Además, se introduce un método para la extirpación en bloque de los ojos y los nervios ópticos para diversas técnicas de análisis histológico y molecular. El protocolo de disección permite la observación completa del sistema neurovisual al tiempo que minimiza las lesiones post-mortem en los tejidos de la retina y el nervio óptico. Se logró la administración exitosa de la ciclosporina terapéutica a la retina y al nervio óptico, con concentraciones detectables observadas veinticuatro horas después de la inyección utilizando IVI y RBI. Además, se extrajeron con éxito muestras de retina y nervio en bloque para el análisis histológico completo del tejido, lo que facilitó la observación completa de la retina y el sistema neurovisual en general.

La administración de terapias a la retina y al nervio óptico es increíblemente difícil debido a la compleja anatomía del ojo ^1,2, específicamente la presencia de la barrera hematorretiniana (BRB)^3,4,5. El BRB sirve para proteger la retina de la invasión de la circulación sistémica, pero es un oponente desafiante para la administración terapéutica, ya que la circulación terapéutica sistémica a menudo está bloqueada por el BRB ^6,7. Las moléculas lipofílicas pequeñas pueden difundirse fácilmente a través del BRB, pero las moléculas más grandes e hidrofílicas tienen más dificultades para acceder a la retina⁶. Las inyecciones intravítreas (IVI) y retrobulbares (RBI) permiten la administración de fármacos a los tejidos oculares, superando las limitaciones impuestas por el BRB. El IVI sirve como un compromiso prometedor al administrar terapias en el entorno interno del ojo ^8,9. Este método requiere que el fármaco atraviese el vítreo, evitando así el BRB, y se difunda a través de la retina y la coroides para llegar al nervio óptico⁷. El RBI se administra detrás del ojo en el espacio retrobulbar¹⁰. La terapéutica puede administrarse por difusión a través de los tejidos y glándulas en el espacio retrobulbar, afectando el nervio óptico y las estructuras circundantes sin entrar directamente en la retina, que mantiene la integridad del BRB. Al administrar fármacos directa o indirectamente en el ojo, tanto las inyecciones intravítreas como las retrobulbares pueden lograr concentraciones locales más altas del fármaco terapéutico, lo que mejora su eficacia en comparación con la administración tópica o sistémica (oral o intravenosa)². Esto es particularmente importante para tratamientos que requieren una acción rápida o alta potencia, como se ve en muchas enfermedades oculares. La administración dirigida también limita la exposición del resto del cuerpo al fármaco, lo que reduce el riesgo de efectos fuera del objetivo y ayuda a minimizar los posibles efectos adversos que pueden ocurrir cuando los medicamentos se administran por vía tópica, oral o intravenosa¹¹.

Otras inyecciones perioculares, como la subconjuntival, la subtenon posterior y la subretiniana, tienen sus propios beneficios y limitaciones ^2,5. Se ha observado que las inyecciones posteriores de subtenón administran altas concentraciones de fármaco a los tejidos oculares; sin embargo, la inyección de subtenón está más cerca del escleral que de la vascularura orbitaria ^5,12. Por el contrario, el RBI sitúa el terapéutico más cerca del nervio óptico que el subtenón posterior o subconjuntival¹³. Esto puede significar que las patologías del nervio óptico favorecen las terapias administradas por RBI sobre otros tipos de inyecciones perioculares. Las inyecciones de subtenón posterior tienen riesgos asociados, incluyendo estrabismo, hifema y presión intraocular elevada⁵. La presión intraocular elevada también es un factor de riesgo reportado en las inyecciones IVI, subconjuntivales y subretinianas². Estos tipos de inyección a menudo requieren dosis repetidas para lograr el efecto terapéutico deseado². Otros factores de riesgo asociados con las inyecciones subretinianas, las inyecciones subconjuntivales y la IVI incluyen la formación de cataratas, hemorragia retiniana, desprendimiento de retina e inflamación². Estas inyecciones IVI, subretinianas e inyecciones subconjuntivales son más invasivas que las inyecciones RBI, ya que estas inyecciones son intraoculares². El RBI puede considerarse menos invasivo, ya que coloca el tratamiento en el espacio retrobulbar, sin entrar directamente en la aguja en el globo ocular. Otras estrategias de administración terapéutica menos invasivas, como la administración tópica, no logran una administración suficiente del fármaco, ya que menos del 5% del fármaco se retiene en la superficie ocular ^2,5.

