מתן טיפולי בעיניים ושליפת רקמות מתקדמת בחולדות בוגרות

מחקר זה מציג מתודולוגיה להעברת טיפולים לרשתית ולעצבי הראייה של החולדה הבוגרת. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לאחזור רקמות לאיסוף מלמעלה למטה של עצב הראייה והרשתית בחולדה בוגרת.

אספקה טיפולית למקטע האחורי של העין, כולל הרשתית ועצב הראייה, מסובכת על ידי נוכחות של מחסומי דם-מוח ודם-רשתית. מודלים של בעלי חיים קטנים, כגון חולדות, משמשים לחקר פתולוגיות עיניים שונות. בעוד שמתן טיפול לעין האחורית הוא מאתגר, השגתו חיונית לטיפול בהפרעות עיניים, שרבות מהן דורשות תיקוף במודלים של בעלי חיים קטנים לצורך רלוונטיות תרגומית. לכן, מוצגות שתי טכניקות אספקה טיפוליות אחוריות: הזרקה תוך זגוגית (IVI) והזרקה רטרובולברית (RBI) לשימוש בחולדות בוגרות. בנוסף, מוצגת שיטה להסרת גוש העיניים ועצבי הראייה לטכניקות ניתוח היסטולוגיות ומולקולריות שונות. פרוטוקול הדיסקציה מאפשר תצפית מלאה על המערכת הנוירו-ויזואלית תוך מזעור פגיעה לאחר המוות ברקמות הרשתית ועצב הראייה. הושגה אספקה מוצלחת של הציקלוספורין הטיפולי לרשתית ולעצב הראייה, עם ריכוזים ניתנים לזיהוי שנצפו עשרים וארבע שעות לאחר ההזרקה באמצעות IVI ו-RBI. יתר על כן, דגימות רשתית ועצבים נלקחו בהצלחה לניתוח רקמה היסטולוגית מלאה של העין, מה שמאפשר תצפית מקיפה על הרשתית והמערכת הנוירו-ויזואלית הרחבה יותר.

מתן טיפולים לרשתית ולעצב הראייה הוא קשה להפליא בשל האנטומיה המורכבת של העין ^1,2, במיוחד הנוכחות של מחסום הדם-רשתית (BRB)^3,4,5. ה-BRB משמש להגנה על הרשתית מפני פלישה למחזור הדם המערכתי, אך מהווה יריב מאתגר לניהול טיפולי מכיוון שמחזור הדם הטיפולי המערכתי נחסם לעתים קרובות על ידי BRB ^6,7. מולקולות ליפופיליות קטנות יכולות להתפזר בקלות דרך ה-BRB, אך למולקולות גדולות והידרופיליות קשה יותר להשיג גישה לרשתית⁶. זריקות תוך-זגוגיות (IVI) ורטרובולבר (RBI) מאפשרות העברת תרופות לרקמות העין, תוך התגברות על המגבלות שמציב ה-BRB. ה-IVI משמש כפשרה מבטיחה על ידי מתן טיפולים לסביבה הפנימית של העין ^8,9. שיטה זו מחייבת את התרופה לעבור דרך הזגוגית, ובכך לעקוף את ה-BRB, ולהתפזר דרך הרשתית והכורואיד על מנת להגיע לעצב הראייה⁷. ה-RBI מועבר מאחורי העין לחלל הרטרובולברי¹⁰. טיפולים יכולים להינתן על ידי דיפוזיה דרך הרקמות והבלוטות בחלל הרטרובולברי, המשפיע על עצב הראייה והמבנים הסובבים אותו מבלי להיכנס ישירות לרשתית, מה ששומר על שלמות ה-BRB. על ידי מתן תרופות ישירות או בעקיפין לעין, הן זריקות תוך זגוגיות והן זריקות רטרובולבריות יכולות להשיג ריכוזים מקומיים גבוהים יותר של התרופה הטיפולית, מה שמשפר את יעילותה בהשוואה למתן מקומי או מערכתי (דרך הפה או תוך ורידי)². זה חשוב במיוחד עבור טיפולים הדורשים פעולה מהירה או עוצמה גבוהה, כפי שניתן לראות במחלות עיניים רבות. אספקה ממוקדת גם מגבילה את החשיפה של שאר הגוף לתרופה, מה שמפחית את הסיכון להשפעות מחוץ למטרה ומסייע למזער תופעות לוואי פוטנציאליות שעלולות להתרחש כאשר תרופות ניתנות באופן מקומי, דרך הפה או דרך הווריד¹¹.

לזריקות פרי-עיניות אחרות, כגון תת-לחמית, תת-טנון אחורי ותת-רשתית, יש יתרונות ומגבלות משלהן ^2,5. זריקות סובטנון אחוריות נצפו כמספקות ריכוזי תרופות גבוהים לרקמות העין; עם זאת, הזרקת הסאבטנון קרובה יותר לסקלרל מאשר לכלי הדם האורביטליים ^5,12. לעומת זאת, ה-RBI ממקם את הטיפול קרוב יותר לעצב הראייה מאשר הסובטנון האחורי או תת-הלחמית¹³. משמעות הדבר עשויה להיות שפתולוגיות של עצב הראייה מעדיפות טיפולים הניתנים על ידי RBI על פני סוגי הזרקה פרי-עיניים אחרים. לזריקות סובטנון אחוריות יש סיכונים נלווים, כולל פזילה, היפמה ולחץ תוך עיני מוגבר⁵. לחץ תוך עיני מוגבר הוא גם גורם סיכון מדווח בזריקות IVI, תת-לחמית ותת-רשתית². סוגי הזרקה אלה דורשים לרוב מינון חוזר על מנת להשיג את האפקט הטיפולי הרצוי². גורמי סיכון אחרים הקשורים לזריקות תת-רשתית, זריקות תת-לחמית ו-IVI כוללים היווצרות קטרקט, דימום ברשתית, היפרדות רשתית ודלקת². זריקות IVI, תת-רשתית וזריקות תת-לחמית אלו פולשניות יותר מזריקות RBI, מכיוון שהזריקות הללו הן תוך עיניות². ה-RBI עשוי להיחשב פחות פולשני מכיוון שהוא ממקם את הטיפול במרחב הרטרובולברי, מבלי להיכנס ישירות למחט לכדור העין. אסטרטגיות אספקה טיפוליות אחרות פחות פולשניות, כגון מתן מקומי, אינן מספקות מספיק תרופות, כאשר פחות מ-5% מהתרופה נשמרת על פני העין ^2,5.

