인간 신생아 기도 상피 세포에 대한 고산소증 효과를 평가하기 위한 번역 3D 세포 배양 모델

신생아 기관 기도 상피 세포(nTAEC)를 활용하여 공기-액체 계면(ALI) 배양 모델을 확립하고 생리학적으로 관련된 고산소 노출을 수행하여 발달 중인 신생아 기도 표면 상피에서 파생된 세포에 대한 대기 유도 산화 스트레스의 영향을 연구하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

조산 신생아 기도 상피는 환경 스트레스 요인에 지속적으로 노출됩니다. 폐 질환이 있는 신생아의 이러한 스트레스 요인 중 하나는 고산소증(>21% O₂)이라고 하는 주변 대기보다 높은 산소(O₂) 장력을 포함합니다. 기도에 대한 과산소증의 영향은 기도의 발달 단계, 과산소증의 정도, 노출 기간을 포함한 다양한 요인에 따라 달라지며, 다양한 노출은 잠재적으로 고유한 표현형으로 이어질 수 있습니다. 고산소증이 신생아 폐폐포 제거 및 기도 과민성에 미치는 영향에 대한 광범위한 연구가 있었지만, 인간 신생아 기도 상피 세포에 대한 고산소증의 장단기 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 그 주된 이유는 인간 신생아 기도 상피 발달 및 기능을 연구하기 위한 효과적인 체외 모델이 부족하기 때문입니다. 여기에서는 인간 신생아 기관 흡인을 활용하여 인간 신생아 기관 기도 상피 세포(nTAEC)를 분리 및 확장하고 이러한 세포를 공기-액체 계면(ALI) 배양에서 배양하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 nTAEC가 ALI 배양에서 성숙한 편광 세포-단층을 형성하고 점액섬모 분화를 겪는다는 것을 보여줍니다. 또한 특수 인큐베이터를 사용하여 ALI 배양에서 세포 단층의 중등도 고산소 노출 방법을 제시합니다. 또한, 형광 정량화를 사용하여 ALI 배양에서 고산소 노출 후 세포 산화 스트레스를 측정하기 위한 분석을 설명하며, 이를 통해 중등도의 고산소 노출이 세포 산화 스트레스를 유발하지만 심각한 세포막 손상이나 세포사멸을 일으키지 않음을 확인합니다. 이 모델은 잠재적으로 신생아 집중 치료실(NICU)의 신생아 기도에서 발생하는 임상적으로 관련된 고산소증 노출을 시뮬레이션하는 데 사용할 수 있으며 신생아 기도 상피 프로그래밍에 대한 O₂의 단기 및 장기 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델을 사용하는 연구는 이전 미숙아의 장기 기도 질환 발병과 관련된 기도 발달에 대한 조기 산화 손상을 완화하는 방법을 모색하는 데 활용될 수 있습니다.

치료용 산소(O₂)는 신생아 집중 치료실(NICU)에서 가장 많이 사용되는 치료법 중 하나입니다¹. 결과적으로, 고산소증 노출(>21% O₂)은 심각한 폐 질환이 있거나 없는 신생아가 직면하는 일반적인 대기 스트레스 요인입니다. 고산소증에 대한 폐 반응은 노출 강도 및/또는 지속 기간, 해부학적 위치, 세포 유형 및 폐 발달 단계에 따라 달라질 수 있다 ^2,3,4,5,6. 신생아 고산소증 폐 손상에 대한 대부분의 연구는 조산아에게 영향을 미치는 가장 흔한 만성 폐 질환인 기관지폐이형성증(BPD)을 모델링하기 위한 출생 후 폐포 정화술의 맥락에서 고산소 노출의 영향에 초점을 맞추고 있습니다 6,7,8,9,10,11. BPD 중증도는 호흡 지원의 양에 따라 분류되며, 월경 후 36주에 필요한 O₂ ⁹. BPD를 가진 대부분의 아기는 폐가 계속 성장함에 따라 시간이 지남에 따라 임상적으로 개선되며, 대다수는 첫 번째 생일 전에 호흡 지원을 중단합니다^12,13. 출생 후 BPD의 중증도에 관계없이, 이전 조산아에게 영향을 미치는 중요한 질병에는 취학 전 쌕쌕거림, 천식, 소아기 내내 재발하는 호흡기 감염, 조기 발병 만성 폐쇄성 폐질환의 위험이 5배 증가 등이 있습니다 12,14,15,16,17,18,19. 조산아의 장기 기도 질환 및 폐 감염에 대한 고산소증의 영향은 시험관 내 및 생체 내 동물 모델 20,21,22,23,24를 사용하여 조사되었습니다. 그러나 이러한 모델의 대부분은 중간엽 조직, 폐포 상피 및 기도 평활근의 역할에 초점을 맞췄습니다 25,26,27,28.

