Translationales 3D-Zellkulturmodell zur Bewertung von Hyperoxie-Effekten auf humane neonatale Atemwegsepithelzellen

Wir beschreiben ein Protokoll zur Etablierung eines Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen-Kulturmodells (ALI) unter Verwendung neonataler Tracheal-Atemwegsepithelzellen (nTAEC) und führen eine physiologisch relevante Hyperoxie-Exposition durch, um die Wirkung von atmosphärisch induziertem oxidativem Stress auf Zellen zu untersuchen, die aus dem sich entwickelnden neonatalen Atemwegsepithel stammen.

Das Epithel der Atemwege bei Frühgeborenen ist ständig Umwelteinflüssen ausgesetzt. Einer dieser Stressoren bei Neugeborenen mit Lungenerkrankung ist die Sauerstoffspannung (O₂), die höher ist als die Umgebungsatmosphäre - die sogenannte Hyperoxie (>21 % O₂). Die Wirkung von Hyperoxie auf die Atemwege hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter das Entwicklungsstadium der Atemwege, der Grad der Hyperoxie und die Dauer der Exposition, wobei variable Expositionen möglicherweise zu einzigartigen Phänotypen führen. Während es umfangreiche Forschungen über die Auswirkungen von Hyperoxie auf die Lungenalveolarisierung und die Hyperreaktivität der Atemwege bei Neugeborenen gibt, ist wenig über die kurz- und langfristige Wirkung von Hyperoxie auf menschliche neonatale Atemwegsepithelzellen bekannt. Ein Hauptgrund dafür ist der Mangel an einem effektiven In-vitro-Modell zur Untersuchung der Entwicklung und Funktion des Epithels der Atemwege bei menschlichen Neugeborenen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Expansion humaner neonataler Tracheal-Atemwegsepithelzellen (nTAECs) unter Verwendung von humanen neonatalen Trachealaspiraten und zur Kultivierung dieser Zellen in einer Luft-Flüssig-Grenzfläche (ALI)-Kultur. Wir zeigen, dass nTAECs in ALI-Kulturen eine reife polarisierte Zell-Monoschicht bilden und eine mukoziliäre Differenzierung durchlaufen. Wir stellen auch eine Methode zur moderaten Hyperoxie-Exposition der Zellmonoschicht in ALI-Kultur unter Verwendung eines speziellen Inkubators vor. Darüber hinaus beschreiben wir einen Assay zur Messung von zellulärem oxidativem Stress nach Hyperoxie-Exposition in ALI-Kulturen mittels Fluoreszenzquantifizierung, der bestätigt, dass eine moderate Hyperoxie-Exposition zellulären oxidativen Stress induziert, aber keine signifikante Zellmembranschädigung oder Apoptose verursacht. Dieses Modell kann möglicherweise verwendet werden, um eine klinisch relevante Hyperoxie-Exposition zu simulieren, der neonatale Atemwege auf der Neugeborenen-Intensivstation (NICU) ausgesetzt sind, und um die kurz- und lang anhaltenden Auswirkungen von O₂ auf die Epithelprogrammierung der Atemwege bei Neugeborenen zu untersuchen. Studien, die dieses Modell verwenden, könnten genutzt werden, um Wege zu erforschen, wie oxidative Schädigungen der sich entwickelnden Atemwege im frühen Leben gemildert werden können, die an der Entwicklung langfristiger Atemwegserkrankungen bei ehemaligen Frühgeborenen beteiligt sind.

Therapeutischer Sauerstoff (O₂) ist eine der am häufigsten verwendeten Therapien auf der Neugeborenen-Intensivstation1. Folglich ist die Hyperoxie-Exposition (>21 % O₂) ein häufiger atmosphärischer Stressfaktor, dem Neugeborene mit und ohne signifikante Lungenerkrankung ausgesetzt sind. Die Reaktionen der Lunge auf Hyperoxie können je nach Intensität und/oder Dauer der Exposition und der anatomischen Lokalisation, dem Zelltyp und dem Stadium der Lungenentwicklung variieren 2,3,4,5,6. Der Großteil der Forschung zur neonatalen Hyperoxie-Lungenschädigung konzentrierte sich auf die Auswirkungen der Hyperoxie-Exposition im Rahmen der postnatalen Alveolarisierung zur Modellierung der bronchopulmonalen Dysplasie (BPD) - der häufigsten chronischen Lungenerkrankung, die Frühgeborene betrifft 6,7,8,9,10,11. Der Schweregrad der BPD wird durch die Menge der Atemunterstützung und O₂ klassifiziert, die 36 Wochen nach der Menstruation im Alter^{von 9} Wochen benötigt wird. Die meisten Babys mit BPS verbessern sich im Laufe der Zeit klinisch, wenn die Lunge weiter wächst, wobei die Mehrheit die Atemunterstützung vor ihrem ersten Geburtstag absetzt^12,13. Unabhängig von der Schwere der BPD nach der Geburt gehören zu den signifikanten Morbiditäten, die ehemalige Frühgeborene betreffen, ein 5-fach erhöhtes Risiko für Keuchen im Vorschulalter, Asthma, wiederkehrende Atemwegsinfektionen während der Kindheit und früh einsetzende chronisch obstruktive Lungenerkrankung 12,14,15,16,17,18,19. Die Wirkung von Hyperoxie auf langfristige Atemwegserkrankungen und Lungeninfektionen bei Frühgeborenen wurde unter Verwendung von in vitro und in vivo Tiermodellen untersucht 20,21,22,23,24. Die meisten dieser Modelle konzentrierten sich jedoch auf die Rolle des mesenchymalen Gewebes, des Alveolarepithels und der glatten Muskulatur der Atemwege 25,26,27,28.