IVI היא טכניקה בולטת במודלים פרה-קליניים המשמשת ביכולתה להעביר חומרים טיפוליים ישירות לחלק האחורי של העין. IVI מעביר את התרופה ישירות להומור הזגוגי, מה שהופך אותה לטכניקת אספקה מועדפת לטיפול מקומי¹⁴. טכניקת IVI מאפשרת לטיפול לעקוף את מחסום הדם-רשתית, המהווה מכשול נפוץ לחדירת תרופות לרשתית¹⁴. IVI מציג את ההזדמנות לדלקת ולפגיעה במבני העין, ולכן יש להקפיד על ההליך¹⁴. כדי למזער היפרדות רשתית והיווצרות קטרקט, צ'יו ועמיתיו מתארים גישת IVI המדגישה החדרה והזרקה של שיפוע של 45 מעלות ברמת ה-par plana, תוך הימנעות מהעדשה, הרשתית, שריר העין וכלי הדם¹⁵. בטכניקה זו מוחדרת מחט 30 גרם לסקלרה של האף לאספקה טיפולית¹⁵. IVI עדיין קשור לסיכונים בשל אופיו הפולשני. סיכונים פוטנציאליים כוללים היפרדות רשתית, היווצרות קטרקט, אנדופתלמיטיס או דימום¹⁶. האופי הפולשני של טכניקות IVI מגביר גם את הלחץ התוך עיני, כפי שהוצג בניסוי על עיניים חזיריות שבוצע על ידי Ikjong Park et ^al.16. המחקר מראה שינויים בלחץ התוך עיני בשלבים שונים של החדרת מחט והזרקת נוזלים. הם מדווחים על שונות משמעותית בלחץ התוך עיני במהלך ההליך¹⁶.

RBIs שימשו בהצלחה במחקרים קודמים כאמצעי להעברה טיפולית למכרסמים. מחקר אחד כזה השווה את ההשפעות של אנלוגים שונים של פרוסטגלנדינים שניתנו באמצעות RBI¹⁷. חולדות לבקנות קיבלו RBI עם מחט 26 גרם של 0.1 מ"ל שהוחדרה דרך האזור הצדדי של הפורניקס התחתון בזווית^{של 45 מעלות 17}. הפרוטוקול ששימש במחקר זה הותאם משיטה שתוארה קודם לכן בה החולדות הורדמו באמצעות הזרקה תוך-צפקית (IP) של כלורלהידראט¹⁸. מחקר אחר שנערך בחולדות השווה טיפות מקומיות לזריקות רטרובולבריות¹⁹. החולדות הורדמו באמצעות הזרקת IP של קטמין/קסילזין, וה-RBI ניתן באמצעות מחט 30 גרם¹⁹. בניגוד לשיטות ההרגעה שנדונו קודם לכן, מחקר אחד שבחן את ההשפעות של RBI על שומן אורביטלי השתמש באיזופלורן בשאיפה כדי להרגיע את החולדות לפני RBI²⁰. בעוד שמחקרים אלה מספקים תובנה לגבי אילו חומרי הרדמה ומפרטי מחטים יכולים להצליח, המיקום והטיפול בבעלי החיים במהלך ההליך אינם נדונים.

מחקרים שונים בעכברים עורכים גם RBIs לשיטות אספקה טיפוליות. מחקר אחד השווה RBI להזרקת וריד זנב לרוחב לגרימת תסמונת נפרוטית²¹. מחקר שני השווה גם את אותן שתי טכניקות הזרקה במתן חומר ניגוד להדמיית לב²². העכברים הורדמו באיזופלורן בשאיפה והוזרקו בצד המדיאלי של העין²². שני המחקרים אימצו את שיטת ה-RBI שלהם מפרוטוקול שנכתב בעבר. חשוב לציין שפרוטוקול זה כינה את ההזרקה שלהם רטרו-אורביטלית, אך תיאר את מיקום ההזרקה כחלל הרטרובולברי מאחורי העין. מחברי פרוטוקול זה השתמשו באיזופלורן באינהלציה כשיטת הרגעה מועדפת, וציינו את זמן ההפעלה וההתאוששות המהיר של העכברים²³. עבור RBI, העין בלטה חלקית מהשקע על ידי הפעלת לחץ על העור סביב העין²³. לאחר מכן, המחט הוכנסה לצד המשופע של הקנתוס המדיאלי כלפי מטה בזווית של 30 מעלות והוחדרה עד שהגיעה לבסיס העין²³. יש לנקוט בזהירות בעת הפעלת לחץ על החיה, שכן עלולה להתרחש חסימה מקרית של זרימת הדם או קריסת קנה הנשימה²³. המזרק גם עיוור לקצה המחט בעת ההחדרה, ולכן פגיעה בעין היא סיכון נלווה. ²³ פגיעה בעין בעת מתן טיפולי היא סיכון קריטי בניסוי זה, שכן גרימת פציעה נוספת מערערת ישירות את תוצאות המחקר. כמו כן, יש לציין כי טכניקת המיקום והטיפול שתוארה קודם לכן בוצעה על עכברים ולא כללה הערות על תחולה על חולדות.