기도 표면 상피는 기관에서 말단 세기관지까지 뻗어 호흡기의 전체 경로를 따라 늘어서 있으며, 폐포²⁹ 수준 직전에 끝납니다. 기도 기저 세포는 기도 상피의 주요 줄기 세포로, 섬모 세포와 분비 세포(곤봉 세포: 비점액 생산, 배상 세포: 점액 생산)를 포함하는 성숙한 기도 상피 계통의 전체 레퍼토리로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있습니다^29,30,31,32. 신생아 고산소성 폐 손상과 관련된 세포 배양 연구는 대부분 성인 인간 또는 마우스 암 세포주를 사용했습니다^33,34. 또한, 대부분의 시험관 내 실험은 수중 배양 시스템을 사용했는데, 이는 세포가 인간의 생체 내 기도 상피와 유사한 점액섬모 기도 상피로 분화되는 것을 허용하지 않습니다³⁵. 결과적으로, 인간 신생아의 기도 상피 세포 발달에 대한 고산소증으로 인한 폐 손상의 영향에 대한 지식의 격차가 있습니다. 한 가지 이유는 대기 노출이 인간 신생아 기도 상피에 미치는 영향을 연구하기 위한 번역 모델이 부족하기 때문입니다. 어릴 때 고산소증으로 인한 폐 손상은 장기적인 기도 질환을 유발하고 감염 위험을 증가시켜 이전의 조산아의 삶을 변화시키는 결과를 초래할 수 있다 14,36,37. 중증 BPD를 앓고 있는 비생존 영아의 경우, 기도 표면 상피는 배상세포 증식증 및 섬모 발달 장애를 포함한 뚜렷한 이상을 보이며, 이는 비정상적인 점액 섬모 청소율 및 기도 구경을 손상시키는 상피 높이 증가를 나타냅니다³⁸. 지난 10년 동안 출생 후 기도 상피 발달을 연구하기 위해 공기-액체 계면(ALI)에서 1차 기도 상피 세포를 배양하는 것에 대한 관심이 높아졌습니다 39,40,41,42. 그러나 신생아 기도 상피 세포의 ALI 모델은 고산소증 노출과 같은 대기 산화 환원 섭동 모델의 맥락에서 사용되지 않았습니다.

이전에 발표된 방법³⁹을 사용하여 NICU에서 삽관된 신생아에서 얻은 신생아 기관 흡인 샘플을 활용하여 일차 신생아 기관 기도 상피 세포(nTAEC)를 성공적으로 분리 및 확장했습니다. 우리는 Rho, Smad, Glycogen synthase kinase(GSK3) 및 포유류 표적 라파마이신(mTOR) 신호전달의 억제제를 활용하여 앞서 설명한 바와 같이 이러한 세포의 확장 능력을 증가시키고 노화를 지연시켰으며, 이는 앞서^39,42 nTAEC의 효율적이고 나중에 전달을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 nTAEC를 사용하여 3D ALI 배양을 설정하고 nTAEC 단층에서 고산소증 노출을 수행하는 방법을 설명합니다. Rho 및 Smad 억제는 ALI 배양의 첫 7일(ALI 0-7일) 동안 사용되며, 그 후 나머지 ALI 배양 기간 동안 이러한 억제제를 분화 배지에서 제거합니다. ALI 배양 기도 상피 세포 단층의 정점 표면은 환경⁴³에 노출된 상태를 유지하며, 이는 대기 섭동 연구를 가능하게 하고 생체 내 고산소증에 노출된 발달 중인 신생아 기도의 병리생물학과 매우 유사합니다. 신생아 고산소성 폐 손상의 이전 세포 배양 연구(불멸 세포 또는 일차 세포에 관계없이)에서 사용된_O2의 농도는 노출 기간(15분에서 10일 범위)과 마찬가지로 크게 다르며(40%에서 95% 범위) 36,44,45,46,47. 이 연구를 위해 ALI 세포 단층을 ALI 7일차부터 14일차까지 7일 동안 60% O₂에 노출시켰습니다(분화 배지에서 Rho/Smad 억제제를 제거한 후). 고산소증 노출은 완전히 분화된 성숙 상피와 대조적으로 점액섬모 분화의 초기-중기 단계(ALI 7-14일)에 수행되었으며, 따라서 조산아의 생체 내 발달 기도 상피를 시뮬레이션합니다. 이 노출 전략은 생리학적으로 관련된 범위 내에서 산화 스트레스를 가하는 동시에 급성_O2 독성(_O2 농도가 더 높을 것으로 예상됨)의 위험을 최소화하며, 미숙아 신생아에서 상대적으로 저산소성 자궁 내 환경에서 고산소성 외부 환경으로의 전환의 임계점과 유사합니다.