Das Oberflächenepithel der Atemwege erstreckt sich über den gesamten Weg des Atmungssystems, erstreckt sich von der Luftröhre bis hinunter zur terminalen Bronchiole und endet kurz vor der Höhe der Alveolen²⁹. Basalzellen der Atemwege sind die primären Stammzellen im Epithel der Atemwege und haben die Fähigkeit, sich in das gesamte Repertoire reifer Epithellinien der Atemwege zu differenzieren, zu denen Flimmerzellen und sekretorische Zellen gehören (Keulenzellen: nicht schleimproduzierende und Becherzellen: schleimproduzierende Zellen)29,30,31,32. Zellkulturstudien im Zusammenhang mit hyperoxischen Lungenverletzungen bei Neugeborenen haben hauptsächlich adulte Krebszelllinien von Menschen oder Mäusen verwendet^33,34. Darüber hinaus wurden in den meisten In-vitro-Experimenten submerse Kultursysteme verwendet, die keine Differenzierung der Zellen in ein mukoziliäres Atemwegsepithel zulassen, das dem in vivo Atemwegsepithel beim Menschen ähnelt³⁵. Folglich besteht eine Wissenslücke über die Auswirkungen einer Hyperoxie-induzierten Lungenschädigung auf die Entwicklung von Atemwegsepithelzellen bei menschlichen Neugeborenen. Ein Grund dafür ist der Mangel an translationalen Modellen, um die Auswirkungen der atmosphärischen Exposition auf das Atemwegsepithel von Neugeborenen zu untersuchen. Eine hyperoxische Lungenschädigung in jungen Jahren kann zu langfristigen Atemwegserkrankungen und einem erhöhten Infektionsrisiko führen, was bei ehemaligen Frühgeborenen lebensverändernde Folgen hat ^14,36,37. Bei nicht überlebenden Säuglingen mit schwerer BPS weist das Oberflächenepithel der Atemwege deutliche Anomalien auf, einschließlich Becherzellhyperplasie und gestörter Ziliarentwicklung, was auf eine abnormale mukoziliäre Clearance und eine erhöhte Epithelhöhe hinweist, die das Atemwegskaliber^{beeinträchtigen 38}. In den letzten zehn Jahren gab es ein erhöhtes Interesse an der Kultivierung primärer Atemwegsepithelzellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI), um die postnatale Entwicklung des Atemwegsepithels zu untersuchen 39,40,41,42. ALI-Modelle von neonatalen Atemwegsepithelzellen wurden jedoch nicht im Zusammenhang mit atmosphärischen Redoxstörungsmodellen wie der Hyperoxie-Exposition verwendet.

