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要約

新生児気管気道上皮細胞(nTAEC)を利用した気液界面(ALI)培養モデルを確立し、生理学的に関連する高酸素曝露を行うためのプロトコルについて説明し、発達中の新生児気道表面上皮に由来する細胞に対する大気圧誘発酸化ストレスの影響を研究します。

要約

早産児の気道上皮は、常に環境ストレス要因にさらされています。肺疾患の新生児におけるこれらのストレッサーの 1 つには、酸素 (O2) の張力が周囲の雰囲気よりも高いことが含まれます - 高酸素症 (>21% O2) と呼ばれます。高酸素症が気道に及ぼす影響は、気道の発達段階、高酸素症の程度、曝露期間など、さまざまな要因に左右され、曝露が変動すると独特の表現型につながる可能性があります。新生児の肺胞形成と気道過敏性に対する高酸素の影響については広範な研究が行われていますが、ヒトの新生児気道上皮細胞に対する高酸素症の短期的および長期的な根本的な影響についてはほとんど知られていません。この主な理由は、ヒトの新生児気道上皮の発達と機能を研究するための効果的な in vitro モデルが不足していることです。ここでは、ヒト新生児気管吸引液を用いてヒト新生児気管気道上皮細胞(nTAEC)を単離・増殖させ、これらの細胞を気液界面(ALI)培養で培養する方法について述べる。我々は、nTAECがALI培養において成熟した分極細胞単層を形成し、粘液繊毛分化を起こすことを実証する。また、特殊なインキュベーターを使用して、ALI培養中の細胞単層の中程度の高酸素曝露の方法も提示します。さらに、ALI培養における高酸素曝露後の細胞酸化ストレスを蛍光定量法を用いて測定するアッセイについて述べると、中等度の高酸素曝露は細胞の酸化ストレスを誘発するが、細胞膜の重大な損傷やアポトーシスを引き起こさないことが確認されています。このモデルは、新生児集中治療室 (NICU) の新生児気道が遭遇する臨床的に関連する高酸素曝露をシミュレートするために使用でき、新生児気道上皮プログラミングに対する O2 の短期的および長期にわたる影響を研究するために使用できます。このモデルを用いた研究は、元未熟児の長期気道疾患の発症に関与している、発達中の気道に対する早期の酸化的損傷を軽減する方法を探るために利用できる可能性がある。

概要

治療用酸素(O2)は、新生児集中治療室(NICU)1で最も使用されている治療法の1つです。その結果、高酸素曝露 (>21% O2) は、重大な肺疾患の有無にかかわらず新生児が遭遇する一般的な大気ストレッサーです。高酸素症に対する肺の反応は、曝露の強度および/または期間、および解剖学的位置、細胞型、および肺の発達の段階によって異なります2,3,4,5,6。新生児の高酸素肺損傷の研究の大部分は、モデル気管支肺胞形成症 (BPD) への出生後の肺胞形成の文脈での高酸素曝露の影響に焦点を当てています - 早産児に影響を与える最も一般的な慢性肺疾患 6,7,8,9,10,11。BPDの重症度は、呼吸補助の量によって分類され、月経後36週で9歳で必要なO2。BPDのほとんどの赤ちゃんは、肺が成長し続けるにつれて時間の経過とともに臨床的に改善し、大多数は1歳の誕生日を迎える前に呼吸補助をやめます12,13。出生後のBPDの重症度に関係なく、元早産児に影響を与える重大な罹患率には、就学前の喘鳴、喘息、小児期を通じて再発性呼吸器感染症、および早期発症の慢性閉塞性肺疾患のリスクが5倍に増加することが含まれます12,14,15,16,17,18,19.早産児の長期気道疾患および肺感染症に対する高酸素症の影響は、in vitroおよびin vivo動物モデル20,21,22,23,24を用いて調査されている。しかし、これらのモデルのほとんどは、間葉系組織、肺胞上皮、および気道平滑筋の役割に焦点を当てていました25,26,27,28。

