成年大鼠的眼部治疗递送和高级组织检索

本研究提出了一种将治疗药物输送到成年大鼠视网膜和视神经的方法。此外，引入了一种独特的组织检索方法，用于成年大鼠视神经和视网膜的自上而下的整块收集。

由于存在血脑屏障和血视网膜屏障，向眼后段（包括视网膜和视神经）的治疗递送变得复杂。小动物模型，如大鼠，用于研究各种眼部病理。虽然向后眼进行治疗递送具有挑战性，但实现它对于治疗眼部疾病至关重要，其中许多疾病需要在小动物模型中验证转化相关性。因此，提出了两种后路治疗递送技术：玻璃体内注射 （IVI） 和球后注射 （RBI），用于成年大鼠。此外，还介绍了一种用于各种组织学和分子分析技术的整块切除眼睛和视神经的方法。解剖方案能够全面观察神经视觉系统，同时最大限度地减少死后对视网膜和视神经组织的伤害。治疗性环孢菌素成功输送到视网膜和视神经，注射后 24 小时使用 IVI 和 RBI 观察到可检测浓度。此外，成功提取整块视网膜和神经样本进行全眼组织学分析，有助于全面观察视网膜和更广泛的神经视觉系统。

由于眼睛的复杂解剖结构 ^1,2，特别是血液视网膜屏障 （BRB^{） 的存在}，向视网膜和视神经提供治疗非常困难 ^3,4,5。BRB 用于保护视网膜免受全身循环侵袭，但由于全身治疗性循环经常被 BRB 阻塞，因此是治疗给药的一个具有挑战性的对手 ^6,7。小的亲脂性分子可以很容易地通过 BRB 扩散，但较大的亲水分子更难进入视网膜⁶。玻璃体内 （IVI） 和球后 （RBI） 注射能够将药物输送到眼组织，克服了 BRB 施加的限制。IVI 通过将治疗药物施用于眼睛的内部环境，是一种很有前途的折衷方案 ^8,9。这种方法要求药物穿过玻璃体，从而绕过 BRB，并通过视网膜和脉络膜扩散以到达视神经⁷。RBI 从眼后输送到球后间隙¹⁰。治疗可以通过球后间隙的组织和腺体扩散来输送，影响视神经和周围结构，而无需直接进入视网膜，从而维持 BRB 的完整性。通过直接或间接将药物输送到眼睛中，玻璃体内和球后注射都可以实现更高的治疗药物局部浓度，与局部或全身给药（口服或静脉内）相比，这增强了其有效性²。这对于需要快速起效或高效效的治疗尤其重要，如许多眼部疾病所见。靶向给药还限制了身体其他部位对药物的暴露，从而降低了脱靶效应的风险，并有助于最大限度地减少局部、口服或静脉注射药物时可能发生的潜在不良反应¹¹。

其他眼周注射，如结膜下、后檱下和视网膜下注射，有其自身的优点和局限性 ^2,5。已观察到后腱下注射可将高浓度的药物输送到眼组织;然而，肌腱下注射比眼眶脉管更靠近巩膜 ^5,12。相比之下，RBI 将治疗药物置于比后腱下或结膜下更靠近视神经¹³。这可能意味着视神经病理学更喜欢 RBI 递送的治疗药物，而不是其他眼周注射类型。后肌腱下注射有相关风险，包括斜视、前房积血和眼压升高⁵。据报道，眼压升高也是 IVI、结膜下和视网膜下注射的危险因素²。这些注射类型通常需要重复给药才能达到所需的治疗效果²。与视网膜下注射、结膜下注射和 IVI 相关的其他危险因素包括白内障形成、视网膜出血、视网膜脱离和炎症²。这些 IVI、视网膜下注射和结膜下注射比 RBI 注射更具侵入性，因为这些注射是眼内²。RBI 可能被认为侵入性较小，因为它将治疗剂放置在球后间隙，而不是直接将针头进入眼球。其他微创治疗递送策略，例如局部给药，无法充分给药，只有不到 5% 的药物保留在眼表^{上 2,5}。