Unter Verwendung einer zuvor veröffentlichten Methode³⁹ haben wir neonatale Trachealaspiratproben von intubierten Neugeborenen auf der neonatologischen Intensivstation verwendet und erfolgreich primäre neonatale Trachealatepithelzellen (nTAECs) isoliert und erweitert. Wir haben Inhibitoren von Rho, Smad, Glykogensynthase-Kinase (GSK3) und Mammalian Target of Rapamycin (mTOR)-Signalweg verwendet, um die Expansionskapazität zu erhöhen und die Seneszenz in diesen Zellen zu verzögern, wie zuvor beschrieben^39,42, was eine effiziente und spätere Passage von nTAECs ermöglicht. Das Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von 3D-ALI-Kulturen unter Verwendung von nTAECs und zur Durchführung einer Hyperoxie-Exposition auf den nTAEC-Monolayern. Die Rho- und Smad-Hemmung wird für die ersten 7 Tage der ALI-Kultur (ALI-Tage 0 bis 7) verwendet, danach werden diese Inhibitoren für den Rest der ALI-Kulturdauer aus dem Differenzierungsmedium entfernt. Die apikale Oberfläche der ALI-kultivierten Epithelzell-Monoschicht der Atemwege bleibt der Umgebung^{ausgesetzt 43}, was atmosphärische Störungsstudien ermöglicht und der Pathobiologie eines sich entwickelnden neonatalen Atemwegs, der in vivo Hyperoxie ausgesetzt ist, sehr ähnlich ist. Die Konzentration von O₂, die in früheren Zellkulturstudien (unabhängig von immortalisierten oder primären Zellen) bei hyperoxischen Lungenschäden bei Neugeborenen verwendet wurde, variiert erheblich (zwischen 40 % und 95 %), ebenso wie die Dauer der Exposition (zwischen 15 Minuten und 10 Tagen)36,44,45,46,47. Für diese Studie wurde die ALI-Zell-Monoschicht 7 Tage lang von ALI-Tag 7 bis 14 (nach Entfernung von Rho/Smad-Inhibitoren aus dem Differenzierungsmedium) mit 60% O₂ exponiert. Die Hyperoxie-Exposition wurde während der frühen bis mittleren Phase der mukoziliären Differenzierung (ALI Tag 7 bis 14) im Gegensatz zum vollständig differenzierten reifen Epithel durchgeführt und simuliert somit das sich in vivo entwickelnde Atemwegsepithel bei Frühgeborenen. Diese Expositionsstrategie minimiert das Risiko einer akuten_{O2-Toxizität} (die bei höheren_{O2-Konzentrationen} zu erwarten ist) bei gleichzeitiger Ausübung von oxidativem Stress in einem physiologisch relevanten Bereich und ähnelt dem kritischen Fenster des Übergangs von der relativ hypoxischen intrauterinen Umgebung zu einer hyperoxischen äußeren Umgebung bei frühgeborenen menschlichen Neugeborenen.

Trachealaspiratproben bei Neugeborenen wurden nur nach Einverständniserklärung der Eltern entnommen, und das für die Entnahme, den Transport und die Lagerung verwendete Protokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) des University of Oklahoma Health Sciences Center (IRB 14377) genehmigt.

1. Vorbereitung auf die Isolierung, Passage und ALI-Kultur von nTAEC

1. Vorbereitung der Medien
   1. Bronchialepitheliales Atemwegsmedium (BLEAM) mit Inhibitoren (BLEAM-I): Bereiten Sie 500 ml (1 Flasche, gelagert bei 4 °C) BLEAM vor, indem Sie 1,25 ml HLL-Supplement (500 μg/ml humanes Serumalbumin, 0,6 μM Linolsäure, 0,6 μg/ml Lecithin), 15 ml L-Glutamin (6 mM), 2 ml Extrakt P (0,4 %, Rinderhypophysenextrakt), 5 ml TM1 (1 μM Adrenalin, 5 μg/ml Transferrin, 10 nM Trijodthyronin, 0,1 μg/ml Hydrocortison, 5 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 5 ng/ml Insulin), 1 ml Antibiotikalösung (Normocin, 0,1 mg/ml). Um die Seneszenz der Primärzellen zu verhindern und die Effizienz der Expansion zu verbessern, fügen Sie die folgenden Wachstumsfaktor-Inhibitoren hinzu, wie zuvor beschrieben³⁹: Y-27632 (Rho-assoziierte Proteinkinase oder ROCK-Inhibitor) mit einer Endkonzentration von 5 μM, A83-01 (hemmt die Smad-Signalgebung) mit einer Endkonzentration von 1 μM, CHIR 99021 (Glykogensynthase-Kinase-3- oder GSK3-Inhibitor) mit einer Endkonzentration von 0,4 μM und Rapamycin (Inhibitor des molekularen Ziels von Rapamycin oder mTOR) mit einer Endkonzentration Konzentration von 5 nM. Filtern Sie das Medium durch einen 0,22 μm Porenfilter. In Tabelle 1 finden Sie eine Liste der Medienkomponenten.
   2. ALI-Medium für humane Bronchiale/Trachealepithelzellen (HBTEC): Stellen Sie 500 ml HBTEC-Medium her, indem Sie die Flasche bei 37 °C auftauen und 1 ml Antibiotikalösung (Normocin, 0,1 mg/ml) hinzufügen. Nach der Zugabe filtrieren Sie das Medium durch einen 0,22 μm Porenfilter.
   3. HBTEC-Medien mit Inhibitoren (HBTEC-I): Bereiten Sie die HBTEC-Medien wie oben vor. Vor der Filterung sind folgende Inhibitoren zuzugeben: Y-27632 mit einer Endkonzentration von 5 μM und A83-01 mit einer Endkonzentration von 0,5 μM. Das Medium wird durch einen 0,22 μm Porenfilter filtriert.
      HINWEIS: Lagern Sie BLEAM-I-, HBTEC- und HBTEC-I-Medien bei 4 °C, datiert und beschriftet, im Dunkeln (in Folie eingewickelt) und erwärmen Sie nur die Aliquots dessen, was benötigt wird (Haltbarkeit beträgt 30 Tage).
   4. HEPES/FBS: Fügen Sie 500 mL HEPES-gepufferte Kochsalzlösung und 88 mL FBS hinzu (Endkonzentration beträgt 15%). Nach der Zugabe wird die Lösung durch einen 0,22 μm Porenfilter filtriert und bei 4 °C datiert und beschriftet gelagert.
      HINWEIS: Aliquot und erwärmen Sie BLEAM, HEPES-FBS und Trypsin-EDTA auf 37 °C (mindestens 30 Minuten) vor der Anwendung.
2. Beschichtung von Kulturkolben und ALI-Zellkultureinsätzen mit einem 804G-konditionierten Medium
   1. Bereiten Sie das matrixkonditionierte Medium der 804G-Zelle (Rattenblasen-Epithelzelllinie) vor, wie zuvor beschrieben³⁹.
   2. Beschichten Sie den Zellkulturkolben und die Zellkultureinsätze mindestens 4 h lang im 37 °C Inkubator mit 804G-konditionierten Medien, 5 % CO₂. In Tabelle 2 sind die Medienmengen aufgeführt, die zum Beschichten verschiedener Kulturkolben und Zellkultureinsätze benötigt werden.