気道表面上皮は、気管から末端細気管支まで伸びる呼吸器系の全経路に並んでおり、肺胞29のレベル直前で終わります。気道基底細胞は、気道上皮における一次幹細胞であり、成熟した気道上皮系統の全レパートリーに分化する能力を有しており、これには繊毛細胞および分泌細胞(クラブ細胞:非粘液産生細胞、および杯細胞:粘液産生)が含まれます29,30,31,32。新生児の高酸素性肺損傷の状況における細胞培養研究では、主に成人のヒトまたはマウスのがん細胞株が使用されています33,34。さらに、ほとんどのin vitro実験では、液中培養システムを使用しており、これにより、ヒトのin vivo気道上皮に類似した粘液線毛性気道上皮に細胞が分化することができない35。その結果、高酸素誘発性肺損傷の影響に関する知識にはギャップがあります ヒトの気道上皮細胞の発達における損傷。その理由の1つは、大気中曝露がヒトの新生児気道上皮に及ぼす影響を研究するためのトランスレーショナルモデルが不足していることです。人生の早い段階での高酸素性肺損傷は、長期的な気道疾患と感染リスクの増加につながる可能性があり、その結果、元早産児の人生を変える結果をもたらす可能性があります14,36,37。重度のBPDを有する生存していない乳児では、気道表面上皮には、杯細胞過形成や毛様体発達の障害などの明確な異常があり、異常な粘液線毛クリアランスと気道口径38を損なう上皮の高さの増加を示しています。過去10年間で、出生後の気道上皮の発達を研究するために、気液界面(ALI)で初代気道上皮細胞を培養することへの関心が高まっている39,40,41,42。しかし、新生児気道上皮細胞のALIモデルは、高酸素曝露などの大気酸化還元摂動モデルの文脈では使用されていません。

以前に発表された方法39 を使用して、NICU で挿管された新生児から得られた新生児気管吸引物サンプルを利用し、一次新生児気管気道上皮細胞 (nTAEC) の単離と拡大に成功しました。我々は、Rho、Smad、グリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK3)、および哺乳類のラパマイシン標的(mTOR)シグナル伝達の阻害剤を利用して、これらの細胞の増殖能力を高め、老化を遅らせるために、前述の39,42により、nTAECの効率的かつ後継化を可能にした。このプロトコルでは、nTAECを使用して3D ALI培養を確立し、nTAEC単分子膜で高酸素曝露を行う方法を説明しています。RhoおよびSmad阻害は、ALI培養の最初の7日間(ALI0〜7日目)に使用され、その後、これらの阻害剤はALI培養期間の残りの間、分化培地から除去されます。ALI培養気道上皮細胞単層の頂端表面は、環境にさらされたままであり43、これは大気摂動の研究を可能にし、in vivoで高酸素に曝露された発達中の新生児気道の病理生物学によく似ている。新生児高酸素性肺損傷の以前の細胞培養研究(不死化細胞または初代細胞に関係なく)で使用されたO2の濃度は、曝露の持続時間(15分から10日の範囲)と同様に、有意に変動します(40%から95%の範囲)36,44,45,46,47。この研究では、ALI細胞単層をALI7日目から14日目までの7日間(分化培地からRho/Smad阻害剤を除去した後)60%O2に曝露しました。高酸素曝露は、完全に分化した成熟上皮とは対照的に、粘液線毛分化の初期から中期の段階(ALI7日目から14日目)に行われ、したがって早産児のin vivo発達気道上皮をシミュレートします。このばく露戦略は、急性 O2 毒性 (高濃度の O2 で予想される) のリスクを最小限に抑えながら、生理学的に適切な範囲内で酸化ストレスを及ぼし、早産児の比較的低酸素の子宮内環境から高酸素の外部環境への移行の重要なウィンドウに似ています。