ישנם אופנים רבים בהם נעשה ניסיון להסרת עצב הראייה והרשתית. שיטה אחת כזו חקרה את הסרת עצבי הראייה והעיניים בגוש, תוך שמירה על כיאזמה אופטית שלמה²⁴. שיטה זו היא הדומה ביותר למחקר הנוכחי מכיוון שהעיניים הבודדות ועצבי הראייה נשמרים גם להסרת גוש; עם זאת, הכיאזמה האופטית מופרדת. לנקוט משנה זהירות בהליך זה תהיה חשיבות עליונה בשל מורכבות ההליך. בשיטה הנוכחית אנו מתחילים את הדיסקציה דרך גולגולת הזנב ועובדים בצורה רוסטרלית על מנת לספק גישה באופן שמצמצם את הנזק לעצבי הראייה ומאפשר לעצב כולו להישאר שלם. יתר על כן, שמירה על העצב שלם ומחובר לעין היא קריטית לתהליך ההטמעה, שכן נזק לכל חלק בעצב יכול להתאים לתצפית פתולוגית אחרת²⁴. חשוב לקחת בחשבון את הכיוון של עצב הראייה מכיוון שהאופן שבו הוא מוטבע מאפשר חתכים שונים, מה שעשוי להיות חשוב לניתוח היסטולוגי.

מכשיר בהתאמה אישית המכונה שולחן ניתוח עיניים במעבדה לבעלי חיים קטנים (SALOOT, פלטפורמה לניתוחי עיניים) מורכב מסדרה של חומרים מודפסים בתלת מימד כדי לספק הרדמה ולהחזיק את בעל החיים במצב יציב לזריקות טיפוליות לעיניים. עיצוב SALOOT מאפשר יציבות של מבני הראש והעיניים להליכים עיניים, מה שמשפר את המהירות והשחזור של הפעולות תוך מתן הרדמה בגז וניקוי חלקיקי נשיפה. ה-SALOOT הוא בלוק מודפס תלת מימדי הכולל הפחתה קעורה כדי להחזיק את גוף החולדה עם אזור צר יותר בחזית כדי להחזיק את ראש החיה לתוך חרוט אף עם כניסת איזופלורן. מתחת לחרוט האף נמצא מאגר קטן ומוצא פליטה. השיטות הבאות פותחו לאספקה טיפולית של העין ולשליפת רקמות עיניים מדויקות; הם תוכננו לחקר רקמות לאחר טראומה עינית, ולכן חיוני לתאר את השפעות הטראומה, ההזרקה, הטיפול והדיסקציה כדי למנוע פרשנות מבולבלת של הממצאים.

מאמר זה מציג שתי שיטות הזרקה טיפוליות לעיניים, הזריקות התוך-זגוגיות והזריקות הרטרובולבריות, לשימוש בחולדות בוגרות. בנוסף, מוצגת שיטת אחזור רקמות להסרת גוש של עצב הראייה והרשתית השלמים מחולדה בוגרת. טכניקות אלו מאפשרות לחקור את ההשפעות העיניים והעיניים של פתולוגיה וטיפול מושרים.

כל הניסויים נערכו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוהיו. חולדות זכר Sprague Dawley במשקל ~200 גרם ובסביבות גיל חודשיים שימשו למחקר זה²⁵. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הזרקה תוך זגוגית (IVI)

1. חבר את האיזופלורן ומובילי הפסולת ליציאות החיבור של SALOOT. להרדים את בעל החיים באמצעות הליכי איזופלורן סטנדרטיים בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ופרוטוקול IACUC מאושר.
   הערה: לחלופין, אם בעל החיים כבר היה תחת הרדמה מבדיקת עיניים אחרת (כלומר, תערובת קטמין/קסילזין; 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין), העבירו את בעל החיים לפלטפורמת ניתוח העיניים וטיטראט הרדמה עם איזופלורן (יחס 3 חמצן: 3 איזופלורן) כדי להבטיח שמירה על עומק הרדמה נאות.
2. הנח את פלטפורמת ניתוח העיניים עם החיה המורדמת תחת מיקרוסקופ הפעלה חי. העריכו את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגת דוושה.
3. יש להניח טיפה אחת או שתיים של תמיסת עיניים 0.5% טטרקאין הידרוכלוריד לתוך העין או העיניים המנותחות. יש למרוח משחת עיניים מקומית סיכה כגון היפרומלוז 0.3% על העין הנגדית אם אין לבצע מניפולציה.
   1. לאחר מכן, השתמשו בטיפה אחת עד שתיים של 5% פובידון-יוד על פני העין, ובעזרת צמר גפן מרחו פובידון-יוד על העור המקיף את העין.
4. השתמש במזרק של 10 מיקרוליטר עם מחט של 33 גרם עם קצה בסגנון 4 באורך של 10 מ"מ וזווית של 15 מעלות ושרטט 0.9% נתרן כלורי בקטריוסטטי. יש לשטוף את המזרק והמחט במי המלח לפני שטובלים את המחט במעקר חרוזים חם.
   1. הניחו לו להתקרר לפני שתמשיכו. לאחר שהמחט התקררה, ערכו את התרופה המעניינת לכמות הרצויה (4 מיקרוליטר).
      הערה: למחקרי הוכחת רעיון, נעשה שימוש בדיו קעקוע לא מדולל ובצבע הכחול של אוון בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS). האבקה הכחולה של אוון עורבבה עם PBS עד שהיא אטומה. למחקרי הוכחת היתכנות טיפוליים, נעשה שימוש בריכוזים הבאים: איבודילסט במינון 1 מ"ג/מ"ל, חומצה טאורוסודאוקסיכולית (TUDCA) במינון 5 מ"ג/מ"ל, הזרקת ציקלוספורין, 250 מ"ג/מ"ל ואנקינרה: 100 מ"ג/0.67 מ"ל. אבקות טיפוליות דוללו במי מלח בקטריוסטטיים של 0.9%.
5. בעזרת מלקחיים עיניים עדינים עם שיניים, אחוז בעדינות ברקמת הסקלר בלימבוס כדי להתייצב. תהיה טבעת אדומה קלושה סביב הקשתית. השתמש בטבעת זו כציון דרך, הכנס את המחט, הצד המשופע כלפי מטה והזריק אותה לעין האחורית.
   הערה: הקפד לכוון את המחט לכיוון הרשתית והכנס את המחט רק 2/3 מהדרך (איור 1). ודא שהמחט לא מגרדת את העדשה, מכיוון שהדבר יוביל להיווצרות קטרקט.
6. לאחר הזרקת התרופה הטיפולית, הסר לאט את המחט. עצמו את העין והחזיקו לחץ למשך 10-15 שניות לפחות לפני שטיפה במי מלח.
7. יש להפסיק את השימוש באיזופלורן ולהוציא אותו ממשטח ניתוחי העיניים. הניחו טיפת היפרומלוז 0.3% בכל עין ולאחר מכן הניחו לבעל החיים להתאושש על כרית חימום.