2. Isolierung und Expansion von nTAECs und Vorbereitung für die anschließende ALI-Kultur

1. Entnehmen Sie frisches Trachealaspirat (ca. 1 ml) während des routinemäßigen Absaugens des Endotrachealtubus von intubierten Neugeborenen und sammeln Sie das Aspirat in einer Schleimfalle. Wenn das Aspiratvolumen nicht ausreicht, um die Schleimfalle zu erreichen, spülen Sie den Absaugkatheter mit 1-3 ml steriler Kochsalzlösung.
2. Beschriften Sie die Probe und bewahren Sie sie in einem Biohazard-Beutel auf Eis auf.
   HINWEIS: Die Proben können maximal 24 h bei 4 °C auf Eis gelagert werden. Bei frischen Proben ist die Ausbeute jedoch höher.
3. Transportieren Sie die Probe von der Neugeborenen-Intensivstation zum Labor. Beschichten Sie einen T25-Kolben mit 804G-konditioniertem Medium und bereiten Sie die Inokulation der Probe zum Zeitpunkt des Transports des Trachealaspirats zum Labor vor.
4. Entfernen Sie die Schleimfalle aus dem Biohazard-Beutel und reinigen Sie die Außenflächen gründlich mit 70 % Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden. Öffnen Sie vorsichtig die Kappe der Schleimfalle unter einer sterilen Zellkulturhaube.
5. Verdünnen Sie die Trachealaspiratprobe mit sterilem PBS auf 5 mL (um den Schleim zu verdünnen) und überführen Sie den gesamten Inhalt in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 250 x g, 20 °C-23 °C für 5 min und entsorgen Sie den Überstand (einschließlich Schleim).
   HINWEIS: Alle Zentrifugationen hier werden bei 250 x g, 20 °C-23 °C für 5 min durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
7. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL BLEAM-I.
8. Nehmen Sie den T25-Kolben aus dem Inkubator und entsorgen Sie das 804G-konditionierte Medium, bevor Sie die Probe plattieren.
9. Die Probe wird in den T25-Kolben eingefüllt und bei 37 °C und 5 % CO₂ in den Inkubator gestellt (dies wird als Durchgang 0 oder P0 bezeichnet).
10. Wechseln Sie das Medium mit BLEAM-I 24 h nach dem Plattieren, um ungebundene Zellen auszuwaschen, und anschließend alle 48 h.
    HINWEIS: Nach der Verarbeitung der Trachealaspiratprobe und der Inkubation in BLEAM-I-Medien erscheinen quaderförmige Zellen 7-10 Tage nach der Beschichtung. Etwa 3 Wochen nach der Beschichtung sind die Zellen dicht gepackt und benötigen eine Trypsinisierung für die anschließende Passage, Expansion und Lagerung. Zellen der frühen Passage (P1 - P2) werden in Kryoröhrchen (2,5 x 10,⁶ Zellen pro 500 μl Gefriermedium pro Kryoröhrchen) gegeben und zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff gelagert.
11. Tauen Sie gefrorene Zellen schnell mit flüssigem Stickstoff in einem 37 °C warmen Wasserbad auf und überführen Sie die Zellsuspension in ein steriles Röhrchen mit BLEAM-I in geeigneter Größe.
12. Zählen Sie die Zellen, um die Gesamt- und Lebendzellzahl zu bestimmen, indem Sie eine Trypanblau-Färbung und einen automatisierten oder manuellen Zellzähler verwenden, wie zuvor beschrieben⁴⁸. Die Zellsuspension wird mit einem geeigneten Volumen BLEAM-I verdünnt, so dass die Endkonzentration 2,1 x 10⁶ Zellen in 15 ml Zellsuspension (für T75-Kolben) beträgt.
    HINWEIS: Für einen T25-Kolben werden im Allgemeinen 0,7 x 10⁶ Zellen in 5 ml Zellsuspension für die Aussaat verwendet.
13. Die 15-ml-Zellsuspension wird in einen T75-Kolben überführt und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert.
14. Tauschen Sie am nächsten Morgen die Medien mit dem neuen BLEAM-I aus. Tauschen Sie dann alle 2 Tage das Medium gegen ein neues BLEAM-I aus. Sobald die Zellen etwa 80 % bis 90 % betragen, sind sie bereit, für die ALI-Kultur trypsinisiert zu werden.
15. Tragen Sie 5 ml Trypsin-EDTA (T75) auf die Zellmonoschicht auf.
    HINWEIS: Denken Sie daran, frisches Trypsin zu verwenden. Vermeiden Sie die Verwendung von Trypsin, das mehrfach erhitzt wurde.
16. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 °C für 5 min im Inkubator. Klopfen Sie dann 8x-10x auf die Seite des Kolbens, um die Zellen zu entfernen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen nach der Trypsinisierung entfernt wurden. Wenn >50% der Zellen auf dem Kolben verbleiben, waschen Sie mit PBS 2x und wiederholen Sie den Trypsinisierungsschritt mit einer verkürzten Inkubationszeit von 2-3 Minuten.
17. Stoppen Sie die Reaktion mit 15 mL HEPES-FBS und pipettieren Sie 4x-5x auf und ab. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles Röhrchen geeigneter Größe und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 250 x g , um die Zellen zu pelletieren.
18. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand vorsichtig abgesaugt. Lösen Sie das Zellpellet in 1 mL BLEAM-I auf, indem Sie es 5x-10x vorsichtig auf und ab pipettieren.
19. Zählen Sie die Zellen, um die Gesamtzahl und die Anzahl der lebenden Zellen zu bestimmen. Die Zellsuspension wird mit einem geeigneten Volumen BLEAM-I verdünnt, so dass die Endkonzentration 1 x 10⁵ lebende Zellen pro 100 μl Zellsuspension beträgt.