プロトコル

新生児気管吸引サンプルは、親からのインフォームドコンセントの後にのみ収集され、収集、輸送、および保管に使用されるプロトコルは、オクラホマ大学健康科学センターの治験審査委員会(IRB)(IRB 14377)によって承認されています。

1. nTAECの単離、継代、ALI培養の準備

  1. メディアの準備
    1. 阻害剤(BLEAM-I)を含む気管支上皮気道培地(BLEAM):1.25 mLのHLLサプリメント(500 μg / mLヒト血清アルブミン、0.6 μMリノール酸、0.6 μg / mLレシチン)、15 mLのL-グルタミン(6 mM)、2 mLの抽出物P(0.4%、ウシ下垂体抽出物)、5 mLのTM1(1 μMエピネフリン、 5 μg/mLトランスフェリン、10 nMトリヨードチロニン、0.1 μg/mLヒドロコルチゾン、5 ng/mL上皮成長因子(EGF)、5 ng/mLインスリン)、1 mLの抗生物質溶液(ノルモシン、0.1 mg/mL)。初代細胞の老化を防ぎ、増殖の効率を向上させるために、前述したように、以下の成長因子阻害剤を添加してください39:最終濃度5μMのY-27632(Rho関連プロテインキナーゼまたはROCK阻害剤)、最終濃度1μMのA83-01(Smadシグナル伝達を阻害する)、最終濃度0.4μMのCHIR 99021(グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3またはGSK3阻害剤)、およびラパマイシン(ラパマイシンまたはmTORの分子標的の阻害剤)を最終濃度で追加してください5 nMの濃度。0.22 μmのポアサイズフィルターで培地をろ過します。メディア・コンポーネントのリストについては、 表 1 を参照してください。
    2. ヒト気管支/気管上皮細胞(HBTEC)ALI培地:ボトルを37°Cで解凍し、1 mLの抗生物質溶液(ノルモシン、0.1 mg / mL)を加えて、500 mLのHBTEC培地を作成します。追加したら、0.22 μmのポアサイズフィルターでメディアをろ過します。
    3. 阻害剤を含むHBTEC培地(HBTEC-I):上記のようにHBTEC培地を調製します。ろ過する前に、次の阻害剤を追加します:最終濃度5μMのY-27632と最終濃度0.5μMのA83-01。
      注:BLEAM-I、HBTEC、およびHBTEC-I培地は、4°Cで保存し、日付とラベルを貼り、暗所(ホイルで包まれています)で保管し、必要なものだけをウォームアップしてください(保存期間は30日です)。
    4. HEPES/FBS:500 mLのHEPES緩衝生理食塩水と88 mLのFBSを加えます(最終濃度は15%)。.添加したら、0.22 μmの細孔径フィルターで溶液をろ過し、4°Cで保存し、日付とラベルを貼付します。
      注:使用前に、BLEAM、HEPES-FBS、およびトリプシン-EDTAを37°C(少なくとも30分)にアリコートして温めてください。
  2. 培養フラスコとALI細胞培養インサートを804Gで調整した培地でコーティング
    1. 前述のように、804G細胞(ラット膀胱上皮細胞株)マトリックスコンディショニング培地を調製する39。
    2. 細胞培養フラスコと細胞培養インサートを804Gでコンディショニングした培地で、37°Cインキュベーター(5% CO2)で少なくとも4時間コーティングします。さまざまな培養フラスコおよび細胞培養インサートをコーティングするために必要な培地の量については、 表2 を参照してください。