신생아 기관 흡인 검체는 부모의 사전 동의가 있은 후에만 수집되었으며, 수집, 운송 및 보관에 사용되는 프로토콜은 오클라호마 대학교 보건 과학 센터(IRB 14377)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.

1. nTAEC의 분리, 패시징, ALI 배양 준비

1. 배지 준비
   1. 억제제(BLEAM-I)를 사용한 기관지 상피 기도 배지(BLEAM): HLL 보충제 1.25mL(500μg/mL 인간 혈청 알부민, 0.6μM 리놀레산, 0.6μg/mL 레시틴), L-글루타민(6mM) 15mL, 추출물 P 2mL(0.4%, 소 뇌하수체 추출물) 2mL, TM1(1μM 에피네프린, 5 μg/mL 트랜스페린, 10 nM 트리요오드티로닌, 0.1 μg/mL 하이드로코르티손, 5 ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 5 ng/mL 인슐린), 1 mL 항생제 용액(노르모신, 0.1 mg/mL). 일차 세포의 노화를 방지하고 확장 효율성을 개선하려면 앞서 설명한 바와 같이³⁹와 같은 성장 인자 억제제를 추가합니다: 최종 농도가 5μM인 Y-27632(Rho-associated protein kinase 또는 ROCK 억제제), 최종 농도가 1μM인 A83-01(Smad 신호 억제), 최종 농도가 0.4μM인 CHIR 99021(Glycogen synthase kinase-3 또는 GSK3 억제제) 및 최종 농도인 Rapamycin(라파마이신 또는 mTOR의 분자 표적 억제제) 5nM의 농도. 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 매체를 필터링합니다. 미디어 구성 요소 목록은 표 1 을 참조하십시오.
   2. 인간 기관지/기관 상피 세포(HBTEC) ALI 배지: 37°C에서 병을 해동하고 항생제 용액 1mL(Normocin, 0.1mg/mL)를 첨가하여 500mL의 HBTEC 배지를 만듭니다. 추가되면 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 매체를 필터링합니다.
   3. 억제제가 포함된 HBTEC 매체(HBTEC-I): 위와 같이 HBTEC 매체를 준비합니다. 여과하기 전에 최종 농도가 5μM인 Y-27632와 최종 농도가 0.5μM인 A83-01을 추가합니다. 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 매체를 필터링합니다.
      참고: BLEAM-I, HBTEC 및 HBTEC-I 배지를 4°C에서 날짜 및 라벨이 표시된 어두운 곳(호일로 포장)에 보관하고 필요한 만큼만 분취량만 예열합니다(유통 기한은 30일).
   4. HEPES/FBS: HEPES 완충 식염수 500mL와 FBS 88mL를 추가합니다(최종 농도는 15%). 첨가된 후에는 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 용액을 여과하고 날짜 및 라벨을 표시하여 4°C에서 보관합니다.
      알림: 사용하기 전에 부분 표본과 BLEAM, HEPES-FBS 및 트립신-EDTA를 37°C(최소 30분)까지 따뜻하게 하십시오.
2. 배양 플라스크 및 ALI 세포 배양 인서트를 804G 컨디셔닝 배지로 코팅
   1. 앞서 설명한 바와 같이 804G 세포(쥐 방광 상피 세포주) 매트릭스 조절 배지를 준비합니다³⁹.
   2. 37°C 인큐베이터에서 최소 4시간 동안 5% CO₂로 세포 배양 플라스크와 세포 배양 삽입물을 코팅합니다. 다양한 배양 플라스크 및 세포 배양 삽입물을 코팅하는 데 필요한 배지의 양은 표 2 를 참조하십시오.