IVI 是临床前模型中的一项重要技术，因其能够将治疗剂直接输送到眼睛的后段而被使用。IVI 将药物直接输送到玻璃体，使其成为局部治疗的首选输送技术¹⁴。IVI 技术允许治疗药物绕过血视网膜屏障，这是药物渗透到视网膜的常见障碍¹⁴。IVI 引入了炎症和对眼部结构损伤的机会，因此必须一丝不苟地遵守该程序¹⁴。为了最大限度地减少视网膜脱离和白内障的形成，Chiu 等人描述了一种 IVI 方法，该方法强调在平面肌水平进行 45 度斜面插入和注射，避开晶状体、视网膜、眼肌和血管¹⁵。在这种技术中，将一根 30 G 的针头插入鼻腔进行治疗性输送¹⁵。由于其侵入性，IVI 仍然与风险相关。潜在风险包括视网膜脱离、白内障形成、眼内炎或出血¹⁶。IVI 技术的侵入性也会增加眼压，如 Ikjong Park 等人对猪眼进行的实验所示¹⁶。该研究显示了进针和注液不同阶段眼压的变化。他们报告了手术过程中眼压的显着变化¹⁶。

RBI 已在以前的研究中成功用作向啮齿动物提供治疗药物的手段。一项这样的研究比较了 通过 RBI¹⁷ 给予的各种前列腺素类似物的效果。给白化大鼠 RBI，用 26 G 的 0.1 mL 注射液针以 45 度角插入下穹窿的外侧区域¹⁷。本研究中使用的方案改编自先前描述的方法，其中 大鼠通过 腹膜内 （IP） 注射水合氯烷¹⁸ 进行麻醉。另一项对大鼠进行的研究将局部滴眼液与球后注射进行了比较¹⁹。 通过 免疫注射氯胺酮/甲苯噻嗪对大鼠进行麻醉， 并通过 30 G 针头给予 RBI¹⁹。与前面讨论的镇静方法相比，一项观察 RBI 对眼眶脂肪影响的研究在 RBI²⁰ 之前使用吸入异氟醚对大鼠进行镇静。虽然这些研究提供了关于哪些麻醉剂和针头规格可以成功的见解，但没有讨论手术过程中动物的定位和处理。

对小鼠的各种研究也对治疗性递送方法进行 RBI。一项研究比较了 RBI 与侧尾静脉注射成功诱导肾病综合征²¹。第二项研究还比较了相同的两种注射技术在心脏成像造影剂中的应用²²。用吸入异氟醚麻醉小鼠并在眼睛内侧注射²²。两项研究都从先前编写的方案中改编了他们的 RBI 方法。需要注意的是，该协议将他们的注射命名为眶后注射，但将注射位置描述为眼睛后面的球后间隙。该方案的作者使用吸入异氟醚作为首选的镇静方法，注意到小鼠的快速激活和恢复时间²³。对于 RBI，通过对眼睛周围的皮肤施加压力，眼睛部分从眼窝中突出²³。然后，将针头以 30 度角从内眦斜面向下引入并插入直至到达眼睛底部²³。对动物施加压力时必须小心，因为可能会发生意外的血流阻塞或气管塌陷²³.注射器在插入时也对针尖视而不见，因此，损伤眼睛是一种相关风险。²³ 在本实验中，治疗给药时损伤眼睛是一个关键风险，因为造成额外的伤害会直接破坏研究结果。还必须注意的是，先前描述的定位和处理技术是在小鼠身上进行的，不包括对大鼠适用性的评论。

已经尝试了多种方式去除视神经和视网膜。其中一种方法探索了整体切除视神经和眼睛，保留完整的视交叉²⁴。这种方法与目前的研究最具可比性，因为单个眼睛和视神经也被保留用于整块切除;然而，视交叉是分开的。由于程序的复杂性，在此过程中谨慎行事至关重要。在目前的方法中，我们从尾颅骨开始解剖，然后沿嘴部工作，以便以限制对视神经的损伤并允许整个神经保持完整的方式提供通路。此外，保持神经完整并附着在眼睛上对于嵌入过程至关重要，因为神经每个部分的损伤可能对应于不同的病理观察²⁴。考虑视神经的方向很重要，因为它的嵌入方式允许不同的横截面，这对于组织学分析可能很重要。

