Modèle translationnel de culture cellulaire 3D pour évaluer les effets de l’hyperoxie sur les cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales humaines

Nous décrivons un protocole pour établir un modèle de culture d’interface air-liquide (ALI) utilisant des cellules épithéliales des voies respiratoires trachéales néonatales (nTAEC) et effectuons une exposition à l’hyperoxie physiologiquement pertinente pour étudier l’effet du stress oxydatif induit par l’atmosphère sur les cellules dérivées de l’épithélium de surface des voies respiratoires néonatales en développement.

L’épithélium des voies respiratoires du nouveau-né prématuré est constamment exposé à des facteurs de stress environnementaux. L’un de ces facteurs de stress chez les nouveau-nés atteints d’une maladie pulmonaire comprend une tension d’oxygène (O₂) supérieure à celle de l’atmosphère ambiante - appelée hyperoxie (>21 % O₂). L’effet de l’hyperoxie sur les voies respiratoires dépend de divers facteurs, notamment du stade de développement des voies respiratoires, du degré d’hyperoxie et de la durée de l’exposition, les expositions variables pouvant conduire à des phénotypes uniques. Bien qu’il y ait eu des recherches approfondies sur l’effet de l’hyperoxie sur l’alvéolarisation pulmonaire néonatale et l’hyperréactivité des voies respiratoires, on sait peu de choses sur l’effet sous-jacent à court et à long terme de l’hyperoxie sur les cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales humaines. L’une des principales raisons à cela est la rareté d’un modèle in vitro efficace pour étudier le développement et la fonction épithéliales des voies respiratoires néonatales humaines. Ici, nous décrivons une méthode d’isolement et d’expansion des cellules épithéliales des voies respiratoires trachéales néonatales humaines (nTAEC) en utilisant des aspirations trachéales néonatales humaines et en cultivant ces cellules en culture d’interface air-liquide (ALI). Nous démontrons que les nTAECs forment une monocouche cellulaire polarisée mature en culture ALI et subissent une différenciation mucociliaire. Nous présentons également une méthode d’exposition modérée à l’hyperoxie de la monocouche cellulaire dans la culture d’ALI à l’aide d’un incubateur spécialisé. De plus, nous décrivons un test pour mesurer le stress oxydatif cellulaire après une exposition à l’hyperoxie dans une culture ALI en utilisant la quantification fluorescente, ce qui confirme qu’une exposition modérée à l’hyperoxie induit un stress oxydatif cellulaire mais ne provoque pas de dommages significatifs à la membrane cellulaire ou d’apoptose. Ce modèle peut potentiellement être utilisé pour simuler l’exposition à l’hyperoxie cliniquement pertinente rencontrée par les voies respiratoires néonatales dans l’unité de soins intensifs néonatals (USIN) et utilisé pour étudier les effets à court et à long terme de l’O₂ sur la programmation épithéliale des voies respiratoires néonatales. Des études utilisant ce modèle pourraient être utilisées pour explorer des moyens d’atténuer les lésions oxydatives précoces des voies respiratoires en développement, qui sont impliquées dans le développement de maladies des voies respiratoires à long terme chez les anciens nourrissons prématurés.