La IVI es una técnica destacada en modelos preclínicos que se utiliza por su capacidad para administrar agentes terapéuticos directamente en el segmento posterior del ojo. IVI administra el fármaco directamente en el humor vítreo, por lo que es una técnica de administración preferida para el tratamiento localizado¹⁴. La técnica IVI permite al terapéutico eludir la barrera hematorretiniana, que es un obstáculo común para la penetración del fármaco en la retina¹⁴. La IVI presenta la posibilidad de inflamación y daño a las estructuras oculares, por lo que se debe emplear una adherencia meticulosa al procedimiento¹⁴. Para minimizar el desprendimiento de retina y la formación de cataratas, Chiu et al. describen un abordaje IVI que enfatiza una inserción de bisel de 45 grados y la inyección a nivel de la parplana, evitando el cristalino, la retina, el músculo ocular y los vasos¹⁵. En esta técnica, se inserta una aguja de 30 G en la esclerótica nasal para la administración terapéutica¹⁵. La IVI todavía se asocia con riesgos debido a su naturaleza invasiva. Los riesgos potenciales incluyen desprendimiento de retina, formación de cataratas, endoftalmita o hemorragia¹⁶. El carácter invasivo de las técnicas IVI también aumenta la presión intraocular, como se demuestra en un experimento con ojos porcinos realizado por Ikjong Park et ^al.16. El estudio muestra cambios en la presión intraocular durante diferentes etapas de la inserción de la aguja y la inyección de líquido. Relatan variación sustancial de la presión intraocular durante el procedimiento¹⁶.

Los RBI se han utilizado con éxito en estudios anteriores como medio de administración terapéutica a roedores. Uno de estos estudios comparó los efectos de varios análogos de prostaglandinas administrados a través de RBI¹⁷. A las ratas albinas se les administró un RBI con una aguja de 26 G de 0,1 mL inyectado insertado a través del área lateral del fórnix inferior en un ángulo de 45 grados¹⁷. El protocolo utilizado en este estudio fue adaptado de un método previamente descrito en el que las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal (IP) de clorhidrato¹⁸. Otro estudio realizado en ratas comparó las gotas tópicas con las inyecciones retrobulbares¹⁹. Las ratas fueron anestesiadas a través de una inyección IP de ketamina/xilacina, y el RBI se administró a través de una aguja de 30 G¹⁹. En contraste con los métodos de sedación discutidos anteriormente, un estudio que observó los efectos de RBI en la grasa orbital utilizó isoflurano inhalado para sedar a las ratas antes de RBI²⁰. Si bien estos estudios proporcionan información sobre qué anestésicos y especificaciones de agujas podrían tener éxito, no se discute la posición y el manejo de los animales durante el procedimiento.

Varios estudios en ratones también realizan RBI para los métodos de administración terapéutica. Un estudio comparó la RBI con la inyección lateral de la vena de la cola para inducir con éxito el síndrome nefrótico²¹. Un segundo estudio también comparó las mismas dos técnicas de inyección en la administración de medios de contraste para imágenes cardíacas²². Los ratones fueron anestesiados con isoflurano inhalado e inyectados en el lado medial del ojo²². Ambos estudios adaptaron su método RBI a partir de un protocolo previamente escrito. Es importante tener en cuenta que este protocolo denominó su inyección como retroorbital, pero describió el lugar de la inyección como el espacio retrobulbar detrás del ojo. Los autores de este protocolo utilizaron isoflurano inhalatorio como método de sedación preferido, observando el rápido tiempo de activación y recuperación de los ratones²³. En el caso de una RBI, el ojo sobresalía parcialmente de la cuenca aplicando presión sobre la piel alrededor del ojo²³. A continuación, se introducía la aguja en el canto medial, con el lado biselado hacia abajo, en un ángulo de 30 grados, y se introducía hasta llegar a la base del ojo²³. Se debe tener cuidado al aplicar presión al animal, ya que puede ocurrir una obstrucción accidental del flujo sanguíneo o un colapso traqueal²³. El inyector también es ciego a la punta de la aguja al insertarlo y, por lo tanto, dañar el ojo es un riesgo asociado. ²³ Dañar el ojo durante la administración terapéutica es un riesgo crítico en este experimento, ya que causar lesiones adicionales socava directamente los resultados del estudio. También hay que tener en cuenta que la técnica de posicionamiento y manejo descrita anteriormente se llevó a cabo en ratones y no incluyó comentarios sobre la aplicabilidad a ratas.

Hay muchas maneras en las que se ha intentado la extirpación del nervio óptico y la retina. Uno de estos métodos exploró la extirpación de los nervios ópticos y los ojos en bloque, preservando un quiasma óptico intacto²⁴. Este método es el más comparable al estudio actual, ya que los ojos individuales y los nervios ópticos también se conservan para su extirpación en bloque; sin embargo, el quiasma óptico está separado. Tener precaución en este procedimiento sería de suma importancia debido a la complejidad del procedimiento. En el método actual, comenzamos la disección a través del cráneo caudal y trabajamos rostralmente para proporcionar acceso de una manera que limite el daño a los nervios ópticos y permita que todo el nervio permanezca intacto. Además, mantener el nervio intacto y unido al ojo es crucial para el proceso de incrustación, ya que el daño en cada parte del nervio puede corresponder a una observación patológica diferente²⁴. Es importante tener en cuenta la orientación del nervio óptico, ya que la forma en que está incrustado permite diferentes secciones transversales, lo que puede ser importante para el análisis histológico.