一种被称为小动物实验室眼科手术台（SALOOT，一种眼科手术平台）的定制设备由一系列 3D 打印材料组成，用于提供麻醉并将动物保持在稳定位置以进行眼部治疗注射。SALOOT 设计允许眼科手术的头部和眼部结构保持稳定，从而提高手术的速度和可重复性，同时允许气体麻醉输送和清除呼出颗粒。SALOOT 是一种三维打印块，具有凹面缩小功能，用于固定大鼠身体，前部区域较窄，可将动物的头部固定到带有异氟醚入口的鼻锥中。鼻锥下方是一个小储液罐和排气口。开发了以下方法用于治疗性眼部输送和精确眼组织检索;它们专为研究眼外伤后的组织而设计，因此描述外伤、注射、治疗和解剖的影响以避免对结果的混淆解释至关重要。

本文介绍了两种眼部治疗性注射方法，玻璃体内注射和球后注射，用于成年大鼠。此外，还提出了一种组织检索方法，用于从成年大鼠中整块去除完整的视神经和视网膜。这些技术能够研究诱导病理和治疗的眼部和眼周效应。

所有实验均根据 ARVO 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行，并得到俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用体重 ~200 克、年龄约 2 个月大的雄性 Sprague Dawley 大鼠²⁵。材料 表中列出了所用试剂和所用设备的详细信息。

1. 玻璃体内注射 （IVI）

1. 将异氟醚和废液导线连接到 SALOOT 连接端口。按照 ARVO 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明和批准的 IACUC 协议，使用标准异氟醚程序麻醉动物。
   注意：或者，如果动物已经因另一次眼科测试（即氯胺酮/甲苯噻嗪混合物;90 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪）而处于麻醉状态，请将动物转移到眼科手术平台并用异氟醚滴定麻醉（3 氧：3 异氟醚比率）以确保维持足够的麻醉深度。
2. 将装有麻醉动物的眼科手术平台置于实时手术显微镜下。 通过 踏板撤退反射评估麻醉深度。
3. 将 1 至 2 滴 0.5% 盐酸丁卡因滴眼液滴入眼睛或正在手术的眼睛中。如果不进行作，将润滑局部眼药膏（如 0.3% 羟丙甲纤维素）涂抹在对侧眼上。
   1. 然后，在眼表滴一到两滴 5% 聚维酮碘，并使用棉签将聚维酮碘涂抹在眼睛周围的皮肤上。
4. 使用带有 33 G 针头的 10 μL 注射器，针头为 4 型，长度为 10 mm，角度为 15 度，并吸取 0.9% 的抑菌氯化钠。用生理盐水冲洗注射器和针头，然后将针头浸入热珠消毒器中。
   1. 在继续之前让它冷却。针头冷却后，将感兴趣的治疗药物吸取至所需量 （4 μL）。
      注意：对于概念验证研究，使用了磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的非稀释纹身墨水和 Evan's Blue 染料。将 Evan's Blue 粉末与 PBS 混合至不透明。对于治疗概念验证研究，使用以下浓度：1 mg/mL 的异丁司特、牛磺熊去氧胆酸 （TUDCA） 5 mg/mL、环孢素注射液 250 mg/mL 和阿那白滞素 100 mg/0.67 mL。治疗性粉末用 0.9% 抑菌盐水稀释。
5. 使用带牙齿的细眼镊子，轻轻抓住角膜缘处的巩膜组织以稳定。虹膜周围会有一个淡淡的红色环。以这个环为标志，插入针头，斜面朝下，然后将其注射到后眼中。
   注意：确保将针头朝向视网膜倾斜，并且仅将针头插入 2/3 处（图 1）。确保针头不会划伤镜片，因为这会导致白内障的形成。
6. 注射治疗剂后，慢慢取出针头。闭上眼睛并保持压力至少 10-15 秒，然后用生理盐水冲洗。
7. 停止使用异氟醚的动物，并将其从眼科手术平台中取出。在每只眼睛中滴一滴 0.3% 羟丙甲纤维素，然后让动物在加热垫上恢复。