2. nTAEC의 분리 및 확장과 후속 ALI 배양을 위한 준비

1. 삽관된 신생아의 기관내관을 정기적으로 흡입하는 동안 새로운 기관 흡인(약 1mL)을 획득하고 점액 트랩에서 흡인을 수집합니다. 흡인량이 점액 트랩에 도달하기에 충분하지 않은 경우 흡입 카테터를 1-3mL의 멸균 식염수로 헹굽니다.
2. 샘플에 라벨을 붙이고 얼음 위의 생물학적 위험 백에 보관하십시오.
   참고: 샘플은 4°C의 얼음에서 최대 24시간 동안 보관할 수 있습니다. 그러나 수율은 신선한 샘플에서 더 높습니다.
3. NICU에서 실험실로 검체를 운반합니다. T25 플라스크를 804G 컨디셔닝 배지로 코팅하고 기관 흡인을 실험실로 운송할 때 시료 접종을 준비합니다.
4. 생물학적 위험 백에서 점액 트랩을 제거하고 오염을 방지하기 위해 70% 에탄올로 외부 표면을 철저히 청소하십시오. 멸균 세포 배양 후드 아래에 있는 점액 트랩의 캡을 조심스럽게 엽니다.
5. 멸균 PBS가 포함된 기관 흡입 검체를 5mL(점액 희석을 위해)로 희석하고 전체 내용물을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
6. 튜브를 250 x g, 20 °C-23 °C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액(점액 포함)을 버립니다.
   참고: 여기에서 모든 원심분리는 달리 명시되지 않는 한 250 x g, 20 °C-23 °C에서 5분 동안 수행됩니다.
7. 펠릿을 5mL의 BLEAM-I에 재현탁합니다.
8. 인큐베이터에서 T25 플라스크를 제거하고 샘플을 도금하기 전에 804G 컨디셔닝 배지를 폐기합니다.
9. 샘플을 플레이트링합니다.ampT25 플라스크에 넣고 37°C, 5% CO₂ (이를 Passage 0 또는 P0라고 함)의 인큐베이터에 넣습니다.
10. 도금 후 24시간 후에 BLEAM-I로 배지를 교체하여 부착되지 않은 세포를 세척하고 그 후에는 48시간마다 세척합니다.
    참고: 기관 흡인 샘플을 처리하고 BLEAM-I 배지에서 배양한 후 직육면체 모양의 세포는 도금 후 7-10일 후에 나타납니다. 도금 후 약 3주가 지나면 세포가 조밀하게 채워지고 후속 계양, 확장 및 보관을 위해 트립신화가 필요합니다. 조기 통과(P1 - P2) 세포는 극저온 튜브(cryotube당 500μL의 동결 매체 당^2.5 x 10, 6개의 세포)에 배치되고 장기 보관을 위해 액체 질소에 보관됩니다.
11. 37°C 수조에서 액체 질소의 동결된 세포를 빠르게 해동하고 세포 현탁액을 BLEAM-I가 들어 있는 적절한 크기의 멸균 튜브로 옮깁니다.
12. 세포를 계수하여 트리판 블루 염색(trypan blue stain)과 자동 또는 수동 세포 계수기를 사용하여 전체 세포 수와 살아있는 세포 수를 측정한다⁴⁸. 적절한 부피의 BLEAM-I로 세포 현탁액을 희석하여 최종 농도가 15mL의 세포 현탁액(T75 플라스크의 경우)에서 2.1 x 10⁶ 세포가 되도록 합니다.
    참고: T25 플라스크의 경우 일반적으로 5mL의 세포 현탁액에 있는 0.7 x 10⁶ 세포가 파종에 사용됩니다.
13. 15mL 세포 현탁액을 T75 플라스크로 옮기고 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 배양합니다.
14. 다음 날 아침에 미디어를 새 BLEAM-I로 교환합니다. 그런 다음 2일마다 새 BLEAM-I로 미디어를 교환합니다. 세포가 약 80%-90%가 되면 ALI 배양을 위해 트립신화할 준비가 된 것입니다.
15. 세포 단층에 트립신-EDTA(T75) 5mL를 도포합니다.
    참고: 신선한 트립신을 사용하는 것을 잊지 마십시오. 여러 번 가열한 트립신의 사용은 피하십시오.
16. 인큐베이터에서 37 ° C에서 5 분 동안 플라스크를 배양합니다. 그런 다음 플라스크 8x-10x의 측면을 두드려 셀을 제거합니다. 현미경 아래를 확인하여 트립신화 후 세포가 이탈되었는지 확인합니다. 플라스크에 세포의 >50%가 남아 있으면 PBS 2x로 세척하고 배양 시간을 2-3분 단축하면서 트립신화 단계를 반복합니다.
17. 15mL의 HEPES-FBS와 피펫을 4x-5x 상하로 사용하여 반응을 중지합니다. 세포를 적절한 크기의 멸균 튜브로 옮기고 250 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
18. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 5x-10x를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 1mL의 BLEAM-I에 세포 펠릿을 용해시킵니다.
19. 세포를 세어 전체 셀 수와 살아있는 셀 수를 결정합니다. 세포 현탁액을 적절한 부피의 BLEAM-I로 희석하여 최종 농도가 세포 현탁액 100μl당 1 x 10⁵ 살아있는 세포가 되도록 합니다.