Un dispositivo hecho a medida conocido como mesa de operaciones oftálmicas de laboratorio para pequeños animales (SALOOT, una plataforma de cirugía oftálmica) se compone de una serie de materiales impresos en 3D para proporcionar anestesia y mantener al animal en una posición estable para las inyecciones terapéuticas oculares. El diseño de SALOOT permite la estabilidad de la cabeza y las estructuras oculares para los procedimientos oftálmicos, lo que mejora la velocidad y la reproducibilidad de las operaciones, al tiempo que permite la administración de anestesia con gas y la eliminación de las partículas de exhalación. El SALOOT es un bloque impreso tridimensional con una reducción cóncava para sujetar el cuerpo de la rata con una región más estrecha en la parte delantera para sujetar la cabeza del animal en un cono de nariz con una entrada de isoflurano. Debajo del cono de la nariz hay un pequeño depósito y una salida de escape. Se desarrollaron los siguientes métodos para la administración ocular terapéutica y la recuperación precisa de tejido ocular; Fueron diseñados para estudiar tejidos después de un traumatismo ocular, por lo que es crucial delinear los efectos del traumatismo, la inyección, el tratamiento y la disección para evitar la interpretación confusa de los hallazgos.

En este artículo se presentan dos métodos de inyección terapéutica ocular, las inyecciones intravítreas y retrobulbares, para su uso en ratas adultas. Además, se presenta un método de recuperación de tejido para la extirpación en bloque del nervio óptico y la retina intactos de una rata adulta. Estas técnicas permiten investigar los efectos oculares y perioculares de la patología inducida y el tratamiento.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y visual y fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Estatal de Ohio. Para este estudio se utilizaron ratas Sprague Dawley macho con un peso de ~200 g y alrededor de 2 meses de edad²⁵. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Inyección intravítrea (IVI)

1. Conecte el isoflurano y los cables de desagüe a los puertos de conexión SALOOT. Anestesiar al animal utilizando los procedimientos estándar de isoflurano siguiendo la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y Visual y el protocolo aprobado por la IACUC.
   NOTA: Alternativamente, si el animal ya estaba bajo anestesia de otra sesión de pruebas oftálmicas (es decir, mezcla de ketamina/xilacina; 90 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina), transfiera al animal a la plataforma de cirugía oftálmica y ajuste la anestesia con isoflurano (relación 3 oxígeno: 3 isoflurano) para garantizar que se mantenga la profundidad adecuada de la anestesia.
2. Coloque la plataforma de cirugía oftálmica con el animal anestesiado bajo un microscopio quirúrgico vivo. Evaluar la profundidad anestésica a través del reflejo de retirada del pedal.
3. Coloque una o dos gotas de solución oftálmica de clorhidrato de tetracaína al 0,5% en el ojo o los ojos que se están operando. Aplique una pomada oftálmica tópica lubricante como hipromelosa al 0,3% en el ojo contralateral si no se va a realizar ninguna manipulación.
   1. Luego, use una o dos gotas de povidona yodada al 5% en la superficie ocular y, con un hisopo de algodón, aplique povidona yodada en la piel que rodea el ojo.
4. Utilice una jeringa de 10 μL con aguja de 33 G con punta estilo 4 con una longitud de 10 mm y un ángulo de 15 grados y extraiga cloruro de sodio bacteriostático al 0,9%. Enjuague la jeringa y la aguja con la solución salina antes de sumergir la aguja en un esterilizador de perlas caliente.
   1. Deje que se enfríe antes de continuar. Una vez que la aguja se haya enfriado, extraiga el tratamiento de interés hasta la cantidad deseada (4 μL).
      NOTA: Para los estudios de prueba de concepto, se utilizaron tinta para tatuajes no diluida y tinte Evan's Blue en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El polvo azul de Evan se mezcló con PBS hasta que quedó opaco. Para los estudios de prueba de concepto terapéutico, se utilizaron las siguientes concentraciones: ibudilast a 1 mg/mL, ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) 5 mg/mL, inyección de ciclosporina, 250 mg/mL y anakinra 100 mg/0,67 mL. Los polvos terapéuticos se diluyeron en solución salina bacteriostática al 0,9%.
5. Con pinzas oftálmicas finas con dientes, agarre suavemente el tejido escleral en el limbo para estabilizarlo. Habrá un anillo rojo tenue alrededor del iris. Use este anillo como punto de referencia, inserte la aguja, con el lado biselado hacia abajo, e inyéctelo en el ojo posterior.
   NOTA: Asegúrese de inclinar la aguja hacia la retina e inserte la aguja solo 2/3 del camino (Figura 1). Asegúrese de que la aguja no raye la lente, ya que esto provocará la formación de cataratas.
6. Después de inyectar el tratamiento, retire lentamente la aguja. Cierre el ojo y mantenga la presión durante al menos 10-15 segundos antes de enjuagar con solución salina.
7. Suspender el tratamiento con isoflurano y retirarlo de la plataforma de cirugía oftalmológica. Coloque una gota de hipromelosa al 0,3% en cada ojo y luego deje que el animal se recupere en una almohadilla térmica.