2. 球后注射 （RBI）

1. 将异氟醚和废液导线连接到 SALOOT 连接端口。使用标准异氟醚程序麻醉动物。
   注意：或者，如果动物已经因另一次眼科测试（即氯胺酮/甲苯噻嗪混合物;90 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪）而处于麻醉状态，请将动物转移到眼科手术平台并用异氟醚滴定麻醉（3 氧：3 异氟醚比率）以确保维持足够的麻醉深度。
2. 将装有麻醉动物的眼科手术平台置于实时手术显微镜下。 通过 踏板撤退反射评估麻醉深度。
3. 将 1 至 2 滴 0.5% 盐酸丁卡因滴眼液滴入眼睛或正在手术的眼睛中。如果不进行作，将润滑局部眼药膏（羟丙甲纤维素 0.3%）涂抹在对侧眼上。
   1. 然后，在眼表滴一到两滴 5% 聚维酮碘，并使用眼矛将聚维酮碘涂抹在眼睛周围的皮肤上。
4. 获得一个带有 0.5 G 针头的 28 mL 胰岛素注射器。将感兴趣的治疗剂吸取至所需量 （100 μL）。
   注意：对于概念验证研究，使用了磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的非稀释纹身墨水和 Evan's Blue 染料。将 Evan's Blue 粉末与 PBS 混合至不透明。对于治疗概念验证研究，使用以下浓度：异丁司特 10 mg/mL、TUDCA 50 mg/mL、环孢素注射液 250 mg/mL 和阿那白滞素 100 mg/0.67 mL。治疗性粉末用 0.9% 抑菌盐水稀释。
5. 使用带牙齿的细眼镊，轻轻抓住下眼睑以稳定。将针头斜面朝下，沿眶下缘以 6 点钟和 7 点钟之间的中间角度插入，直到感觉到眼窝的后部。将针头稍微向后拉，然后慢慢注射治疗剂（图 2）。
6. 轻轻缓慢地取出针头。然后，闭上眼睛并保持压力至少 10-15 秒，然后用生理盐水冲洗。
7. 停止使用异氟醚的动物，并将其从眼科手术平台中取出。在每只眼睛中滴一滴 0.3% 羟丙甲纤维素，然后让动物在加热垫上恢复。