3. nTAEC의 ALI 문화

참고: 세포 배양 삽입물은 804G 컨디셔닝 배지로 코팅하고 다음 단계 전에 37°C, 5% CO₂ 에서 최소 4시간 동안 배양해야 합니다(단계 1.2 참조).

1. 인큐베이터에서 세포 배양 삽입물이 들어 있는 24웰 세포 배양 플레이트를 제거하고 804G 컨디셔닝 배지를 폐기합니다.
2. 각 ALI 웰의 기저외측(하부) 챔버에 BLEAM-I 1mL를 추가합니다. ALI 세포 배양 인서트의 정점 챔버에 100μL의 세포 현탁액(1 x 10⁵ 개 세포)을 추가하고 37°C, 5%_CO2에서 세포를 배양합니다. 이 단계는 ALI -2일로 정의됩니다.
3. 다음 날, 기저측(1mL) 및 정점(100μL) 챔버의 배지를 새 BLEAM-I로 교체합니다. 정점 챔버에서 매체를 변경할 때 세포 단층을 방해하지 않도록 주의하십시오. 이 단계는 ALI day -1로 정의됩니다.
4. 다음 날, 기저외측과 치근실 모두에서 배지를 제거합니다.
   참고: 세포 배양막의 세포가 침수 상태에서 합류하는 데 2일이 걸립니다. 이 단계에서 ALI가 성립될 수 있습니다.
5. 기저측 챔버에 HBTEC-I 배지 1mL를 추가하되 정점 챔버 배지는 공기에 노출되지 않도록 둡니다. 이 단계는 ALI day 0으로 정의됩니다.
6. ALI 0일차부터 6일차까지 48시간마다 기저측 챔버에서 HBTEC-I 배지(1mL)를 계속 교환합니다. ALI 7일째에 원하는 수확 시점까지 일반 HBTEC 배지(억제제 없음)로 전환합니다.
   참고: ALI 배양 첫 7일 동안에는 기저외측 챔버의 배지가 정점 챔버로 누출될 수 있습니다. 이 배지는 세포층의 건강을 유지하고 세포층이 분화할 수 있도록 매일 조심스럽게 흡인해야 합니다.
7. 분자 기술, 분석 및 분석을 위해 서로 다른 시점에서 세포, 세포 배양 삽입물 및 기저 배지를 수확합니다.
   1. 이 프로토콜의 경우, ALI 0일, 7일 및 28일에 상피 분화 마커의 qPCR 유전자 발현 분석(표준 제조업체 프로토콜)을 위해 세포를 수확합니다. ALI 0일, 7일, 14일 및 28일에 장벽 기능을 테스트하기 위해 세포 배양 삽입물을 수확합니다(아래 설명 방법).
   2. ALI 0일차 및 28일에는 상피 분화 마커를 사용한 면역형광 염색을 위해 포르말린 고정 세포 배양 삽입물을 사용합니다(이전에 발표된 프로토콜 활용)⁴⁹. ALI 14일차에 젖산 탈수소효소(LDH) 방출을 위한 기저측 배지(표준 제조업체 프로토콜), 산화 스트레스 마커의 qPCR을 위한 세포 용해물, 카스파제-3 및 절단된 카스파제-3 항체(표준 제조업체 프로토콜)를 사용한 면역블롯, 산화 스트레스 분석을 위한 세포 배양 삽입물(아래 설명 방법)을 수집합니다.