2. Inyección retrobulbar (RBI)

1. Conecte el isoflurano y los cables de desagüe a los puertos de conexión SALOOT. Anestesiar al animal utilizando procedimientos estándar de isoflurano.
   NOTA: Alternativamente, si el animal ya estaba bajo anestesia de otra sesión de pruebas oftálmicas (es decir, mezcla de ketamina/xilacina; 90 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina), transfiera al animal a la plataforma de cirugía oftálmica y ajuste la anestesia con isoflurano (relación 3 oxígeno: 3 isoflurano) para garantizar que se mantenga la profundidad adecuada de la anestesia.
2. Coloque la plataforma de cirugía oftálmica con el animal anestesiado bajo un microscopio quirúrgico vivo. Evaluar la profundidad anestésica a través del reflejo de retirada del pedal.
3. Coloque una o dos gotas de solución oftálmica de clorhidrato de tetracaína al 0,5% en el ojo o los ojos que se están operando. Aplicar pomada oftálmica tópica lubricante (hipromelosa 0,3%) en el ojo contralateral si no se va a realizar ninguna manipulación.
   1. Luego, use una o dos gotas de povidona yodada al 5% en la superficie ocular y, con una lanza ocular, aplique povidona yodada en la piel que rodea el ojo.
4. Obtenga una jeringa de insulina de 0,5 mL con una aguja de 28 G. Elaborar el tratamiento de interés hasta la cantidad deseada (100 μL).
   NOTA: Para los estudios de prueba de concepto, se utilizaron tinta para tatuajes no diluida y tinte Evan's Blue en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El polvo azul de Evan se mezcló con PBS hasta que quedó opaco. Para los estudios de prueba de concepto terapéutico, se utilizaron las siguientes concentraciones: ibudilast a 10 mg/mL, TUDCA a 50 mg/mL, ciclosporina inyectable 250 mg/mL y anakinra a 100 mg/0,67 mL. Los polvos terapéuticos se diluyeron en solución salina bacteriostática al 0,9%.
5. Con pinzas oftálmicas finas con dientes, agarre suavemente el párpado inferior para estabilizarlo. Inserte la aguja, con el lado bisel hacia abajo, en un ángulo a medio camino entre las 6 y las 7 en punto a lo largo del borde orbital inferior hasta que se sienta la parte posterior de la cuenca ocular. Tire de la aguja ligeramente hacia atrás y luego inyecte lentamente el tratamiento (Figura 2).
6. Retire la aguja suave y lentamente. A continuación, cierre el ojo y mantenga la presión durante al menos 10-15 segundos antes de enjuagar con solución salina.
7. Suspender el tratamiento con isoflurano y retirarlo de la plataforma de cirugía oftalmológica. Coloque una gota de hipromelosa al 0,3% en cada ojo y luego deje que el animal se recupere en una almohadilla térmica.