3. 眼组织分离解剖

1. 通过 CO₂ 窒息或批准的 IACUC 协议中另有规定对动物实施安乐死后，将动物置于胸骨卧位。在颈部背侧利用横向皮肤切口，延伸到耳廓水平。
2. 解剖背侧肌肉组织，露出寰枕关节。使用梅奥剪刀切开寰枕关节，将头部与身体分开（图3）。使用钝器解剖，从鼻子水平到颈部背侧轻轻去除颅骨的皮肤，保持双眼周围的皮肤完整。
3. 将一对中等大小的直止血钳或针刺驱动器插入颅底的大孔。使用止血钳轻轻突破从枕骨大孔延伸到两侧颞区的侧颅骨（图3）。
   1. 取出颅骨顶部时，保持止血钳与大脑背侧平行。这将确保大脑保持完整，并且在骨头去除过程中没有划痕。
4. 使用扁平刮刀轻轻地向大脑鼻子反射，以暴露视神经。必须小心，以免大脑重量的张力施加到视神经上。
5. 暴露神经后，拿一把中等大小的微型剪刀，在视交叉上做一个小切口，将两条神经与大脑切断。此时，可以将大脑丢弃或置于PBS（4%PFA）中的多聚甲醛中，在4°C下24小时用于组织学评估。
6. 使用一把小虹膜剪刀和一把带齿的眼科微型镊子，小心地去除眼睛周围多余的组织（即眼睑、结缔组织等）。完成后，眼睛应位于眼窝中，但只有眼外肌和腺体仍然存在。
7. 将止血钳与小虹膜剪刀结合使用，切开眼眶，在通过视神经时要非常小心，不要切入视神经。用止血钳小心地掰开眼窝后部的骨头，为了更精确地控制，请使用小解剖剪刀。
8. 取出骨头后，用一把微型剪刀和细镊子在眼眶周围小心地切割，以去除脂肪垫、腺体和眼外肌。在此过程中，确保观察视神经。
9. 眼睛应该能够轻轻地向尾部反射到颅骨内部。此时，使用小微剪刀和细镊子去除下颅脊上神经周围的结缔组织。
10. 一旦这些组织被切除，眼睛和完整的视神经应该能够从颅骨中整体抬起。对对侧眼和神经重复这些步骤。
11. 此外，清洁视神经和眼睛的多余组织，例如硬脑膜鞘。如果不需要保存组织进行组织学分析，则使用干冰或液氮进行速冻，然后储存在 -80 °C 下。
12. 对于质谱分析，需要将视网膜与眼球内部区域隔离开来，并且需要隔离视神经。在最近的外部点将视神经与眼球分开。将神经置于冰上的冷冻管中，然后转移到 -80 °C。
    1. 将眼球放在手术显微镜下的培养皿上。使用一把弯曲的镊子保持眼睛稳定，然后用一把小微型剪刀在角膜缘处切开。
    2. 延长切口以包含地球的整个圆周。应将眼球一分为二，前部可丢弃。
    3. 将后部内侧朝上，并使用一对细眼镊去除乳白色的薄组织。它可能看起来粘在视盘上。如果发生这种情况，请使用显微剪刀将视网膜从椎间盘上剪下来。
       注意：然后可以将视网膜组织置于冰上的冷冻管中，然后再转移到 -80 °C。 然后可以将组织转移到质谱设施进行评估。
13. 对于使用部分灌注的免疫组织学染色，将完整的眼睛放在培养皿上。使用一对弯曲的镊子保持眼睛稳定，然后取出带有 28 G 针头的胰岛素注射器并将其插入角膜缘，针头朝向视网膜倾斜。在沿角膜缘的另外两个点重复此步骤。眼球穿刺有助于确保足够的灌注并有助于适当固定。
    注：球体应在 4% PFA 中固定至少 40 分钟，然后再过渡到摇床并低速搅拌 20 分钟以促进液体移动。
14. 固定步骤完成后，去除 PFA 并用 PBS 替换。将小瓶轻轻摇晃 15 分钟，然后重复此步骤进行第二次 15 分钟的 PBS 冲洗。
15. 在最后的 PBS 冲洗循环后，吸出 PBS 并用 PBS 中的 30% 蔗糖溶液代替，然后冷藏 24 小时。在蔗糖孵育步骤之后，将组织包埋在 OCT 中进行组织学评估²⁶。

使用注射染料（Evans Blue 染料）和纹身墨水（图 2B）对尸体动物进行初步试点实验，以优化 RBI 和 IVI 针的位置和大小。纹身墨水是非稀释的，然后将 Evans Blue 粉末混合在 PBS 中，直到液体变得不透明。我们得出结论，理想的 RBI 是将一根 28 G 针沿眶下缘以 6 点钟和 7 点钟之间的中间角度插入，直到感觉到眼窝的后部。这将染料输送到眼眶后部，靠近神经，而不会刺穿视神经。同样，这个试点尸体染料试验之后进行了 IVI 注射，但只使用了 Evans Blue 染料，因为纹身墨水与 33 G 针头结合使用时太粘稠。一旦确定了注射方案，使用 200 g （n = 18） 的雄性色素沉着的 Long-Evans 大鼠进行体内治疗研究的概念验证。此外，利用雄性 Long-Evans 大鼠 （n = 2） 进行光适应闪光视觉诱发电位 （fVEP） 以确定 RBI 安全性。记录基线 fVEP 值，然后在向右眼 （OD） 注射生理盐水 （100 μL） 后 7 天，再次进行 fVEPs。左眼 （OS） 未接受注射。fVEP 是按照预先存在的协议进行的，其中使用白色闪光 （200 cd.s/m²） 和 1000 ms 的刺激间隔在 30 cd/m² 背景下获得信号²⁶。fVEP 振幅显示眼睛或时间点之间没有显着变化（图 4）。使用具有 95% 置信区间的双波方差分析进行统计分析。Tukey 的多重比较测试在 GraphPad Prism 中进行，以确定群体交互²⁶。