3. ALI-Kultur der nTAECs

HINWEIS: Zellkultureinsätze sollten mit 804G-konditionierten Medien beschichtet und vor dem nächsten Schritt mindestens 4 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert werden (siehe Schritt 1.2).

1. Nehmen Sie die 24-Well-Zellkulturplatte(n) mit den Zellkultureinsätzen aus dem Inkubator und entsorgen Sie das 804G-konditionierte Medium.
2. Geben Sie 1 ml BLEAM-I in die basolaterale (untere) Kammer jeder ALI-Vertiefung. 100 μl Zellsuspension (1 x 10⁵ Zellen) in die apikale Kammer der ALI-Zellkultureinsätze geben und die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren. Diese Phase ist definiert als ALI-Tag -2.
3. Am nächsten Tag wird das Medium in der basolateralen (1 ml) und apikalen (100 μl) Kammer mit frischem BLEAM-I gewechselt. Achten Sie beim Wechsel des Mediums in der apikalen Kammer darauf, die Zellmonoschicht nicht zu stören. Diese Phase ist definiert als ALI-Tag -1.
4. Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium sowohl aus der basolateralen als auch aus der apikalen Kammer.
   HINWEIS: Es dauert 2 Tage, bis die Zellen auf der Zellkulturmembran unter getauchten Bedingungen zusammenfließen. In dieser Phase kann ALI festgelegt werden.
5. Geben Sie 1 ml HBTEC-I-Medium in die basolaterale Kammer, aber lassen Sie das apikale Kammermedium frei und der Luft ausgesetzt. Diese Phase ist als ALI-Tag 0 definiert.
6. Tauschen Sie das HBTEC-I-Medium (1 mL) in der basolateralen Kammer weiterhin alle 48 h von ALI Tag 0 bis 6 aus. Wechseln Sie am ALI-Tag 7 bis zum gewünschten Erntezeitpunkt auf reguläre HBTEC-Medien (ohne Inhibitoren).
   HINWEIS: Während der ersten 7 Tage der ALI-Kultur können Medien aus der basolateralen Kammer in die apikale Kammer austreten. Dieses Medium muss jeden Tag sorgfältig abgesaugt werden, um die Gesundheit der Zellschicht zu erhalten und ihnen die Möglichkeit zu geben, sich zu differenzieren.
7. Entnahme von Zellen, Zellkultureinsätzen und basolateralen Medien zu unterschiedlichen Zeitpunkten für molekulare Techniken, Assays und Analysen.
   1. Für dieses Protokoll werden an den ALI-Tagen 0, 7 und 28 Zellen für die qPCR-Genexpressionsanalyse (Standardprotokoll des Herstellers) von epithelialen Differenzierungsmarkern entnommen. An den ALI-Tagen 0, 7, 14 und 28 werden Zellkultureinsätze zur Prüfung der Barrierefunktion entnommen (unten beschriebene Methoden).
   2. Verwenden Sie an den ALI-Tagen 0 und 28 formalinfixierte Zellkultureinsätze für die Immunfluoreszenzfärbung mit epithelialen Differenzierungsmarkern (unter Verwendung des zuvor veröffentlichten Protokolls)⁴⁹. Am ALI-Tag 14 werden basolaterale Medien für die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) (Standardprotokoll des Herstellers), Zelllysate für die qPCR von Markern für oxidativen Stress und Immunoblot mit Caspase-3- und gespaltenen Caspase-3-Antikörpern (Standardprotokoll des Herstellers) und Zellkultureinsätze für den Assay mit oxidativem Stress (unten beschriebene Methode) entnommen.