3. Disección de aislamiento de tejido ocular

1. Después de que el animal haya sido sacrificado a través de la asfixia por CO₂ o como se indica en el Protocolo aprobado de la IACUC, coloque al animal en decúbito esternal. Utilice una incisión transversal en la piel sobre el cuello dorsal, que se extiende hasta el nivel del pabellón auricular de la oreja.
2. Diseccionar la musculatura dorsal para exponer la articulación atlanto-occipital. Utilice unas tijeras de mayonesa para hacer una incisión a través de la articulación atlanto-occipital, separando la cabeza del cuerpo (Figura 3). Usando una disección roma, retire suavemente la piel del cráneo dorsal desde el nivel de la nariz hasta el cuello dorsal, dejando intacta la piel alrededor de ambos ojos.
3. Inserte un par de hemostáticos rectos medianos o destornilladores de aguja en el foramen magnum en la base del cráneo. Utilice los hemostáticos para atravesar suavemente el cráneo lateral que se extiende desde el foramen magnum hasta la región temporal en ambos lados (Figura 3).
   1. Al extirpar la parte superior del cráneo, mantenga los hemostáticos paralelos a la cara dorsal del cerebro. Esto asegurará que el cerebro permanezca intacto y no se corte en el proceso de extracción ósea.
4. Con una espátula plana, refleje suavemente el cerebro rostralmente para exponer los nervios ópticos. Se debe tener cuidado para que la tensión del peso del cerebro no se aplique a los nervios ópticos.
5. Con los nervios expuestos, toma un par de tijeras medianas y haz una pequeña incisión a través del quiasma óptico, cortando ambos nervios del cerebro. En este punto, el cerebro puede desecharse o colocarse en paraformaldehído en PBS (4% PFA) durante 24 h a 4 °C para su evaluación histológica.
6. Con un par de tijeras pequeñas para el iris y un par de micropinzas oftálmicas dentadas, retire con cuidado el exceso de tejido (es decir, párpados, tejido conectivo, etc.) alrededor del ojo. Una vez completado, el ojo debe estar situado en la cuenca ocular pero con solo el músculo extraocular y las glándulas aún presentes.
7. Usando los hemostáticos junto con las tijeras pequeñas del iris, corte a través de la órbita ocular, teniendo mucho cuidado de no cortar el nervio óptico a medida que pasa a través del canal óptico. Rompa con cuidado el hueso en la parte posterior de la cuenca ocular con los hemostáticos y, para un control más preciso, utilice las tijeras de disección pequeñas.
8. Una vez que se haya extraído el hueso, corte delicadamente alrededor de la órbita ocular con un par de microtijeras y pinzas finas para eliminar las almohadillas de grasa, las glándulas y los músculos extraoculares. Asegúrese de estar atento a los nervios ópticos durante este proceso.
9. El ojo debe poder reflejarse suavemente caudalmente hacia el interior del cráneo. En este punto, use microtijeras pequeñas y pinzas finas para extirpar el tejido conectivo que rodea el nervio en la cresta inferior del cráneo.
10. Una vez que se ha extirpado este tejido, el ojo y todo el nervio óptico deberían poder levantarse del cráneo en bloque. Repita estos pasos para el ojo y el nervio contralateral.
11. Además, limpie el nervio óptico y el ojo del exceso de tejido, como la vaina dural. Si no es necesario conservar los tejidos para su análisis histológico, congelarlos rápidamente con hielo seco o nitrógeno líquido antes de almacenarlos a -80 °C.
12. Para la espectrometría de masas, la retina debe aislarse de la región interna del globo y el nervio óptico debe aislarse. Separe el nervio óptico del globo terráqueo en el punto exterior más cercano. Coloque el nervio en un tubo criogénico sobre hielo antes de transferirlo a -80 °C.
    1. Coloque el globo ocular en una placa de Petri bajo un microscopio operativo. Use un par de pinzas curvas para mantener el ojo firme antes de hacer una incisión en el limbo con un par de microtijeras pequeñas.
    2. Extienda el corte para abarcar toda la circunferencia del globo. El globo debe dividirse en dos y la porción anterior se puede descartar.
    3. Coloque la sección posterior con el lado interior hacia arriba y, con un par de pinzas oftálmicas finas, retire el pañuelo delgado de color crema. Puede parecer que se adhiere al disco óptico. Si esto ocurre, use las microtijeras para cortar la retina del disco.
       NOTA: A continuación, el tejido de la retina puede colocarse en un tubo criogénico sobre hielo antes de transferirlo a -80 °C. A continuación, los tejidos pueden transferirse a la instalación de espectrometría de masas para su evaluación.
13. Para la tinción inmunohistológica mediante perfusión parcial, coloque el ojo intacto en una placa de Petri. Use un par de pinzas curvas para mantener el ojo firme antes de tomar una jeringa de insulina con una aguja de 28 G e insertarla en el limbo, con la aguja inclinada hacia la retina. Repita este paso en otros dos puntos a lo largo del limbo. La punción del globo ayuda a asegurar una perfusión adecuada y ayuda a una fijación adecuada.
    NOTA: El globo debe fijarse en PFA al 4% durante al menos 40 minutos antes de pasar a un agitador y agitar a baja velocidad durante 20 minutos adicionales para facilitar el movimiento del fluido.
14. Una vez completado el paso de fijación, retire el PFA y reemplácelo con PBS. Coloque los viales en un batido suave durante 15 minutos y luego repita este paso durante un segundo enjuague de PBS de 15 minutos.
15. Después del ciclo final de enjuague de PBS, aspire el PBS y reemplácelo con una solución de sacarosa al 30% en PBS, y luego refrigere durante 24 h. Después de la etapa de incubación de la sacarosa, incrustar el tejido en la OCT para su evaluación histológica²⁶.

Se realizaron experimentos piloto preliminares en animales cadáveres utilizando tinte de inyección (tinte azul Evans) y tinta de tatuaje (Figura 2B) para optimizar la colocación y el tamaño de la aguja tanto para RBI como para IVI. La tinta del tatuaje no se diluyó, y luego el polvo Evans Blue se mezcló en PBS hasta que el líquido se volvió opaco. Llegamos a la conclusión de que el RBI ideal consistía en una aguja de 28 G insertada en un ángulo a medio camino entre las 6 y las 7 en punto a lo largo del borde orbital inferior hasta que se palpaba la parte posterior de la cuenca ocular. De este modo, los tintes llegaban a la parte posterior de la órbita, cerca del nervio, sin perforar el nervio óptico. Del mismo modo, a esta prueba piloto de tinte para cadáveres se le siguió con la inyección IVI, pero solo se utilizó el tinte Evans Blue, ya que la tinta del tatuaje era demasiado viscosa junto con la aguja de 33 G. Una vez que se determinaron los protocolos de inyección, se realizaron estudios terapéuticos in vivo de prueba de concepto utilizando ratas Long-Evans macho pigmentadas a 200 g (n = 18). Además, se llevaron a cabo potenciales evocados visuales (fVEP) adaptados a la luz utilizando ratas Long-Evans macho (n = 2) para determinar la seguridad de la RBI. Se registraron los valores basales de fVEP y, 7 días después de la inyección de solución salina (100 μL) en el ojo derecho (OD), se volvieron a realizar fVEP. Los ojos izquierdos (OS) no recibieron ninguna inyección. Los fVEPs se llevaron a cabo siguiendo protocolos preexistentes, en los que las señales se obtuvieron contra un fondo de 30 cd/^m2 utilizando un destello blanco (200 cd.s/^m2) y un intervalo interestímulo de 1000 ms²⁶. Las amplitudes de fVEP no mostraron cambios significativos entre ojos o puntos de tiempo (Figura 4). El análisis estadístico se realizó mediante un ANOVA de dos ondas con un intervalo de confianza del 95%. Las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey se llevaron a cabo en GraphPad Prism para determinar las interacciones grupales²⁶.