为了确定眼部治疗给药的疗效，获得了以下感兴趣的神经保护疗法：10 mg/mL （RBI） 和 1 mg/mL （IVI） 的异丁司特、牛磺熊去氧胆酸 （TUDCA） 50 mg/mL （RBI） 和 5 mg/mL （IVI）、环孢素注射液，250 mg/mL、外用环孢菌素，0.05% 和阿那白滞素 100 mg/0.67 mL。环孢菌素 通过 RBI （n = 2） 、 IVI （n = 2） 和局部 （n = 3） 给药。阿那白滞素、异丁司特和 TUDCA 通过 RBI （n = 2） 和 IVI （n = 2） 给药。选择药物是因为它们有可能作为神经保护疗法，用于创伤性视神经病变的大鼠模型。环孢菌素特别被使用，因为它具有高粘度，因此相对于其他疗法难以注射。按照先前所述的方法在注射后 24 小时获得组织。 通过 质谱 （TUDCA、ibudilast 和环孢菌素） 或蛋白质组学分析 （anakinra） （OSU 的药物分析共享资源 CORE） 分析组织。收集对照视网膜和神经 并通过 质谱和蛋白质组学分析进行评估。然后评估治疗处理的样品并与对照进行比较，以确定在每个感兴趣组织中发现的药物的相对水平。由于注射过程中的动物畏缩反应，即使在深度麻醉下，阿那白滞素 RBI 样品也被从分析中移除。由于这种疼痛反应，RBI 阿那白滞素给药可能不是最佳治疗方法。

24 小时后，通过两种注射机制在视网膜和视神经中检测到环孢菌素;然而，在两种组织类型中均未检测到局部递送。在静脉注射组中，视网膜浓度为 383 ppb，视神经浓度为 <5 ppb。RB 注射途径在视网膜中观察到 16 ppb，在视神经中观察到 49 ppb（表1）。对于两种注射途径，注射后 24 小时在视网膜或视神经中均未检测到 TUDCA。RB 注射后，仅在一只动物的视神经组织中检测到异丁司特 （<5 ppb）。治疗性先导注射研究表明，两种注射方案都能够将药物输送到视网膜和视神经，两种注射方法后环孢菌素存在于两种组织类型中就证明了这一点。该研究还表明，环孢菌素在目标靶组织中产生高浓度。一种假设是异丁司特和 TUDCA 可能已经到达视网膜和视神经，但它们在眼环境中的半衰期可能太短，无法在注射后 24 小时检测到。此时这些药物可能具有神经保护作用;然而，需要进一步的研究来证实这些药物在内部 （IVI） 和眼外 （RBI） 区域的药代动力学。

这项试点研究还支持通过成功切除全视神经和眼睛来隔离眼组织方案。在治疗递送试点研究中成功获得视网膜和视神经用于分析（表 1）。此外，通过利用这种眼组织分离解剖，能够整块收集眼睛和视神经用于免疫组织化学（图 5）。如上所述，从两只雄性 Sprague Dawley 大鼠收集了整块样品。将样品包埋在 OCT 中，并在 10 μm 厚的低温恒温器上纵向切片。将样品在 PBS 中孵育以去除 OCT，然后在 PBS 加 Triton-X-100 （PBT） 的 1：20 正常驴血清中在室温下孵育 2 小时。然后将切片与以下抗体一起孵育：抗 β-微管蛋白 （1：1000;MAB5564;Millipore，马萨诸塞州伯灵顿）和抗神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP;1：50;Z0334;DAKO，加利福尼亚州圣克拉拉）在 PBT 中于 4°C 过夜，用 PBS 冲洗，并在 4°C 下在 PBT 中孵育过夜。 冲洗切片，并封片在加 DAPI 的封固剂中。样品在宽视场荧光显微镜或共聚焦显微镜上使用一致的设置成像²⁶。能够看到完整的视神经头（图 5A、B）并成功对以下感兴趣的标志物进行染色：β-微管蛋白（绿色）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP;红色）和核标志物 DAPI（蓝色）。这种解剖方法可以获得完整的视神经样本，如图 5C 所示。