4. ALI 차별화 중 장벽 기능 테스트

1. 트랜스 상피 전기 저항(TEER) 측정
   참고: ALI 분화 중 EVOM(Epithelial Volt/Ohm Meter)을 사용하여 TEER을 측정하여 세포층 무결성을 평가합니다⁵⁰.
   1. 테스트 필터 저항 값을 측정하기 전에 804G 컨디셔닝 매체 코팅 세포 배양(세포 없음)을 사용하여 배경 저항 값을 옴(Ω) 단위로 측정합니다.
   2. 테스트 필터 저항 값에서 배경 저항 값을 빼고 그 차이에 셀 성장 표면적을 곱하여 각 테스트 필터에 대한 TEER 값을 구합니다.
      TEER = (Ω_티 - Ω_B) x 씨
      TEER = 트랜스 상피 전기 저항(Ω.cm²)
      Ω_T = 테스트 필터 저항 값(Ω)
      Ω_B = 배경 저항 값(Ω)
      C = 세포 성장 표면적(cm²)
      참고: TEER 측정에 사용되는 세포 배양 삽입물은 10% 완충 포르말린으로 고정되고 면역형광 염색 및 형광 현미경 검사(아래 설명 방법)에 즉시 사용되거나 나중에 염색을 위해 4°C에서 보관됩니다.
2. 플루오레세인 이세티오네이트 덱스트란(FITC-덱스트란) 상피 투과성 분석
   참고: ALI 분화 중 FITC-dextran(10kD 및 20kD)의 두 가지 다른 분자량을 사용하여 상피 투과성 분석을 수행했습니다.
   1. FITC-dextran 작업 용액(1mg/mL) 준비: FITC를 5mg을 측정하고 DMSO 1mL(5mg/mL)를 혼합합니다. 37°C로 예열된 HBTEC 매체에 5mg/mL 스톡을 1mg/mL 농도로 재현탁합니다. 빛으로부터 솔루션을 보호하십시오.
   2. 테스트 필터(세포 포함)를 새 12웰 플레이트로 옮기고 기저측 구획에 1mL의 HBTEC 배지를 추가합니다.
   3. 정점 격실 배지(있는 경우)를 흡입하고 250μL의 FITC-dextran 작업 용액으로 교체합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 60분 동안 배양합니다.
   4. 12웰 플레이트에서 테스트 필터(FITC-dextran 작업 용액 포함)를 제거하여 FITC-dextran 분석을 종료합니다.
   5. 12웰 플레이트에서 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브와 와류에 담긴 기저측 배지를 수집합니다.
   6. 각 튜브에서 100μL 분취액을 96웰 투명 바닥 검은색 폴리스티렌 마이크로플레이트로 3회씩 이동합니다. 배경 형광을 측정하기 위해 음성 대조군으로 100μL의 HBTEC 매체를 96웰 플레이트의 추가 웰로 옮깁니다.
   7. 490nm 여기(excitation) 및 520nm 방출 최대값을 사용하는 분광 광도계를 사용하여 형광 강도를 측정합니다.
   8. 테스트 필터 형광 값에서 평균 배경 형광 값을 빼서 보정된 형광을 구하고 값을 FITC 10 kD 및 20 kD에 대한 ALI 0일차의 보정된 형광 값에 대한 백분율로 표시합니다.