Para determinar la eficacia de la administración terapéutica ocular se obtuvieron las siguientes terapias neuroprotectoras de interés: ibudilast a 10 mg/mL (RBI) y 1 mg/mL (IVI), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) 50 mg/mL (RBI) y 5 mg/mL (IVI), ciclosporina inyectable, 250 mg/mL, ciclosporina tópica, 0,05% y anakinra 100 mg/0,67 mL. La ciclosporina se administró a través de RBI (n = 2), IVI (n = 2) y por vía tópica (n = 3). Anakinra, ibudilast y TUDCA se administraron a través de RBI (n = 2) e IVI (n = 2). Los fármacos se seleccionaron por su potencial como terapéuticos neuroprotectores para su uso en un modelo de neuropatía óptica traumática en ratas. En particular, se utilizó ciclosporina porque era muy viscosa y, por lo tanto, difícil de inyectar en relación con otras terapias. Los tejidos se obtuvieron 24 h después de la inyección siguiendo el método anteriormente indicado. Los tejidos se analizaron mediante espectrometría de masas (TUDCA, ibudilast y ciclosporina) o análisis proteómico (anakinra) (OSU's Pharmacoanaytic Shared Resource CORE). Las retinas y los nervios de control se recolectaron y evaluaron mediante espectrometría de masas y análisis proteómico. A continuación, se evaluaron las muestras tratadas terapéuticamente y se compararon con los controles para determinar los niveles relativos del fármaco encontrados en cada uno de los tejidos de interés. Las muestras de Anakinra RBI se retiraron del análisis debido a la respuesta de temblor del animal durante la inyección, incluso bajo anestesia profunda. Debido a esta respuesta al dolor, la administración de anakinra RBI puede no ser un enfoque terapéutico óptimo.

La ciclosporina se detectó tanto en la retina como en el nervio óptico 24 h después mediante ambos mecanismos de inyección; sin embargo, la administración tópica no se detectó en ninguno de los dos tipos de tejido. En el grupo de inyección intravenosa, la retina tenía una concentración de 383 ppb y el nervio óptico tenía <5 ppb. En la vía de inyección de RB se observaron 16 ppb en la retina y 49 ppb en el nervio óptico (Tabla 1). No se detectó TUDCA ni en la retina ni en el nervio óptico 24 horas después de la inyección para ninguna de las dos vías de inyección. Ibudilast se detectó en el tejido del nervio óptico de un solo animal después de la inyección de RB (<5 ppb). El estudio piloto terapéutico de inyección indicó que ambos protocolos de inyección son capaces de administrar fármacos a la retina y al nervio óptico, como lo demuestra la presencia de ciclosporina en ambos tipos de tejidos después de ambos métodos de inyección. Este estudio también indica que la ciclosporina produjo altas concentraciones dentro de los tejidos objetivo de interés. Una hipótesis es que el ibudilast y el TUDCA pueden haber alcanzado la retina y el nervio óptico, pero su vida media en el entorno ocular puede haber sido demasiado corta para ser detectada 24 horas después de la inyección. Puede ser que los fármacos tengan un impacto neuroprotector en este momento; sin embargo, se necesitarían más estudios para confirmar la farmacocinética de estos fármacos tanto en la región interna (IVI) como en la extraocular (RBI).

Este estudio piloto también apoyó el protocolo de aislamiento de tejido ocular a través de la extirpación exitosa del nervio óptico completo y los ojos. Las retinas y los nervios ópticos se obtuvieron con éxito para su análisis en el estudio piloto de administración terapéutica (Tabla 1). Además, mediante la utilización de esta disección de aislamiento de tejido ocular, se pudieron recolectar ojos y nervios ópticos en bloque para la inmunohistoquímica (Figura 5). Se recolectaron muestras en bloque de dos ratas Sprague Dawley macho, como se describió anteriormente. Las muestras se incrustaron en OCT y se seccionaron longitudinalmente en un criostato de 10 μm de espesor. Las muestras se incubaron en PBS para eliminar la OCT y luego se incubaron en suero de burro normal 1:20 en PBS más Triton-X-100 (PBT) a temperatura ambiente durante 2 h. A continuación, las secciones se incubaron con los siguientes anticuerpos: anti-β-tubulina (1:1000; MAB5564; Millipore, Burlington, MA) y la proteína ácida fibrilar antiglial (GFAP; 1:50; Z0334; DAKO, Santa Clara, CA) en PBT durante la noche a 4 °C, enjuagado con PBS e incubado en burro anti-ratón Alexa 488 y burro anti-conejo Alexa 594 (1:200) en PBT durante la noche a 4 °C. Las secciones se enjuagaron y se montaron en un medio de montaje más DAPI. Las muestras se obtuvieron en un microscopio de fluorescencia de campo amplio o en un microscopio confocal utilizando ajustes consistentes²⁶. La cabeza del nervio óptico intacta pudo visualizarse (Figura 5A,B) y teñirse con éxito para los siguientes marcadores de interés: β-tubulina (verde), proteína ácida fibrilar glial (GFAP; rojo) y marcador nuclear DAPI (azul). Este método de disección permitió la obtención de muestras completas del nervio óptico, como se observa en la Figura 5C.