2. הזרקת רטרובולבר (RBI)

1. חבר את האיזופלורן ומובילי הפסולת ליציאות החיבור של SALOOT. להרדים את בעל החיים באמצעות הליכי איזופלורן סטנדרטיים.
   הערה: לחלופין, אם בעל החיים כבר היה תחת הרדמה מבדיקת עיניים אחרת (כלומר, תערובת קטמין/קסילזין; 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין), העבירו את בעל החיים לפלטפורמת ניתוח העיניים וטיטראט הרדמה עם איזופלורן (יחס 3 חמצן: 3 איזופלורן) כדי להבטיח שמירה על עומק הרדמה נאות.
2. הנח את פלטפורמת ניתוח העיניים עם החיה המורדמת תחת מיקרוסקופ הפעלה חי. העריכו את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגת דוושה.
3. יש להניח טיפה אחת או שתיים של תמיסת עיניים 0.5% טטרקאין הידרוכלוריד לתוך העין או העיניים המנותחות. מרחו משחת עיניים מקומית סיכה (היפרומלוז 0.3%) על העין הנגדית אם אין לבצע מניפולציה.
   1. לאחר מכן, השתמשו בטיפה אחת עד שתיים של 5% פובידון-יוד על פני העין ובעזרת חנית עיניים, מרחו פובידון-יוד על העור המקיף את העין.
4. השג מזרק אינסולין 0.5 מ"ל עם מחט 28 גרם. ערכו את הטיפול המעניין לכמות הרצויה (100 מיקרוליטר).
   הערה: למחקרי הוכחת רעיון, נעשה שימוש בדיו קעקוע לא מדולל ובצבע הכחול של אוון בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS). האבקה הכחולה של אוון עורבבה עם PBS עד שהיא אטומה. למחקרי הוכחת היתכנות טיפוליים, נעשה שימוש בריכוזים הבאים: איבודילסט ב-10 מ"ג/מ"ל, TUDCA ב-50 מ"ג/מ"ל, הזרקת ציקלוספורין ב-250 מ"ג/מ"ל ואנקינרה ב-100 מ"ג/0.67 מ"ל. אבקות טיפוליות דוללו במי מלח בקטריוסטטיים של 0.9%.
5. בעזרת מלקחיים עדינים לעיניים עם השיניים, אחוז בעדינות בעפעף התחתון כדי לייצב. הכנס את המחט, עם הצד המשופע כלפי מטה, בזווית באמצע הדרך בין השעה 6 ל-7 לאורך שפת המסלול התחתונה עד שמורגש החלק האחורי של שקע העין. משכו מעט את המחט לאחור ואז הזריקו לאט את התרופה (איור 2).
6. הסר בעדינות ולאט את המחט. לאחר מכן, עצמו את העין והחזיקו לחץ למשך 10-15 שניות לפחות לפני שטיפה במי מלח.
7. יש להפסיק את השימוש באיזופלורן ולהוציא אותו ממשטח ניתוחי העיניים. הניחו טיפת היפרומלוז 0.3% בכל עין ולאחר מכן הניחו לבעל החיים להתאושש על כרית חימום.