5. TriGas 인큐베이터를 사용한 고산소증 노출

1. ALI 7일차에 실험 및 수확 요구 사항에 따라 고산소증에 넣을 세포 배양 삽입물의 수를 결정합니다.
2. TriGas 인큐베이터의 O₂ 수준을 60% O₂로 설정합니다. 일반적으로 O₂ 수준이 60%에 도달하는 데 ~30-45분이 걸립니다.
3. O₂ 수준이 60%에서 안정화되면 고산소증 그룹에 할당된 세포 배양 삽입물이 있는 24웰 세포 배양 플레이트를 인큐베이터 내부에 놓고 인큐베이터 도어를 닫습니다.
   알림: 이 단계는 인큐베이터 내부의 O₂ 레벨이 크게 떨어지는 것을 방지하기 위해 가능한 한 효율적으로 수행해야 합니다.
4. 고산소증에 노출된 세포 배양 삽입물의 배지를 대조군(21% O₂ 노출) 웰과 동일한 일정에 따라 변경합니다. 세포 배양 인서트에 배지 누출이 있는지 매일 확인하고 세포 배양 챔버로의 누출을 부드럽게 흡인합니다.
5. 7일(ALI 7-14일) 동안 고산소증에 계속 노출됩니다. 고산소증 노출이 완료되면 ALI 14일째에 세포를 채취하거나 세포 배양 삽입물을 사용하여 분석을 수행합니다.

6. 고산소증의 영향을 평가하기 위한 산화 스트레스 분석

참고: CM-H2DCFDA 분석 키트를 사용하여 O₂ 노출 후 세포 배양 삽입체의 산화 스트레스 마커로 ALI 14일째에 형광 강도를 측정했습니다. H₂DCFDA는 화학적으로 환원되고 아세틸화된 형태의 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF)으로, 반응성 산소종(ROS)의 살아있는 세포 투과성 지표입니다. CM-H₂DCFDA는 H₂DCFDA의 티올 반응성 클로로메틸 유도체로, 세포 내 구성 요소에 대한 추가 공유 결합을 촉진하여 세포 내에서 염료를 더 오래 유지할 수 있습니다. 이러한 분자는 세포 내 에스테라제의 작용에 의해 아세테이트 그룹이 제거되고 세포 내에서 산화가 발생할 때까지 비형광입니다⁽⁵¹). 세포 내 산화 후, 그에 따른 형광의 증가는 세포 산화 스트레스의 대리 측정으로 형광 현미경으로 측정할 수 있습니다⁵². 시약은 가볍고 공기에 민감하므로 빛으로부터 보호하고 가능한 한 밀폐된 상태로 유지해야 합니다.