2. nTAECの単離・増殖とその後のALI培養に向けた準備

  1. 挿管された新生児の気管内チューブの定期的な吸引中に新鮮な気管吸引液(約1 mL)を取得し、吸引液を粘液トラップに集めます。.吸引量が粘液トラップに到達するのに不十分な場合は、吸引カテーテルを1〜3mLの滅菌生理食塩水ですすいでください。
  2. サンプルにラベルを付け、氷の上のバイオハザードバッグに保管します。
    注:サンプルは、4°Cの氷上に最大24時間保存できます。ただし、新鮮なサンプルでは収率が高くなります。
  3. サンプルをNICUからラボに輸送します。T25フラスコに804Gコンディショニング培地をコーティングし、気管吸引液をラボに輸送する際にサンプルの接種を準備します。
  4. バイオハザードバッグから粘液トラップを取り外し、汚染を避けるために70%エタノールで外面を完全に清掃します。滅菌細胞培養フードの下の粘液トラップのキャップを慎重に開きます。
  5. 気管吸引サンプルを滅菌PBSで5mLに希釈し(粘液を希釈するため)、内容物全体を50mLの円錐管に移します。
  6. チューブを250 x g、20°C-23°Cで5分間遠心分離し、上清(粘液を含む)を捨てます。
    注:ここでのすべての遠心分離は、特に指定がない限り、250 x g、20°C-23°Cで5分間行われます。
  7. ペレットを5mLのBLEAM-Iに再懸濁します。
  8. T25フラスコをインキュベーターから取り外し、804Gコンディショニング培地を廃棄してからサンプルをプレーティングします。
  9. サンプルをT25フラスコにプレートし、インキュベーターに37°C、5%CO2 (これをPassage 0またはP0と呼びます)に置きます。
  10. めっきの24時間後にBLEAM-Iで培地を交換し、付着していない細胞を洗い流し、その後48時間ごとに洗浄します。
    注:気管吸引サンプルを処理し、BLEAM-I培地でインキュベートした後、プレーティング後7〜10日で立方体状の細胞が現れます。プレーティング後約3週間で、細胞は密集し、その後の継代、増殖、および保存のためにトリプシン処理が必要になります。早期継代(P1 - P2)細胞をクライオチューブ(クライオチューブあたり凍結培地500μLあたり2.5 x 106 細胞)に入れ、液体窒素で保存して長期保存します。
  11. 凍結した細胞を液体窒素から37°Cのウォーターバスで迅速に解凍し、細胞懸濁液をBLEAM-Iを含む適切なサイズの滅菌チューブに移します。
  12. 細胞をカウントして、トリパンブルー染色剤および前述したように自動または手動のセルカウンターを利用して、総細胞数および生細胞数を決定する48。細胞懸濁液を適量のBLEAM-Iで希釈し、最終濃度が15 mLの細胞懸濁液(T75フラスコ用)中の6 細胞×2.1 x 10になるようにします。
    注:T25フラスコの場合、5 mLの細胞懸濁液中の0.7 x 106 細胞が一般的に播種に使用されます。
  13. 15 mLの細胞懸濁液をT75フラスコに移し、37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。
  14. 翌朝、新しいBLEAM-Iとメディアを交換します。その後、2日ごとに新しいBLEAM-Iとメディアを交換します。細胞が約80%〜90%になると、ALI培養のためにトリプシン化する準備が整います。
  15. 5 mLのトリプシン-EDTA(T75)を細胞単層に適用します。.
    注:新鮮なトリプシンを使用することを忘れないでください。複数回加熱したトリプシンの使用は避けてください。
  16. フラスコをインキュベーター内で37°Cで5分間インキュベートします。次に、フラスコの側面を8x-10x軽くたたいて細胞を取り除きます。顕微鏡でチェックして、トリプシン処理後に細胞が取り除かれたことを確認します。細胞の>50%がフラスコに残っている場合は、PBS 2xで洗浄し、インキュベーション時間を2〜3分短縮してトリプシン化ステップを繰り返します。
  17. 15mLのHEPES-FBSで反応を停止し、4x-5xを上下にピペットで動かします。細胞を適切なサイズの滅菌チューブに移し、250 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化します。
  18. 遠心分離後、上清を慎重に吸引します。細胞ペレットを1 mLのBLEAM-Iに溶解し、5回〜10回ピペッティングで静かに動かします。
  19. セルをカウントして、合計セル数と生セル数を決定します。細胞懸濁液を適量のBLEAM-Iで希釈し、最終濃度が細胞懸濁液100 μlあたり1 x 105 生細胞になるようにします。