3. דיסקציה של בידוד רקמות עיניים

1. לאחר שהחיה הורדמה באמצעות חנק_CO2 או כפי שצוין אחרת בפרוטוקול IACUC מאושר, הנח את החיה בשכיבה על עצם החזה. השתמש בחתך עור רוחבי מעל הצוואר הגבי, המשתרע עד לגובה אפרכסת האוזן.
2. נתח את שרירי הגב כדי לחשוף את המפרק האטלנטו-עורפי. השתמשו במספריים של מיונז כדי לחתוך דרך המפרק האטלנטו-עורפי, ולהפריד את הראש מהגוף (איור 3). בעזרת דיסקציה קהה, הסר בעדינות את העור מהגולגולת הגבית מגובה האף ועד הצוואר הגבי, והשאיר את העור סביב שתי העיניים שלם.
3. הכנס זוג המוסטטים ישרים בינוניים או דרייברים של מחט לתוך הפורמן מגנום בבסיס הגולגולת. השתמשו בהמוסטטים כדי לפרוץ בעדינות את הגולגולת הצדדית המשתרעת מהנקב מגנום ועד לאזור הטמפורלי משני הצדדים (איור 3).
   1. כאשר מסירים את החלק העליון של הגולגולת, שמרו על ההמוסטטים מקבילים לצד הגבי של המוח. זה יבטיח שהמוח יישאר שלם ולא ייפגע בתהליך הסרת העצם.
4. בעזרת מרית שטוחה, החזירו בעדינות את המוח בצורה רוסטרלית כדי לחשוף את עצבי הראייה. יש לנקוט בזהירות כדי שהמתח ממשקל המוח לא יופעל על עצבי הראייה.
5. כשהעצבים חשופים, קחו זוג מספריים בינוניים ובצעו חתך קטן על פני הכיאזמה האופטית, תוך ניתוק שני העצבים מהמוח. בשלב זה, ניתן להשליך את המוח או למקם אותו בפרפורמלדהיד ב-PBS (4% PFA) למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס לצורך הערכה היסטולוגית.
6. בעזרת זוג מספריים קטנים לקשתית וזוג מיקרו מלקחיים עיניים משוננים, הסר בזהירות את הרקמה העודפת (כלומר, עפעפיים, רקמת חיבור וכו') מסביב לעין. לאחר השלמתו, העין צריכה להיות ממוקמת בארובת העין, אך רק השריר והבלוטות החוץ-עיניים עדיין קיימים.
7. בעזרת ההמוסטטים בשילוב עם מספרי הקשתית הקטנים, חותכים את מסלול העין, תוך הקפדה רבה לא לחתוך את עצב הראייה כשהוא עובר בתעלת האופטיקה. שברו בזהירות את העצם בחלק האחורי של שקע העין בעזרת ההמוסטטים, ולשליטה מדויקת יותר, השתמשו במספריים הקטנים לדיסקציה.
8. לאחר הסרת העצם, יש לחתוך בעדינות סביב מסלול העין בעזרת מספריים ומלקחיים עדינים כדי להסיר את כריות השומן, הבלוטות והשרירים החוץ-עיניים. הקפד לשמור על עצבי הראייה במהלך תהליך זה.
9. העין אמורה להיות מסוגלת להשתקף בעדינות בזנב לכיוון החלק הפנימי של הגולגולת. בשלב זה, השתמש במספריים קטנים ובמלקחיים עדינים כדי להסיר את רקמת החיבור המקיפה את העצב ברכס הגולגולת התחתון.
10. לאחר הסרת רקמה זו, יש להרים את העין ועצב הראייה המלא מהגולגולת. חזור על שלבים אלה עבור העין והעצב הנגדיים.
11. יתר על כן, נקה את עצב הראייה והעין מרקמות עודפות כגון מעטפת הדוראל. אם אין צורך לשמר רקמות לצורך ניתוח היסטולוגי, יש להקפיא בזק באמצעות קרח יבש או חנקן נוזלי לפני האחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
12. עבור ספקטרומטריית מסה, יש לבודד את הרשתית מהאזור הפנימי של כדור הארץ, ולבודד את עצב הראייה. הפרד את עצב הראייה מהגלובוס בנקודה החיצונית הקרובה ביותר. הנח את העצב בצינור קריו על קרח לפני העברתו ל-80 מעלות צלזיוס.
    1. הנח את כדור העין על צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ ניתוח. השתמש בזוג מלקחיים מעוקלים כדי להחזיק את העין יציבה לפני ביצוע חתך בלימבוס עם זוג מספריים קטנים.
    2. הרחב את החיתוך כך שיקיף את כל היקף הגלובוס. יש לחצות את הגלובוס, ולהשליך את החלק הקדמי.
    3. הניחו את הצד הפנימי של החלק האחורי כלפי מעלה, ובעזרת פינצטה עדינה הסירו את הרקמה הדקה בצבע קרם. זה עשוי להיראות כאילו הוא נדבק לדיסק האופטי. אם זה קורה, השתמש במספריים כדי לחתוך את הרשתית מהדיסק.
       הערה: לאחר מכן ניתן להניח את רקמת הרשתית בצינור קריו על קרח לפני העברתה ל-80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ניתן להעביר רקמות למתקן ספקטרומטריית המסה להערכה.
13. לצביעה אימונוהיסטולוגית באמצעות זלוף חלקי, הנח את העין השלמה על צלחת פטרי. השתמש בזוג מלקחיים מעוקלים כדי להחזיק את העין יציבה לפני נטילת מזרק אינסולין עם מחט 28 גרם והחדרתו ללימבוס, כשהמחט בזווית לכיוון הרשתית. חזור על שלב זה בשתי נקודות נוספות לאורך הלימבוס. ניקוב הגלובוס מסייע להבטיח זלוף נאות ומסייע בקיבוע מתאים.
    הערה: יש לקבע את הגלובוס ב-4% PFA למשך 40 דקות לפחות לפני המעבר לשייקר ולהתערבב במהירות נמוכה למשך 20 דקות נוספות כדי להקל על תנועת הנוזלים.
14. לאחר השלמת שלב הקיבוע, הסר את ה-PFA והחלף אותו ב-PBS. יש להניח את הבקבוקונים על ניעור עדין למשך 15 דקות, ולאחר מכן לחזור על שלב זה לשטיפה נוספת של 15 דקות.
15. לאחר מחזור השטיפה הסופי של PBS, שאפו את ה-PBS והחליפו אותו בתמיסת סוכרוז 30% ב-PBS, ולאחר מכן הכניסו למקרר למשך 24 שעות. לאחר שלב הדגירה של הסוכרוז, יש להטמיע רקמה ב-OCT להערכה היסטולוגית²⁶.

ניסויי פיילוט ראשוניים בוצעו על חיות גופות באמצעות צבע הזרקה (צבע כחול אוונס) ודיו קעקוע (איור 2B) כדי לייעל את המיקום והגודל של המחט הן עבור RBI והן עבור IVI. דיו הקעקועים לא היה מדולל, ואז אבקת אוונס בלו עורבבה ב-PBS עד שהנוזל הפך אטום. הגענו למסקנה שה-RBI האידיאלי כולל מחט 28 G המוחדרת בזווית באמצע הדרך בין השעה 6 ל-7 לאורך שפת המסלול התחתונה עד שהורגש החלק האחורי של שקע העין. זה העביר את הצבעים לחלק האחורי של המסלול, קרוב לעצב, מבלי לנקב את עצב הראייה. באופן דומה, ניסוי פיילוט זה של צבע גופות לווה בהזרקת IVI, אך רק צבע כחול אוונס שימש מכיוון שדיו הקעקוע היה צמיג מדי בשילוב עם מחט 33 G. לאחר שנקבעו פרוטוקולי ההזרקה, בוצעו מחקרים טיפוליים להוכחת היתכנות in vivo תוך שימוש בחולדות לונג-אוונס זכריות בעלות פיגמנטציה של 200 גרם (n = 18). בנוסף, פוטנציאלים מעוררים חזותיים מותאמים לאור (fVEPs) נערכו תוך שימוש בחולדות לונג-אוונס זכרים (n = 2) כדי לקבוע את בטיחות RBI. ערכי fVEP בסיסיים נרשמו, ולאחר מכן 7 ימים לאחר הזרקת מי מלח (100 מיקרוליטר) לעין ימין (OD), fVEPs נערכו שוב. עיניים שמאליות (OS) לא קיבלו זריקה. fVEPs נערכו על פי פרוטוקולים קיימים, שבהם התקבלו אותות על רקע של 30 cd/m² תוך שימוש בהבזק לבן (200 cd.s/m²) ומרווח בין-גירוי של 1000 ms²⁶. אמפליטודות fVEP לא הראו שינויים משמעותיים בין העיניים או נקודות הזמן (איור 4). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA דו-גלי עם רווח בר-סמך של 95%. מבחני ההשוואות המרובים של טוקי נערכו ב-GraphPad Prism כדי לקבוע אינטראקציות קבוצתיות²⁶.