图 1：玻璃体内 （IV） 注射技术示意图。 将带有 33 G 针头、长度为 10 mm、角度为 15 度的 10 μL 注射器插入眼角膜缘处 2/3 处。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：球后 （RB） 注射技术的示意图和代表性图像。 （A） RB 注射的示意图。将带有 28 G 针头的 0.5 mL 胰岛素注射器沿眶下缘以 6 点钟和 7 点钟方向的角度插入。针头向前推进，直到感觉到眼窝的后部，然后在注射前稍微向后拉。（B） 在试点试验期间使用同一针头和黑色纹身墨水的 RB 注射技术的代表性图像。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：眼组织分离过程中的主要解剖点示意图。 虚线表示切口点。（A） 大鼠背侧显示寰枕关节标记。（B） 大鼠头骨背侧显示，并注意到重要的切口标记。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：RBI 盐水处理队列的闪光视觉诱发电位 （fVEP）。 （A） 盐水 RBI 处理的右眼 （OD） 和对照/未治疗的左眼 （OS） 的平均 fVEP 振幅。未检测到组间或眼间 fVEP 波形的振幅存在显著差异。（B） 盐水 RBI 治疗眼在基线时和注射后 7 天（n = 2 个动物样本）的右眼 （OD） fVEP 波形。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：眼组织分离解剖后收集的啮齿动物的视神经头 （A、B） 和斑块眼样本 （C） 的落射荧光显微照片。 （A，B）从动物身上收集完整的视神经头，并用 β-微管蛋白 （绿色） 、神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP;红色） 和核标志物 DAPI （蓝色） 的标记物以 20 倍放大倍率染色。（C） 显示完整眼球和完整视神经的块状眼样本。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：治疗性中试注射。 检查以下治疗剂在给药后 24 小时在视网膜和视神经中的存在：环孢菌素 （局部、IVI、RB）、TUDCA （RB 和 IVI）、异丁司特 （RB 和 IVI） 和阿那白滞素 （RB 和 IVI）。在两种注射途径后，在视网膜和视神经中均检测到环孢菌素，表明我们的 RB 和 IV 注射方案能够将眼部药物输送到视网膜和视神经。

与向视网膜和视神经提供治疗相关的复杂挑战，主要是由于 BRB 构成的不渗透屏障，强调了这项研究的重要性 ^3,4。对 IVI 和 RBI 技术的探索不仅突出了克服这些障碍的创新方法，还强调了对眼部护理和治疗开发的更广泛影响。这些发现表明，IVI 和 RBI 都可以促进将治疗药物直接靶向递送到受影响的眼组织。这种有针对性的方法对于达到通常无法通过全身或局部给药途径达到的治疗浓度至关重要 ^2,11，^从而提高各种眼部疾病的治疗效果。

对这些注射技术的比较分析揭示了它们的独特优势：IVI 可直接进入玻璃体和视网膜内层²⁷，而 RBI 允许扩散到视神经，而不会影响 BRB 的完整性²⁸。这些见解有助于更细致地了解如何最好地提供特定的治疗药物，最终改善眼部疾病患者的治疗结果。此处描述的 IVI 和 RBI 递送方法成功地将治疗药物（如环孢菌素）递送到关键组织，突出了开发有效眼部疗法的潜力。