3. nTAECのALI文化

注:細胞培養インサートは、804Gでコンディショニングした培地でコーティングし、次のステップに進む前に、37°C、5%CO2 で少なくとも4時間インキュベートする必要があります(ステップ1.2を参照)。

  1. 細胞培養インサートが入った24ウェル細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、804Gでコンディショニングした培地を廃棄します。
  2. 1 mLのBLEAM-Iを各ALIウェルの基底外側(下部)チャンバーに加えます。100 μLの細胞懸濁液(1 x 105 細胞)をALI細胞培養インサートの頂端チャンバーに添加し、細胞を37°C、5%CO2でインキュベートします。このステージは、ALI の -2 日目として定義されます。
  3. 翌日、基底外側(1 mL)チャンバーとアピカルチャンバー(100 μL)の培地を新しいBLEAM-Iで交換します。頂端チャンバー内の培地を交換するときは、細胞単層を乱さないように注意してください。このステージは、ALI の -1 日目として定義されます。
  4. 翌日、基底外側と頂端の両方のチャンバーからメディアを取り出します。
    注:細胞培養膜上の細胞が水没条件下でコンフルエントになるまでに2日かかります。この段階で、ALIを確立することができます。
  5. 1 mLのHBTEC-I培地を基底外側チャンバーに加えますが、頂端チャンバー培地は空けて空気にさらしておきます。このステージは、ALI の 0 日目として定義されます。
  6. ALI の 0 日目から 6 日目まで、48 時間ごとに基底外側チャンバー内の HBTEC-I 培地 (1 mL) を交換し続けます。ALI の 7 日目に、収穫の希望時点まで、通常の HBTEC 培地 (阻害剤なし) に切り替えます。
    注:ALI培養の最初の7日間は、基底外側チャンバーからの培地が頂端チャンバーに漏れることがあります。この培地は、細胞層の健康を維持し、細胞層が分化できるようにするために、毎日慎重に吸引する必要があります。
  7. 細胞、細胞培養インサート、および基底外側培地をさまざまな時点で回収し、分子技術、アッセイ、および分析を行います。
    1. このプロトコールでは、ALI の 0 日目、7 日目、および 28 日目に、上皮分化マーカーの qPCR 遺伝子発現解析 (標準メーカーのプロトコール) のために細胞を採取します。ALIの0日目、7日目、14日目、および28日目に、バリア機能をテストするための細胞培養インサートを回収します(後述の方法)。
    2. ALIの0日目と28日目に、上皮分化マーカーによる免疫蛍光染色のためのホルマリン固定細胞培養インサートを使用する(以前に発表されたプロトコルを使用)49。ALI の 14 日目に、乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) 遊離のための基底外側培地 (標準メーカーのプロトコル)、酸化ストレスマーカーの qPCR 用の細胞ライセート、およびカスパーゼ-3 および切断されたカスパーゼ-3 抗体によるイムノブロット (標準メーカーのプロトコル)、および酸化ストレスアッセイ用の細胞培養インサート (後述の方法) を回収します。