4. Testen der Barrierefunktion während der ALI-Differenzierung

1. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)
   HINWEIS: Messen Sie die TEER mit einem Epithel-Volt/Ohm-Messgerät (EVOM) während der ALI-Differenzierung, um die Integrität der Zellschicht⁵⁰ zu beurteilen.
   1. Verwenden Sie vor der Messung der Widerstandswerte des Testfilters eine 804G-konditionierte, medienbeschichtete Zellkultur (ohne Zellen), um den Hintergrundwiderstandswert in Ohm (Ω) zu messen
   2. Subtrahieren Sie den Hintergrundwiderstandswert von den Widerstandswerten des Testfilters und multiplizieren Sie die Differenz mit der Zellwachstumsfläche, um den TEER-Wert für jeden Testfilter zu erhalten.
      TEER = (Ω_T - Ω_B) X C
      TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand (^{Ω,cm 2})
      Ω_T = Widerstandswert des Prüffilters (Ω)
      Ω_B = Wert des Hintergrundwiderstands (Ω)
      C = Oberfläche des Zellwachstums (cm²)
      HINWEIS: Zellkultureinsätze, die für TEER-Messungen verwendet werden, werden anschließend mit 10 % gepuffertem Formalin fixiert und sofort für die Immunfluoreszenzfärbung und die Fluoreszenzmikroskopie (unten beschriebene Methode) verwendet oder für die spätere Färbung bei 4 °C gelagert.
2. Fluorescein Isethionat Dextran (FITC-dextran) Epithelpermeabilitätsassay
   HINWEIS: Der Epithelpermeabilitätstest wurde unter Verwendung von zwei verschiedenen Molekulargewichten von FITC-Dextran (10 kD und 20 kD) während der ALI-Differenzierung durchgeführt.
   1. Bereiten Sie die FITC-Dextran-Arbeitslösung (1 mg/ml) vor: Messen Sie 5 mg FITC und mischen Sie 1 ml DMSO (5 mg/ml) ein. Resuspendieren Sie 5 mg/ml-Stammmaterial in HBTEC-Medien, die auf 37 °C auf eine Konzentration von 1 mg/ml erwärmt wurden. Schützen Sie die Lösung vor Licht.
   2. Übertragen Sie die Testfilter (mit Zellen) auf eine neue 12-Well-Platte und geben Sie 1 ml HBTEC-Medium in das basolaterale Fach.
   3. Aspirieren Sie das apikale Kompartimentmedium (falls vorhanden) und ersetzen Sie es durch 250 μl FITC-Dextran-Arbeitslösung. Bei Raumtemperatur und Lichtschutz 60 min inkubieren.
   4. Beenden Sie den FITC-Dextran-Assay, indem Sie die Testfilter (mit der FITC-Dextran-Arbeitslösung) von der 12-Well-Platte entfernen.
   5. Sammeln Sie das basolaterale Medium von der 12-Well-Platte in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es auf.
   6. Übertragen Sie 100 μl Aliquote aus jedem Röhrchen in dreifacher Ausführung auf eine 96-Well-Mikroplatte aus schwarzem Polystyrol mit klarem Boden. Übertragen Sie 100 μl HBTEC-Medien in zusätzliche Wells in der 96-Well-Platte als Negativkontrolle zur Messung der Hintergrundfluoreszenz.
   7. Messen Sie die Fluoreszenzintensität mit einem Spektralphotometer mit 490 nm Anregung und 520 nm Emissionsmaxima.
   8. Subtrahieren Sie den durchschnittlichen Hintergrundfluoreszenzwert von den Fluoreszenzwerten des Testfilters, um eine korrigierte Fluoreszenz zu erhalten, und drücken Sie die Werte in Prozent gegen die korrigierten Fluoreszenzwerte am ALI-Tag 0 für FITC 10 kD und 20 kD aus.