כדי לקבוע את היעילות של מתן טיפולי בעיניים, התקבלו הטיפולים המעניינים הבאים בהגנה על העצבים: איבודילסט במינון 10 מ"ג/מ"ל (RBI) ו-1 מ"ג/מ"ל (IVI), חומצה טאורוסודאוקסיכולית (TUDCA) 50 מ"ג/מ"ל (RBI) ו-5 מ"ג/מ"ל (IVI), הזרקת ציקלוספורין, 250 מ"ג/מ"ל, ציקלוספורין מקומי, 0.05%, ואנקינרה 100 מ"ג/0.67 מ"ל. ציקלוספורין ניתן באמצעות RBI (n = 2), IVI (n = 2) ובאופן מקומי (n = 3). אנקינרה, איבודילסט ו-TUDCA ניתנו באמצעות RBI (n = 2) ו- IVI (n = 2). תרופות נבחרו בשל הפוטנציאל שלהן כטיפולים נוירו-פרוטקטיביים לשימוש במודל עכברוש של נוירופתיה אופטית טראומטית. ציקלוספורין שימש במיוחד מכיוון שהוא היה צמיג מאוד ולכן קשה להזרקה ביחס לטיפולים אחרים. רקמות הושגו 24 שעות לאחר ההזרקה בשיטה שצוינה קודם לכן. רקמות נותחו באמצעות ספקטרומטריית מסה (TUDCA, ibudilast ו-cyclosporine) או ניתוח פרוטאומי (anakinra) (Pharmacoanaytic Shared Resource CORE של OSU). רשתית הביקורת והעצבים נאספו והוערכו באמצעות ספקטרומטריית מסה וניתוח פרוטאומי. לאחר מכן הוערכו דגימות שטופלו טיפולית והושוו לביקורת כדי לקבוע רמות יחסיות של תרופה שנמצאו בכל אחת מהרקמות המעניינות. דגימות RBI של אנקינרה הוסרו מהניתוח עקב תגובת רתיעה של בעלי חיים במהלך ההזרקה, אפילו בהרדמה עמוקה. בשל תגובת כאב זו, מתן RBI Anakinra עשוי שלא להיות גישה טיפולית אופטימלית.

ציקלוספורין התגלה הן ברשתית והן בעצב הראייה 24 שעות לאחר מכן באמצעות שני מנגנוני ההזרקה; עם זאת, המסירה המקומית לא זוהתה באף אחד מסוגי הרקמות. בקבוצת הזרקת הווריד, לרשתית היה ריכוז של 383 ppb, ולעצב הראייה היה <5 ppb. מסלול הזרקת ה-RB נצפה ב-16 ppb ברשתית ו-49 ppb בעצב הראייה (טבלה 1). TUDCA לא זוהה ברשתית או בעצב הראייה 24 שעות לאחר ההזרקה באף אחד ממסלולי ההזרקה. איבודילסט התגלה ברקמת עצב הראייה של בעל חיים אחד בלבד לאחר הזרקת RB (<5 ppb). מחקר הזרקת הפיילוט הטיפולי הצביע על כך ששני פרוטוקולי ההזרקה מסוגלים להעביר תרופות לרשתית ולעצב הראייה, כפי שמעידה נוכחות הציקלוספורין בשני סוגי הרקמות לאחר שתי שיטות ההזרקה. מחקר זה מצביע גם על כך שציקלוספורין הניב ריכוזים גבוהים ברקמות המטרה המעניינות. השערה אחת היא שאיבודילסט ו-TUDCA הגיעו לרשתית ולעצב הראייה, אך ייתכן שמחצית החיים שלהם בסביבת העיניים הייתה קצרה מכדי שניתן יהיה לזהות אותה 24 שעות לאחר ההזרקה. ייתכן שלתרופות יש השפעה נוירו-פרוטקטיבית בשלב זה; עם זאת, יהיה צורך במחקרים נוספים כדי לאשר את הפרמקוקינטיקה של תרופות אלה הן באזור הפנימי (IVI) והן באזור החוץ-עיני (RBI).

מחקר פיילוט זה תמך גם בפרוטוקול של בידוד רקמת העין באמצעות הסרה מוצלחת של עצב הראייה והעיניים המלא. רשתית ועצבי ראייה הושגו בהצלחה לניתוח במחקר הפיילוט למתן טיפולי (טבלה 1). בנוסף, באמצעות שימוש בדיסקציה זו של בידוד רקמת העין, ניתן היה לאסוף עיניים ועצבי ראייה בגוש לצורך אימונוהיסטוכימיה (איור 5). דגימות En-bloc נאספו משני חולדות Sprague Dawley זכרים, כמתואר לעיל. הדגימות הוטמעו ב-OCT ונחתכו לאורך על קריוסטט בעובי של 10 מיקרומטר. הדגימות הודגרו ב-PBS כדי להסיר את ה-OCT ולאחר מכן הודגרו בסרום חמור רגיל של 1:20 ב-PBS בתוספת Triton-X-100 (PBT) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן הודגרו הקטעים עם הנוגדנים הבאים: אנטי-β-טובולין (1:1000; MAB5564; Millipore, Burlington, MA) וחלבון חומצי סיבי אנטי-גליאלי (GFAP; 1:50; Z0334; DAKO, סנטה קלרה, קליפורניה) ב-PBT למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, נשטף ב-PBS, והודגר ב-Alexa 488 נגד עכבר חמור ונגד ארנב חמור Alexa 594 (1:200) ב-PBT בלילה ב-4 מעלות צלזיוס. החלקים נשטפו, והורכבו באמצעי הרכבה בתוספת DAPI. הדגימות צולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה או במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות הגדרות עקביות²⁶. ניתן היה לדמיין את ראש עצב הראייה השלם (איור 5A,B) וצבוע בהצלחה עבור הסמנים המעניינים הבאים: β-טובולין (ירוק), חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP; אדום) וסמן גרעיני DAPI (כחול). שיטת דיסקציה זו אפשרה קבלת דגימות עצב ראייה מלאות, כפי שניתן לראות באיור 5C.