4. ALI分化時のバリア機能の試験

  1. 経上皮電気抵抗(TEER)の測定
    注:ALI分化中に上皮電圧/オーム計(EVOM)を使用してTEERを測定し、細胞層の完全性を評価します50。
    1. テストフィルターの抵抗値を測定する前に、804Gで調整した培地でコーティングされた細胞培養(細胞を含まない)を使用して、バックグラウンド抵抗値をオーム(Ω)で測定します
    2. テストフィルターの抵抗値からバックグラウンド抵抗値を差し引き、その差に細胞増殖表面積を掛けて、各テストフィルターのTEER値を求めます。
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = Trans Epithelial Electrical Resistance (Ω.cm2)
      ΩT = テストフィルタ抵抗値 (Ω)
      ΩB = バックグラウンド抵抗値 (Ω)
      C =細胞増殖表面積(cm2)
      注:TEER測定に使用した細胞培養インサートは、その後、10%緩衝ホルマリンで固定し、免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡法(後述の方法)に直ちに使用するか、または後で染色するために4°Cで保存します。
  2. フルオレセインイセチオネートデキストラン(FITC-デキストラン)上皮透過性アッセイ
    注:上皮透過性アッセイは、ALI分化中にFITC-デキストラン(10kDと20kD)の2つの異なる分子量を利用して実施されました。
    1. FITC-デキストランワーキングソリューション(1 mg / mL)を調製する:5 mgのFITCを測定し、1 mLのDMSO(5 mg / mL)を混合します。37°Cに温めたHBTEC培地に5 mg/mLストックを1 mg/mLの濃度に再懸濁します。溶液を光から保護します。
    2. テストフィルター(細胞を含む)を新しい12ウェルプレートに移し、基底外側コンパートメントに1 mLのHBTEC培地を加えます。
    3. 頂端コンパートメント培地(もしあれば)を吸引し、250μLのFITC-デキストラン作業溶液と交換します。.室温で光から保護した状態で60分間インキュベートします。
    4. 12ウェルプレートからテストフィルター(FITC-デキストラン作動溶液を含む)を取り外して、FITCデキストランアッセイを終了します。
    5. 12ウェルプレートから1.5 mLの微量遠心チューブとボルテックスで基底側培地を回収します。
    6. 各チューブから100 μLのアリコートを、底が透明な96ウェルの黒色ポリスチレンマイクロプレートに三重に移します。100 μL の HBTEC 培地を 96 ウェルプレートの追加のウェルに移し、バックグラウンド蛍光を測定するためのネガティブコントロールとして使用します。
    7. 分光光度計で490 nmの励起と520 nmの発光最大値を使用して蛍光強度を測定します。
    8. テストフィルターの蛍光値から平均バックグラウンド蛍光値を差し引いて補正蛍光を取得し、FITC 10 kDおよび20 kDのALI0日目の補正蛍光値に対する値をパーセンテージで表します。

5. TriGasインキュベーターを使用した高酸素曝露

  1. ALIの7日目に、実験と収穫のニーズに基づいて、高酸素中に入れる細胞培養インサートの数を決定します。
  2. TriGasインキュベーターのO2 レベルを60%O2に設定します。通常、O2 レベルが 60% に達するには 30 ~ 45 分かかります。
  3. O2 レベルが60%で安定したら、高酸素基に割り当てられた細胞培養インサートを備えた24ウェル細胞培養プレートをインキュベーター内に置き、インキュベーターのドアを閉じます。
    注:このステップは、インキュベーター内のO2 レベルの大幅な低下を防ぐために、できるだけ効率的に実行する必要があります。
  4. 高酸素に曝露した細胞培養インサートの培地は、コントロールウェル(21%O2 露光)と同じスケジュールで交換してください。細胞培養インサートに培地の漏れがないか毎日チェックし、細胞培養チャンバーへの漏れを静かに吸引します。
  5. 高酸素曝露を7日間継続します(ALI7〜14日目)。高酸素曝露が完了したら、ALIの14日目に細胞を採取するか、細胞培養インサートを利用してアッセイを実施します。

6. 高酸素の影響を評価するための酸化ストレスアッセイ

注:CM-H2DCFDAアッセイキットを使用し、O2 曝露後の細胞培養インサートの酸化ストレスのマーカーとしてALI14日目に蛍光強度を測定しました。H2DCFDAは、活性酸素種(ROS)の生細胞透過性指標である2′,7′-ジクロロフルオレセイン(DCF)の化学的に還元され、アセチル化された形態です。CM-H2DCFDAは、H2DCFDAのチオール反応性クロロメチル誘導体であり、細胞内成分へのさらなる共有結合を促進し、細胞内での色素のより長い保持を可能にします。これらの分子は、細胞内エステラーゼの作用によりアセテート基が除去され、細胞内で酸化が起こるまでは無蛍光である51。細胞内酸化に続いて、結果として生じる蛍光の増加は、細胞酸化ストレスの代理尺度として蛍光顕微鏡で測定することができる52。試薬は軽くて空気に弱いため、光から保護し、可能な限り気密に保つ必要があります。