5. Hyperoxie-Exposition mit dem TriGas-Inkubator

1. Bestimmen Sie am ALI-Tag 7 die Anzahl der Zellkultureinsätze, die in Hyperoxie gesetzt werden sollen, basierend auf den Versuchs- und Ernteanforderungen.
2. Stellen Sie den O_2-Pegel im TriGas-Inkubator auf 60 % O₂ ein. In der Regel dauert es ~30-45 Minuten, bis der O_2-Pegel 60 % erreicht.
3. Sobald sich der_O2-Spiegel bei 60 % stabilisiert hat, legen Sie die 24-Well-Zellkulturplatte mit den Zellkultureinsätzen, die der Hyperoxiegruppe zugeordnet sind, in den Inkubator und schließen Sie die Inkubatortür.
   HINWEIS: Dieser Schritt muss so effizient wie möglich durchgeführt werden, um ein signifikantes Absinken des O_2-Spiegels im Inkubator zu verhindern.
4. Wechseln Sie das Medium in den Hyperoxie-exponierten Zellkultureinsätzen nach dem gleichen Schema wie in den Kontrollvertiefungen (21 % O₂ exponiert). Überprüfen Sie die Zellkultureinsätze täglich auf Leckagen und saugen Sie Leckagen vorsichtig in die Zellkulturkammer ab.
5. Setzen Sie die Hyperoxie-Exposition 7 Tage lang fort (ALI-Tage 7 bis 14). Sobald die Hyperoxie-Exposition abgeschlossen ist, entnehmen Sie Zellen oder führen Sie Assays mit Zellkultureinsätzen am ALI-Tag 14 durch.

6. Oxidativer Stress-Assay zur Beurteilung der Auswirkungen von Hyperoxie

HINWEIS: Wir verwendeten das CM-H2DCFDA-Assay-Kit und maßen die Fluoreszenzintensität am ALI-Tag 14 als Marker für oxidativen Stress in Zellkultureinsätzen nach_{O2-Exposition} . H₂DCFDA ist eine chemisch reduzierte und acetylierte Form von 2′,7′-Dichlorfluorescein (DCF), das ein lebendzellgenauer Indikator für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) ist. CM-H₂DCFDA ist das Thiol-reaktive Chlormethylderivat von H₂DCFDA, das eine weitere kovalente Bindung an intrazelluläre Komponenten fördert und eine längere Retention des Farbstoffs in der Zelle ermöglicht. Diese Moleküle sind nicht fluoreszierend, bis die Acetatgruppen durch die Einwirkung intrazellulärer Esterasen entfernt werden und die Oxidation in der Zelle^{stattfindet 51}. Nach intrazellulärer Oxidation kann die resultierende Zunahme der Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop als Surrogatmaß für zellulären oxidativen Stress gemessen werden⁵². Das Reagenz ist leicht und luftempfindlich und muss daher vor Licht geschützt und möglichst luftdicht gehalten werden.