איור 1: סכימה של טכניקת הזרקה תוך זגוגית (IV). מזרק של 10 מיקרוליטר עם מחט של 33 גרם, אורך של 10 מ"מ וזווית של 15 מעלות מוחדר 2/3 מהדרך לעין בלימבוס. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונה סכמטית ומייצגת של טכניקת הזרקת RB. (A) תמונה סכמטית של הזרקת RB. מזרק אינסולין של 0.5 מ"ל עם מחט של 28 גרם מוחדר לאורך שפת המסלול התחתונה בזווית שבין השעה 6 ל-7. המחט מתקדמת עד שמרגישים את החלק האחורי של שקע העין ואז נמשכת מעט לאחור לפני ההזרקה. (B) תמונה מייצגת של טכניקת הזרקת RB באמצעות אותה מחט עם דיו קעקוע שחור במהלך ניסויי פיילוט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סכמטי של נקודות החיתוך העיקריות במהלך בידוד רקמת העין. הקווים המקווקוים מציינים נקודות חתך. (A) חולדה שמוצגת בגב עם מפרק אטלנטו-עורפי מסומן. (B) גולגולת חולדה המוצגת בגב עם סימני חתך חשובים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: פוטנציאלים מעוררים חזותיים (fVEPs) של קבוצות שטופלו במי מלח RBI. (A) אמפליטודות fVEP ממוצעות מעיניים ימניות שטופלו ב-RBI (OD) ועיניים שמאליות (OS) שטופלו ב-RBI. לא זוהו הבדלים משמעותיים במשרעת צורות הגל של fVEP בין קבוצות או בין עיניים. (B) עיניים ימניות (OD) fVEP צורות גל של עיניים שטופלו ב-RBI במי מלח בנקודת ההתחלה ולאחר מכן שבעה ימים לאחר ההזרקה (n = 2 דגימות של בעלי חיים). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מיקרוגרפים אפיפלואורסצנטיים של ראש עצב הראייה (A,B) ודגימת עין בלוק (C) של מכרסמים שנאספו לאחר דיסקציה של בידוד רקמת העין. (א,ב) ראשי עצב ראייה שלמים נאספו מבעלי החיים ונצבעו בסמנים של β-טובולין (ירוק), חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP; אדום) וסמן גרעיני DAPI (כחול) בהגדלה של פי 20. (C) דגימת עין בלוק שמראה את הגלובוס השלם ואת עצב הראייה המלא. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: זריקות פיילוט טיפוליות. התרופות הבאות נחקרו על נוכחותן ברשתית ובעצב הראייה 24 שעות לאחר מתן הטיפול: ציקלוספורין (מקומי, IVI, RB), TUDCA (RB ו-IVI), איבודילסט (RB ו-IVI) ואנקינרה (RB ו-IVI). ציקלוספורין התגלה הן ברשתית והן בעצב הראייה לאחר שני מסלולי ההזרקה, מה שמצביע על כך שפרוטוקולי הזרקת RB ו-IV שלנו מסוגלים להעביר תרופות בעיניים לרשתית ולעצב הראייה.

האתגרים המורכבים הקשורים במתן טיפולים לרשתית ולעצב הראייה, בעיקר בשל המחסום האטום שמציב BRB, מדגישים את חשיבות המחקר ^3,4. החקירה של טכניקות IVI ו-RBI לא רק מדגישה גישות חדשניות להתגברות על מכשולים אלה, אלא גם מדגישה את ההשלכות הרחבות יותר על טיפול בעיניים והתפתחות טיפולית. ממצאים אלה מדגימים כי גם IVI וגם RBI יכולים להקל על אספקה ממוקדת של טיפולים ישירות לרקמות העיניים הפגועות. גישה ממוקדת זו חיונית להשגת ריכוזים טיפוליים שלעתים קרובות אינם ניתנים להשגה באמצעות דרכי מתן מערכתיות או מקומיות ^2,11, ובכך משפרת את יעילות הטיפולים במחלות עיניים שונות.

הניתוח ההשוואתי של טכניקות הזרקה אלו חושף את היתרונות הייחודיים שלהן: IVI מספק גישה ישירה לשכבות הזגוגית והפנימיות של הרשתית²⁷, בעוד RBI מאפשר דיפוזיה לעצב הראייה מבלי לפגוע בשלמות ה-BRB²⁸. תובנות אלו תורמות להבנה ניואנסית יותר של הדרך הטובה ביותר לספק חומרים טיפוליים ספציפיים, ובסופו של דבר לשפר את תוצאות הטיפול עבור חולים הסובלים ממחלות עיניים. שיטות האספקה IVI ו-RBI המתוארות כאן העבירו בהצלחה טיפולים, כגון ציקלוספורין, לרקמות קריטיות, והדגישו את הפוטנציאל לפיתוח טיפולים יעילים בעיניים.