  1. CM-H2DCFDAアッセイ溶液の調製:各バイアルには、粉末状の試薬色素が50 μg含まれています。1 mMのストック溶液を調製するには、バイアルに80 μLの滅菌DMSOを加え、ピペットでよく混合し、穏やかにボルテックスします。細胞培養インサート中の色素の最終濃度が1 μMの場合、100 μL PBSあたり1 mMストックの0.1 μLを添加します(たとえば、6つの細胞培養インサートに対して600 μL PBSに0.6 μLストック溶液を添加します)。
    注:染料の最終濃度は1〜5μMの間で変化します。用量は、各培養条件に対して最適化する必要があります。
  2. 各細胞培養物に1 μMの色素溶液100 μLを、高酸素曝露群または正常酸素曝露群の両方について添加します。各処理群のネガティブコントロールとして少なくとも1つの細胞培養物を使用してください(色素を含まないPBS100μL)。37°Cで30分間インキュベートし、光から保護します。PBSで1回洗います。
  3. スライドの準備:余分なPBSを排出します。細胞培養インサートを慎重に保持し、ブレードを使用して細胞培養膜をゆっくりと切り取ります。スライドに1〜2滴の封入液を注ぎます。先端が平らな鉗子で、メンブレンの角を慎重に保持し、細胞側を下にして封入剤の上に置き、カバースリップで覆います。余分な封入液を取り除き、光を避けて室温で15分間自然乾燥させます。これで、スライドを画像化する準備が整いました。
    注:スライド顕微鏡および蛍光顕微鏡の調製は、蛍光強度が2〜3時間で大幅に低下するため、できるだけ早く実施する必要があります。
  4. 蛍光顕微鏡:Cy2(シアニン-2)チャンネルを利用した蛍光顕微鏡で画像を撮影します。細胞培養ごとに3つの別々の重複しない領域から画像をキャプチャします。
  5. 酸化ストレスの蛍光検出
    注:蛍光顕微鏡の画像を使用して、ImageJソフトウェア(https://imagej.nih.gov/ij/)と以下に説明するワークフローを使用して、補正された全細胞蛍光(CTCF)を測定します。CTCFは、高酸素曝露後の細胞培養インサートの酸化ストレスのマーカーとして機能し、ImageJソフトウェアの助けを借りてバックグラウンド蛍光を排除することによって測定されます。
    1. ImageJで顕微鏡画像を開き、長方形ツールを使用して関心のある領域を選択します。選択領域 (α) を右クリックして [ROI (関心領域) マネージャーに追加] を選択して保存します。この選択領域を画像全体で使用します。
    2. 「解析」>「測定の設定」で測定のパラメータを選択し、設定タブで「面積」、「積分密度」、および「平均グレー値」を選択します。
    3. 各画像について、ROI マネージャーの同じ選択領域を使用し、[ 分析] > [測定] を選択します。積分密度値は、選択した領域の総蛍光(Ft)を表します。ポップアップウィンドウから測定値をメモします。
    4. 各画像の背景蛍光(Fb)を補正するには、長方形ツールで非蛍光領域の小さな領域を選択します。この地域の [Analyze > Measure ] を選択します。平均強度値はFbを表します。ポップアップウィンドウから測定値をメモします。
    5. バックグラウンド測定値の平均蛍光強度にROIの総面積を掛け、ROIの積分密度値からこの数値を差し引くことにより、CTCFを計算します。このワークフローを、両方の治療グループ(コントロールと高酸素)のすべての画像に対して繰り返します。
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = 補正された全細胞蛍光 (A.U.)
      Ft = 全蛍光
      Fb = バックグラウンド蛍光
      α = 選択領域