1. Herstellung der CM-H2DCFDA-Assay-Lösung: Jedes Fläschchen enthält 50 μg Reagenzfarbstoff in Pulverform. Um eine 1 mM Stammlösung herzustellen, geben Sie 80 μl steriles DMSO in die Durchstechflasche, mischen Sie es gut mit einer Pipette und wirbeln Sie es vorsichtig auf. Für eine Endkonzentration von 1 μM des Farbstoffs in Zellkultureinsätzen fügen Sie 0,1 μl des 1 mM Stammmaterials pro 100 μl PBS hinzu (z. B. fügen Sie 0,6 μl Stammlösung zu 600 μl PBS für 6 Zellkultureinsätze hinzu).
   HINWEIS: Die Endkonzentration des Farbstoffs kann zwischen 1-5 μM variieren. Die Dosis muss für jede Kulturbedingung optimiert werden.
2. Geben Sie 100 μl der 1 μM Farbstofflösung in jede Zellkultur sowohl für die Hyperoxie- als auch für die Normoxie-exponierte Gruppe. Verwenden Sie mindestens 1 Zellkultur als Negativkontrolle aus jeder Behandlungsgruppe (100 μl PBS ohne Farbstoff). Bei 37 °C 30 min lichtgeschützt inkubieren. 1x mit PBS waschen.
3. Vorbereitung der Objektträger: Überschüssiges PBS abtropfen lassen. Halten Sie die Zellkultureinsätze vorsichtig fest und schneiden Sie mit einer Klinge langsam die Zellkulturmembran heraus. Gießen Sie 1-2 Tropfen Eindeckflüssigkeit auf den Objektträger. Halten Sie mit einer Pinzette mit flacher Spitze vorsichtig die Ecke der Membran fest, legen Sie sie mit der Zellseite nach unten auf das Eindeckmittel und decken Sie sie mit einem Deckglas ab. Überschüssige Eindeckflüssigkeit entfernen und 15 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt an der Luft trocknen lassen. Die Folien können nun bebildert werden.
   HINWEIS: Die Vorbereitung des Objektträgers und die Fluoreszenzmikroskopie sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, da die Fluoreszenzintensität im Laufe von 2-3 h deutlich nachlässt.
4. Fluoreszenzmikroskopie: Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Cy2-Kanals (Cyanin-2) auf. Nehmen Sie Bilder von drei separaten, nicht überlappenden Bereichen pro Zellkultur auf.
5. Fluoreszenzdetektion von oxidativem Stress
   HINWEIS: Verwenden Sie die Bilder aus der Fluoreszenzmikroskopie, um die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) mit der ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/ij/) und dem unten beschriebenen Arbeitsablauf zu messen. CTCF dient als Marker für oxidativen Stress in den Zellkultureinsätzen nach Hyperoxie-Exposition und wird durch Eliminierung der Hintergrundfluoreszenz mit Hilfe der ImageJ-Software gemessen.
   1. Öffnen Sie das Mikroskopiebild in ImageJ und wählen Sie den gewünschten Bereich mit dem Rechteckwerkzeug aus. Speichern Sie den Auswahlbereich (α), indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und wählen Sie Zum ROI-Manager (Region of Interest) hinzufügen aus. Verwenden Sie diesen Auswahlbereich für alle Bilder.
   2. Wählen Sie die Parameter für die Messung unter Analysieren > Messungen einstellen aus und wählen Sie auf der Registerkarte Einstellungen Fläche, Integrierte Dichte und Mittlerer Grauwert aus.
   3. Verwenden Sie für jedes Bild denselben Auswahlbereich aus dem ROI-Manager und wählen Sie Analysieren > Messen. Der integrierte Dichtewert stellt die Gesamtfluoreszenz (F_t) des ausgewählten Bereichs dar. Notieren Sie sich die Messwerte im Popup-Fenster.
   4. Um die Hintergrundfluoreszenz (F_b) in jedem Bild zu korrigieren, wählen Sie mit dem Rechteckwerkzeug einen kleinen Bereich eines nicht fluoreszierenden Bereichs aus. Wählen Sie Analysieren > Messen für diesen Bereich aus. Der mittlere Intensitätswert stellt F_b dar. Notieren Sie sich die Messwerte im Popup-Fenster.
   5. Berechnen Sie den CTCF, indem Sie die mittlere Fluoreszenzintensität der Hintergrundmesswerte mit der Gesamtfläche des ROI multiplizieren und diese Zahl vom integrierten Dichtewert des ROI subtrahieren. Wiederholen Sie diesen Arbeitsablauf für alle Bilder für beide Behandlungsgruppen (Kontrolle und Hyperoxie).
      CTCF = F_t - (F_b x α)
      CTCF = Korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (A.U.)
      F_t = Gesamtfluoreszenz
      F_b = Hintergrundfluoreszenz
      α = Auswahlbereich

Um nTAECs zu isolieren, sammelten wir tracheale Aspiraten von intubierten Neugeborenen auf der Neugeborenen-Intensivstation und transportierten die Aspirate auf Eis zur weiteren Verarbeitung ins Labor (Abbildung 1A). Nach der Aussaat der Trachealaspiratproben in epithelialem Wachstumsmedium der Atemwege (BLEAM-I mit Rho/Smad-, GSK3- und mTOR-Inhibitoren) erschienen quaderförmige Zellen innerhalb von 7-10 Tagen. Nach 14 Tage...

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Entnahme und Verarbeitung von neonatalen Trachealaspiratproben von intubierten Neugeborenen auf der Neugeborenen-Intensivstation mit anschließender Isolierung und Expansion von lebenden nTAECs aus diesen Proben unter Verwendung zuvor etablierter Methoden³⁹. Darüber hinaus haben wir eine Methode zur Kultivierung von nTAECs auf ALI beschrieben und ihre Differenzierung in ein polarisiertes mukoziliäres A...

Die Autoren haben nichts offenzulegen und keine Interessenkonflikte zu melden.

Diese Arbeit wird durch die Finanzierung durch die Presbyterian Health Foundation (PHF) und Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 mit einem Institutional Development Award (IDeA) von NIGMS) an die AG unterstützt. Wir danken Dr. Paul LeRou und Dr. Xingbin Ai vom Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, für die Bereitstellung von Spenderzellen für Neugeborene, die in einigen der Experimente verwendet wurden. Die Figuren wurden mit Biorender erstellt. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism durchgeführt.