Figura 1: Esquema de la técnica de inyección intravítrea (IV). Una jeringa de 10 μL con una aguja de 33 G, longitud de 10 mm y ángulo de 15 grados se inserta 2/3 del camino en el ojo en el limbo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imagen esquemática y representativa de la técnica de inyección retrobulbar (RB). (A) Imagen esquemática de la inyección de RB. Se inserta una jeringa de insulina de 0,5 mL con una aguja de 28 G a lo largo del borde orbitario inferior en un ángulo entre las 6 y las 7 en punto. La aguja se avanza hasta que se palpa la parte posterior de la cuenca ocular y luego se retira ligeramente antes de la inyección. (B) Imagen representativa de la técnica de inyección de RB utilizando la misma aguja con tinta de tatuaje negra durante las pruebas piloto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Esquema de los principales puntos de disección durante el aislamiento del tejido ocular. Las líneas punteadas indican los puntos de incisión. (A) Rata mostrada dorsalmente con la articulación atlanto-occipital marcada. (B) Cráneo de rata mostrado dorsalmente con marcas de incisión importantes observadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Potenciales evocados visuales flash (fVEPs) de cohortes tratadas con solución salina RBI. (A) Amplitudes promediadas de fVEP de los ojos derechos (OD) tratados con solución salina RBI y los ojos izquierdos (SG) control/no tratados. No se detectaron diferencias significativas en la amplitud de las formas de onda de fVEP entre grupos o entre ojos. (B) Ojos derechos (OD): formas de onda fVEP de solución salina, ojos tratados con RBI al inicio y luego a los siete días después de la inyección (n = 2 muestras de animales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Micrografías epifluorescentes de la cabeza del nervio óptico (A,B) y muestra de ojo en bloque (C) de roedores recogidas tras la disección de aislamiento de tejido ocular. (A,B) Se recogieron cabezas de nervio óptico intactas de los animales y se tiñeron con marcadores de β-tubulina (verde), proteína ácida fibrilar glial (GFAP; rojo) y marcador nuclear DAPI (azul) con un aumento de 20x. (C) Muestra de ojo en bloque que muestre el globo intacto y el nervio óptico completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Inyecciones piloto terapéuticas. Se investigó la presencia en retina y nervio óptico de los siguientes agentes terapéuticos 24 h después de la administración: ciclosporina (tópica, IVI, RB), TUDCA (RB e IVI), ibudilast (RB e IVI) y Anakinra (RB e IVI). Se detectó ciclosporina tanto en la retina como en el nervio óptico después de ambas vías de inyección, lo que indica que nuestros protocolos de inyección RB e IV son capaces de administrar fármacos oculares a la retina y al nervio óptico.

Los intrincados desafíos asociados con la administración de terapias a la retina y al nervio óptico, principalmente debido a la barrera impermeable que representa el BRB, subrayan la importancia de este estudio ^3,4. La exploración de las técnicas IVI y RBI no solo destaca enfoques innovadores para superar estos obstáculos, sino que también enfatiza las implicaciones más amplias para la atención ocular y el desarrollo terapéutico. Estos hallazgos demuestran que tanto la IVI como la RBI pueden facilitar la administración dirigida de terapias directamente a los tejidos oculares afectados. Este abordaje dirigido es vital para alcanzar concentraciones terapéuticas que a menudo son inalcanzables a través de vías de administración sistémicas o tópicas ^2,11, mejorando así la eficacia de los tratamientos para diversas enfermedades oculares.

El análisis comparativo de estas técnicas de inyección revela sus beneficios únicos: IVI proporciona acceso directo a las capas vítrea e interna de la retina²⁷, mientras que RBI permite la difusión al nervio óptico sin comprometer la integridad del BRB²⁸. Estos conocimientos contribuyen a una comprensión más matizada de la mejor manera de administrar agentes terapéuticos específicos, mejorando en última instancia los resultados del tratamiento para los pacientes que padecen enfermedades oculares. Los métodos de administración IVI y RBI descritos aquí administraron con éxito terapias, como la ciclosporina, a tejidos críticos, lo que pone de manifiesto el potencial para desarrollar terapias oculares eficaces.