結果

nTAECを単離するために、NICUで挿管された新生児から気管吸引物を採取し、氷上で吸引物を実験室に輸送してさらなる処理を行いました (図1A)。気管吸引液サンプルを気道上皮増殖培地(Rho/Smad、GSK3、およびmTOR阻害剤を含むBLEAM-I)に播種した後、7〜10日以内に立方体細胞が出現しました。 14日後には、細胞は50%〜60%がコン?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、NICUで挿管された新生児からの新生児気管吸引物サンプルの収集と処理の方法、およびその後、以前に確立された方法を使用してこれらのサンプルから生きたnTAECを分離および拡大する方法を詳しく説明しています39。さらに、TEERの測定、FITC-デキストランアッセイ、免疫蛍光染色、および細胞タイプ(すなわち、基底、...

開示事項

著者には開示すべきものはなく、報告すべき利益相反もありません。

謝辞

この研究は、長老派健康財団(PHF)とオクラホマ共有臨床およびトランスレーショナルリソース(NIGMSから機関開発賞(IDeA)を受賞U54GM104938)からAGへの資金提供によってサポートされています。マサチューセッツ州ボストンのハーバード大学マサチューセッツ総合病院のPaul LeRou博士とXingbin Ai博士には、一部の実験で使用された新生児ドナー細胞を提供していただいたことに感謝いたします。フィギュアはBiorenderで作成しました。統計解析はGraphPad Prismを用いて行いました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Buffered FormalinFisher Scientific23-426796
1X PBS (Phosphate Buffered Saline) Solution, pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Inserts, 6.5mmCorning3470
Anti-Acetylated Tubulin antibody, Mouse monoclonalSigmaT7451
Anti-alpha Tubulin antibodyAbcamab7291
Anti-Cytokeratin 5 antibodyAbcamab53121
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Cleaved caspase-3 antibodyCell signaling9664T
SCGB1A1 or Club Cell Protein (CC16) Human, Rabbit Polyclonal AntibodyBioVendor R&DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)Thermo ScientificC6827
Corning Cell Culture Treated T25 FlasksCorning430639
Corning U-Shaped Cell Culture T75 FlasksCorning430641U
CyQUANT LDH Cytotoxicity AssayThermo ScientificC20300
DAPI Solution (1 mg/mL)Fisher ScientificEN62248
Dimethyl sulfoxide [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Distilled waterGibco15230162
EVOM Manual for TEER MeasurementWorld Precision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco10082147
Fluorescein Isothiocyanate Dextran (average mol wt 10,000)Fisher ScientificF0918100MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (average mol wt 20,00)SigmaFD20-100MG
Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Human ads-HRPSouthern Biotech1031-05
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Air-Liquid Interface (ALI) Differentiation MediumLifeLine Cell TechnologyLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator, 165 LThermo Scientific51030411
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Scientific4368814
HLL supplementLifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/Aimagej.nih.gov/ij/
Invivogen Normocin - Antimicrobial ReagentFisher ScientificNC9273499
L-GlutamineLifeLine Cell TechnologyLS-1013
Normal Goat SerumGibcoPCN5000
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman Gene Exression Assays: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gene Exression Assays: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gene Exression Assays: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gene Exression Assays: GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Taqman Gene Exression Assays: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Taqman Gene Exression Assays: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Taqman Gene Exression Assays: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman Gene Exression Assays: KRT5Thermo ScientificHs00361185_m1
Taqman Gene Exression Assays: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gene Exression Assays: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman Gene Exression Assays: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gene Exression Assays: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane (0.22 μm pores, 500 ml)Thermo Scientific5660020
TM-1 Combined SupplementLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Total caspase-3 antibodyCell signaling14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.05%), Phenol redGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0

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