此外，通过这种治疗方法的开发过程，吸入异氟醚被选为该 RBI 和 IVI 方案的镇静方法，因为它在激活和恢复方面都起效快。SALOOT 为啮齿动物提供重要的支撑和稳定性，同时允许均匀的吸入麻醉剂速率。如前所述，与 RBI 相关的一些风险包括由于盲针插入而可能对眼睛造成损害，以及由于小鼠球后注射方案中概述的压力技术而导致的血流阻塞或气管塌陷²³。为了帮助减轻这些风险，该方案利用眼科镊子抓住动物的下眼睑以进行稳定，因此放弃了压力技术并消除了血流阻塞或气管塌陷的发生。这种技术还可以在插入针头时更好地控制动物。使用镊子与实时作显微镜相结合，有助于最大限度地降低盲插入的风险，使作员能够更好地观察针头位置。此外，手术平台提供关键的头部支撑，防止颅骨在插入针头期间移动。手术平台还提供头部相对于身体其他部分的抬高，这使得头部处于更水平的位置，并且由于该平台具有异氟醚和氧气连接，因此在定位过程中麻醉水平永远不会受到影响。采用 IVI 技术是因为其通过将治疗剂直接注射到玻璃体液中来绕过 BRB 的独特能力。由于其侵入性，该技术引入了眼部损伤的机会，但通过小心确保针头不会划伤晶状体，慢慢取出针头，并在注射后 10-15 秒对眼睛施加压力，可以将风险降至最低。

通过这种独特的组织修复方法可以成功去除和分析整块视网膜和视神经样本。实现了眼睛和神经的整块分离，这有助于评估整个视觉系统，视神经头和全眼免疫荧光染色证明了这一点（图5）。这种方法允许对大脑、视神经和地球仪进行自上而下的可视化，从而更容易地保存我们组织的整体结构和完整性。

这项研究有潜在的局限性，包括仅使用一种动物性别和相对较小的样本量。RB 注射也与治疗性渗漏的固有局限性有关。RB 注射后，治疗剂可以从球后间隙迁移到眼球前部。该技术旨在通过改变插入角度并使针头尽可能靠近眼眶后部来最大限度地减少这种固有的限制。此外，确定治疗给药后保持轻压 10-15 s 有助于防止治疗药物从球后间隙迁移。

这些方法将用于小动物创伤性眼损伤模型的治疗干预的未来工作。IVI 方法已扩展用于雏鸡和小鼠;但是，必须调整针头的大小和治疗量。对于雏鸡，发现 28-29 G 胰岛素针头和 20 μL 治疗体积是最佳²⁹，但对于小鼠，确定 31 G 针头和 2 μL 治疗体积是理想的。IVI 技术在转化为其他动物时变化最小。为了将 RBI 翻译成其他物种，需要调整针的大小和体积，但只要考虑到物种之间固有的解剖差异，整体技术就应该保持可翻译。

从小动物模型中获得的见解对于促进对药物递送机制的理解和优化治疗方案非常宝贵。最终，这项研究为更有效的疗法奠定了基础，这些疗法可以显着提高光学护理的质量，在保护视力和改善临床实践结果方面取得长足进步。

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

这项工作部分由美国国防部视觉研究计划奖 W81XWH-15-1-0074 和 W81XWH-22-1-0989 资助。此处包含的观点或主张是作者的个人观点，不应被解释为官方观点或反映陆军部或国防部的观点。这项研究资助部分得到了俄亥俄州预防失明青年研究员学生奖学金（Prevent Blindness Young Investigator Student Fellowship Award for Females Scholar in Vision Research）的支持。我们衷心感谢罗斯基金会的支持。服务是在 P30EY032857 下的 OSU Vision Sciences Research Core Program 进行的。我们要感谢俄亥俄州立大学实验室和动物资源 （ULAR）。此外，我们还要感谢 Reilly 本科生实验室成员 Michelle Mosko、Emma Lally、Sam Duckworth 和 Eve Howard。我们还要感谢 Bongsu Kim 对 SALOOT 设计的贡献，以及 Elizabeth Urbanski 和 Ryan Webb。图 1、图 2A 和图 3 是使用 BioRender.com 创建的。