יתר על כן, באמצעות תהליך פיתוח שיטה טיפולית זו, איזופלורן אינהלציוני נבחר כשיטת ההרגעה לפרוטוקול RBI ו-IVI זה, מכיוון שהוא פועל במהירות הן בהפעלה והן בהתאוששות. ה-SALOOT מספק תמיכה וייצוב חיוניים למכרסם, תוך שהוא מאפשר קצב אחיד של חומר הרדמה בשאיפה. כפי שנדון קודם לכן, חלק מהסיכונים הקשורים ל-RBI כוללים נזק אפשרי לעין עקב החדרת מחט עיוורת, כמו גם חסימת זרימת דם או קריסת קנה הנשימה עקב טכניקת הלחץ המתוארת בפרוטוקול הזרקת הרטרובולבר לעכברים²³. כדי לסייע בהפחתת סיכונים אלה, פרוטוקול זה משתמש במלקחיים עיניים כדי לתפוס את העפעף התחתון של החיה לייצוב, ובכך מוותר על טכניקת הלחץ ומבטל חסימת זרימת דם או קריסת קנה הנשימה. טכניקה זו גם נותנת שליטה טובה יותר על החיה בזמן החדרת המחט. השימוש במלקחיים בשילוב עם השימוש במיקרוסקופ ההפעלה החי מסייע למזער את הסיכון להחדרה עיוורת, ומעניק למפעיל הדמיה טובה יותר של מיקום המחט. בנוסף, פלטפורמת הניתוח מספקת תמיכה חיונית לראש, המונעת מהגולגולת לנוע במהלך החדרת המחט. פלטפורמת הניתוח מספקת גם הגבהה של הראש ביחס לשאר הגוף, מה שמאפשר לראש להיות במצב ישר יותר, ומכיוון שלפלטפורמה יש חיבורי איזופלורן וחמצן, רמת ההרדמה לעולם לא נפגעת במהלך המיקום. טכניקת IVI אומצה בשל יכולתה הייחודית לעקוף את ה-BRB על ידי הזרקת טיפולים ישירות לתוך הזגוגית. הטכניקה מציגה את ההזדמנות לנזק לעיניים בשל אופייה הפולשני, אך הסיכון ממוזער על ידי הקפדה על כך שהמחט לא תשרט את העדשה, הסרה איטית של המחט והפעלת לחץ על העין למשך 10-15 שניות לאחר ההזרקה.

הסרה וניתוח מוצלחים של דגימות רשתית ועצב ראייה התאפשרו באמצעות שיטה ייחודית זו לאחזור רקמות. הושג בידוד של העין וגוש העצב, מה שמסייע ביכולת להעריך את מערכת הראייה המלאה, כפי שמעידים ראש עצב הראייה וצביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של העין (איור 5). שיטה זו מאפשרת הדמיה מלמעלה למטה של המוח, עצבי הראייה והגלובוס, מה שמאפשר שימור קל יותר של המבנה הכללי והשלמות של הרקמות שלנו.

למחקר זה יש מגבלות פוטנציאליות, כולל שימוש במין בעל חיים אחד בלבד וגודל מדגם קטן יחסית. זריקות RB קשורות גם למגבלה המובנית של דליפה טיפולית. לאחר הזרקת RB, טיפולים יכולים לנדוד מהחלל הרטרובולברי לקדמת הגלובוס. טכניקה זו נועדה למזער את המגבלה המובנית הזו על ידי שינוי זווית ההחדרה ושמירה על המחט קרובה ככל האפשר לחלק האחורי של המסלול. בנוסף, נקבע כי שמירה על לחץ קל לאחר מתן טיפולי במשך 10-15 שניות סייעה למנוע מהטיפולים לנדוד מחוץ לחלל הרטרובולברי.

שיטות אלו ישמשו בעבודה עתידית להתערבות טיפולית במודל פגיעה עינית טראומטית של בעלי חיים קטנים. שיטות IVI הורחבו לשימוש בגוזלים ועכברים; עם זאת, יש להתאים את גודל המחט ואת הנפחים הטיפוליים. עבור אפרוחים, מחט אינסולין של 28-29 גרם ו-20 מיקרוליטר של נפח טיפולי נמצאו אופטימליים²⁹, אך עם עכברים, נקבע שמחט של 31 גרם ו-2 מיקרוליטר של נפח טיפולי הם אידיאליים. טכניקת IVI השתנתה באופן מינימלי עם התרגום לבעלי חיים אחרים. לצורך תרגום ה-RBI למינים אחרים, יהיה צורך להתאים את גודל המחט ונפחה, אך הטכניקה הכוללת צריכה להישאר ניתנת לתרגום כל עוד לוקחים בחשבון הבדלים אנטומיים מובנים בין מינים.

התובנות המתקבלות ממודלים של בעלי חיים קטנים הן יקרות ערך לקידום ההבנה של מנגנוני אספקת תרופות ואופטימיזציה של פרוטוקולי הטיפול. בסופו של דבר, מחקר זה מניח את היסודות לטיפולים יעילים יותר שיכולים לשפר משמעותית את איכות הטיפול האופטי, לעשות צעדים לקראת שימור הראייה ושיפור התוצאות בפרקטיקה הקלינית.

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים כלשהם שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי פרסי תוכנית המחקר של משרד ההגנה האמריקני W81XWH-15-1-0074 ו-W81XWH-22-1-0989. הדעות או הטענות הכלולות במסמך זה הן דעותיהם הפרטיות של המחברים ואין לפרש אותן כרשמיות או כמשקפות את העמדות של משרד הצבא או משרד ההגנה. מענק מחקר זה נתמך בחלקו על ידי פרס מלגת הסטודנטים לחוקרים צעירים של Prevent Blindness באוהיו לחוקרות בחקר הראייה. אנו אסירי תודה על תמיכתה של קרן רוס. השירותים בוצעו בתוכנית הליבה למחקר מדעי הראייה של OSU תחת P30EY032857. ברצוננו להודות למעבדה ולמשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת אוהיו סטייט (ULAR). בנוסף, ברצוננו להודות לחברי המעבדה לתואר ראשון של ריילי מישל מוסקו, אמה לאלי, סם דאקוורת' ואיב הווארד. ברצוננו להודות גם לבונגסו קים על תרומתם לעיצוב SALOOT, כמו גם לאליזבת אורבנסקי וריאן ווב. איור 1, איור 2A ואיור 3 נוצרו עם BioRender.com.