1. CM-H2DCFDA 분석 용액의 준비: 각 바이알에는 분말 형태의 시약 염료 50μg이 들어 있습니다. 1mM 원액을 만들려면 80μL의 멸균 DMSO를 바이알에 넣고 피펫과 잘 혼합한 다음 부드럽게 와류시킵니다. 세포 배양 삽입물에서 염료의 최종 농도가 1μM이려면 100μL PBS당 1mM 스톡 0.1μL를 추가합니다(예: 6개의 세포 배양 삽입물에 대해 600μL PBS에 0.6μL 스톡 용액 추가).
   참고 : 염료의 최종 농도는 1-5 μM 사이에서 다양 할 수 있습니다. 용량은 각 배양 조건에 맞게 최적화해야 합니다.
2. 고산소증에 노출된 그룹 또는 정상 산소증에 노출된 그룹 모두에 대해 각 세포 배양에 1μM 염료 용액 100μL를 추가합니다. 각 치료군에서 최소 1개의 세포 배양을 음성 대조군으로 사용합니다(염료가 없는 PBS 100μL). 37 ° C에서 30 분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. PBS로 1회 세탁합니다.
3. 슬라이드 준비: 여분의 PBS를 배출합니다. 세포 배양 삽입물을 조심스럽게 잡고 블레이드를 사용하여 세포 배양막을 천천히 잘라냅니다. 슬라이드에 장착액 1-2방울을 붓습니다. 끝이 평평한 집게로 멤브레인의 모서리를 조심스럽게 잡고 세포 쪽이 아래로 향하게 하여 마운트런트에 놓고 커버 슬립으로 덮습니다. 과도한 실장액을 제거하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 15분 동안 자연 건조시킵니다. 이제 슬라이드를 이미지화할 준비가 되었습니다.
   알림: 슬라이드 및 형광 현미경 검사의 준비는 2-3시간에 걸쳐 형광 강도가 크게 감소하므로 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.
4. 형광 현미경 검사: Cy2(시아닌-2) 채널을 활용하는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 세포 배양당 겹치지 않는 세 개의 개별 영역에서 이미지를 캡처합니다.
5. 산화 스트레스의 형광 검출
   참고: 형광 현미경 검사의 이미지를 사용하여 ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/) 및 아래에 설명된 워크플로우를 사용하여 보정된 총 세포 형광(CTCF)을 측정합니다. CTCF는 고산소 증후 노출 후 세포 배양 삽입물에서 산화 스트레스에 대한 마커 역할을 하며 ImageJ 소프트웨어의 도움으로 배경 형광을 제거하여 측정합니다.
   1. ImageJ에서 현미경 이미지를 열고 사각형 도구를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 선택 영역(α)을 저장하고 ROI(관심 영역) 관리자에 추가를 선택합니다. 이 선택 영역을 이미지 전체에 사용합니다.
   2. Analyze > Set Measurements에서 측정할 매개변수를 선택하고 설정 탭에서 Area, Integrated Density 및 Mean Gray Value를 선택합니다.
   3. 각 이미지에 대해 ROI 관리자에서 동일한 선택 영역을 사용하고 분석 > 측정을 선택합니다. 적분 밀도 값은 선택한 영역의 총 형광_(FT)을 나타냅니다. 팝업 창에서 측정값을 기록해 둡니다.
   4. 각 이미지에서 배경 형광(F_b)을 보정하려면 사각형 도구를 사용하여 형광등이 아닌 영역의 작은 영역을 선택합니다. 이 지역에 대한 분석 > 측정을 선택합니다. 평균 강도 값은 F_b를 나타냅니다. 팝업 창에서 측정값을 기록해 둡니다.
   5. 배경 판독값의 평균 형광 강도에 ROI의 총 면적을 곱하고 ROI의 통합 밀도 값에서 이 숫자를 빼서 CTCF를 계산합니다. 두 치료 그룹(대조군 및 고산소증)에 대한 모든 이미지에 대해 이 워크플로우를 반복합니다.
      CTCF = F_t - (F_b x α)
      CTCF = 보정된 총 세포 형광(A.U.)
      F_t = 총 형광
      F_b = 배경 형광
      α = 선택 영역

nTAEC를 분리하기 위해 NICU에서 삽관된 신생아로부터 기관 흡인을 수집하고 추가 처리를 위해 얼음에 담긴 흡인을 실험실로 운반했습니다 (그림 1A). 기도 상피 성장 배지(Rho/Smad, GSK3 및 mTOR 억제제를 포함하는 BLEAM-I)에 기관 흡인 샘플을 파종한 후 7-10일 이내에 직육면체 세포가 나타났습니다. 14일까지 세포는 50%-60% 융합되었?...

여기에 설명된 프로토콜은 NICU에서 삽관된 신생아로부터 신생아 기관 흡인 샘플을 수집 및 처리하는 방법을 자세히 설명하고, 이전에 확립된 방법을 사용하여 이러한 샘플에서 살아있는 nTAEC를 후속 분리 및 확장하는 방법을 설명합니다³⁹. 또한, ALI에서 nTAEC를 배양하고 TEER, FITC-dextran 분석, 면역형광 염색 및 세포 유형(즉, 기저, 섬모, 곤봉 및 잔) 특이적 ...

저자는 공개할 내용이 없으며 보고할 이해 상충이 없습니다.

이 작업은 Presbyterian Health Foundation(PHF) 및 Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources(U54GM104938 NIGMS의 IDeA(Institutional Development Award))에서 AG에 자금을 지원받습니다. 매사추세츠주 보스턴에 있는 하버드 의과대학 매사추세츠 종합병원의 Paul LeRou 박사와 Xingbin Ai 박사에게 일부 실험에 사용된 신생아 기증자 세포를 제공해 주신 데 대해 감사드립니다. 피규어는 Biorender로 제작되었습니다. 통계 분석은 GraphPad Prism을 사용하여 수행되었습니다.