Además, a través del proceso de desarrollo de este método terapéutico, se eligió el isoflurano inhalatorio como método de sedación para este protocolo RBI e IVI, ya que es de acción rápida tanto en la activación como en la recuperación. El SALOOT proporciona un apoyo y estabilización cruciales al roedor, al tiempo que permite una tasa uniforme de anestésico inhalado. Como se discutió anteriormente, algunos riesgos asociados con la RBI incluyen el posible daño al ojo debido a la inserción ciega de la aguja, así como el bloqueo del flujo sanguíneo o el colapso traqueal debido a la técnica de presión descrita en el protocolo de inyección retrobulbar para ratones²³. Para ayudar a mitigar estos riesgos, este protocolo utiliza pinzas oftálmicas para agarrar el párpado inferior del animal para su estabilización, renunciando así a la técnica de presión y eliminando el bloqueo del flujo sanguíneo o el colapso traqueal. Esta técnica también proporciona un mejor control sobre el animal mientras se inserta la aguja. El uso de pinzas combinado con el uso del microscopio de operación en vivo ayuda a minimizar el riesgo de inserción a ciegas, lo que brinda al operador una mejor visualización de la ubicación de la aguja. Además, la plataforma quirúrgica proporciona un soporte crucial para la cabeza, lo que evita que el cráneo se mueva durante la inserción de la aguja. La plataforma de cirugía también proporciona una elevación de la cabeza con respecto al resto del cuerpo, lo que permite que la cabeza esté en una posición más nivelada, y dado que la plataforma tiene conexiones de isoflurano y oxígeno, el nivel de anestesia nunca se ve comprometido durante la colocación. La técnica IVI fue adoptada por su capacidad única de eludir el BRB mediante la inyección de terapias directamente en el humor vítreo. La técnica presenta la posibilidad de daño ocular debido a su naturaleza invasiva, pero el riesgo se minimiza asegurándose cuidadosamente de que la aguja no raye el cristalino, retirando lentamente la aguja y aplicando presión en el ojo durante 10-15 segundos después de la inyección.

La extracción y el análisis exitosos de muestras de retina y nervio óptico en bloque fueron posibles a través de este método único de recuperación de tejido. Se logró el aislamiento del ojo y el nervio en bloque, lo que ayuda a poder evaluar el sistema visual completo, como lo demuestra la cabeza del nervio óptico y la tinción de inmunofluorescencia del ojo completo (Figura 5). Este método permite una visualización de arriba hacia abajo del cerebro, los nervios ópticos y los globos, lo que permite una preservación más fácil de la estructura general y la integridad de nuestros tejidos.

Este estudio tiene limitaciones potenciales, incluyendo el uso de un solo sexo animal y un tamaño de muestra relativamente pequeño. Las inyecciones de RB también se asocian con la limitación inherente de la fuga terapéutica. Después de la inyección de RB, la terapéutica puede migrar del espacio retrobulbar al frente del globo. Esta técnica tenía como objetivo minimizar esta limitación inherente cambiando el ángulo de inserción y manteniendo la aguja lo más cerca posible de la parte posterior de la órbita. Además, se determinó que mantener una ligera presión después de la administración terapéutica durante 10-15 s ayudó a evitar que la terapéutica migrara fuera del espacio retrobulbar.

Estos métodos se utilizarán en trabajos futuros para la intervención terapéutica en un modelo de lesión ocular traumática de animales pequeños. Los métodos IVI se han ampliado para su uso en pollitos y ratones; sin embargo, se debe ajustar el tamaño de la aguja y los volúmenes terapéuticos. Para los pollitos, una aguja de insulina de 28-29 G y 20 μL de volumen terapéutico fueron óptimos²⁹, pero con ratones, se determinó que una aguja de 31 G y 2 μL de volumen terapéutico era ideal. La técnica IVI cambió mínimamente con la traslación a otros animales. Para la traducción del RBI a otras especies, sería necesario adaptar el tamaño y el volumen de la aguja, pero la técnica general debería seguir siendo traducible siempre que se consideren las diferencias anatómicas inherentes entre las especies.

Los conocimientos obtenidos de los modelos de animales pequeños son invaluables para avanzar en la comprensión de los mecanismos de administración de medicamentos y optimizar los protocolos de tratamiento. En última instancia, esta investigación sienta las bases para terapias más efectivas que podrían mejorar significativamente la calidad de la atención óptica, avanzando hacia la preservación de la visión y mejorando los resultados en la práctica clínica.

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Este trabajo fue parcialmente financiado por los premios W81XWH-15-1-0074 y W81XWH-22-1-0989 del Programa de Investigación de la Visión del Departamento de Defensa de los Estados Unidos. Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son los puntos de vista privados de los autores y no deben interpretarse como oficiales o como reflejo de los puntos de vista del Departamento del Ejército o del Departamento de Defensa. Esta beca de investigación fue financiada en parte por la filial de Ohio de Prevent Blindness Young Investigator Student Fellowship Award for Female Scholars in Vision Research. Agradecemos el apoyo de la Fundación Ross. Los servicios se realizaron en el Programa Central de Investigación de Ciencias de la Visión de OSU bajo P30EY032857. Nos gustaría agradecer a los Laboratorios y Recursos Animales de la Universidad Estatal de Ohio (ULAR). Además, nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio de pregrado de Reilly, Michelle Mosko, Emma Lally, Sam Duckworth y Eve Howard. También nos gustaría agradecer a Bongsu Kim por contribuir al diseño de SALOOT, así como a Elizabeth Urbanski y Ryan Webb. La Figura 1, la Figura 2A y la Figura 3 se crearon con BioRender.com.