L’oxygène thérapeutique (_O2) est l’une des thérapies les plus utilisées dans l’unité de soins intensifs néonatals (USIN⁾¹. Par conséquent, l’exposition à l’hyperoxie (>21 % d’O2) est un facteur de stress atmosphérique courant rencontré par les nouveau-nés avec et sans maladie pulmonaire importante. Les réponses pulmonaires à l’hyperoxie peuvent varier en fonction de l’intensité et/ou de la durée de l’exposition et de l’emplacement anatomique, du type de cellule et du stade de développement pulmonaire 2,3,4,5,6. La majeure partie de la recherche sur les lésions pulmonaires liées à l’hyperoxie néonatale a porté sur l’effet de l’exposition à l’hyperoxie dans le contexte de l’alvéolarisation postnatale pour modéliser la dysplasie bronchopulmonaire (DBP) - la maladie pulmonaire chronique la plus courante affectant les prématurés 6,7,8,9,10,11. La gravité du TPL est classée en fonction de la quantité d’assistance respiratoire et de l’O2 nécessaire à 36 semaines ^{après la} menstruation. La plupart des bébés atteints de DBP s’améliorent cliniquement au fil du temps à mesure que les poumons continuent de se développer, la majorité d’entre eux se sevrant de la soutien respiratoire avant leur premier anniversaire^12,13. Quelle que soit la gravité de la DBP après la naissance, les morbidités importantes qui affectent les anciens bébés prématurés comprennent un risque 5 fois plus élevé de respiration sifflante préscolaire, d’asthme, d’infections respiratoires récurrentes tout au long de l’enfance et de bronchopneumopathie chronique obstructive précoce 12,14,15,16,17,18,19. L’effet de l’hyperoxie sur les maladies des voies respiratoires à long terme et les infections pulmonaires chez les nouveau-nés prématurés a été étudié à l’aide de modèles animaux in vitro et in vivo 20,21,22,23,24. Cependant, la plupart de ces modèles se sont concentrés sur le rôle du tissu mésenchymateux, de l’épithélium alvéolaire et du muscle lisse des voies respiratoires 25,26,27,28.

L’épithélium de surface des voies respiratoires borde tout le trajet du système respiratoire, s’étendant de la trachée jusqu’à la bronchiole terminale, se terminant juste avant le niveau des alvéoles²⁹. Les cellules basales des voies respiratoires sont les cellules souches primaires de l’épithélium des voies respiratoires, avec la capacité de se différencier dans l’ensemble du répertoire des lignées épithéliales matures des voies respiratoires, qui comprend les cellules ciliées et sécrétoires (cellules club : non productrices de mucus et cellules caliciformes : productrices de mucus⁾29,30,31,32. Les études de culture cellulaire dans le contexte des lésions pulmonaires hyperoxiques néonatales ont principalement utilisé des lignées cellulaires cancéreuses adultes, humaines ou murines^33,34. De plus, la plupart des expériences in vitro ont utilisé des systèmes de culture submergés, qui ne permettent pas la différenciation des cellules en un épithélium des voies respiratoires mucociliaire ressemblant à l’épithélium des voies respiratoires in vivo chez l’homme³⁵. Par conséquent, il existe un manque de connaissances concernant les effets des lésions pulmonaires induites par l’hyperoxie sur le développement des cellules épithéliales des voies respiratoires des nouveau-nés humains. L’une des raisons est la rareté des modèles translationnels pour étudier les effets de l’exposition atmosphérique sur l’épithélium néonatal des voies respiratoires humaines. Les lésions pulmonaires hyperoxiques au début de la vie peuvent entraîner une maladie des voies respiratoires à long terme et un risque accru d’infection, entraînant des conséquences qui changent la vie des anciens prématurés 14,36,37. Chez les nourrissons non survivants atteints d’une DBP sévère, l’épithélium de surface des voies respiratoires présente des anomalies distinctes, notamment une hyperplasie des cellules caliciformes et un développement ciliaire désordonné, indiquant une clairance mucociliaire anormale et une augmentation de la hauteur épithéliale compromettant le calibre des voies respiratoires³⁸. Au cours de la dernière décennie, on s’est intéressé de plus en plus à la culture de cellules épithéliales primaires des voies respiratoires à l’interface air-liquide (ALI) pour étudier le développement épithélial postnatal des voies respiratoires 39,40,41,42. Cependant, les modèles ALI de cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales n’ont pas été utilisés dans le contexte des modèles de perturbation redox atmosphérique tels que l’exposition à l’hyperoxie.

À l’aide d’une méthode précédemment publiée³⁹, nous avons utilisé des échantillons d’aspiration trachéale néonatale obtenus à partir de nouveau-nés intubés dans l’unité de soins intensifs néonatals et avons réussi à isoler et à élargir les cellules épithéliales trachéales néonatales primaires (nTAEC). Nous avons utilisé des inhibiteurs de la signalisation Rho, Smad, Glycogen synthase kinase (GSK3) et de la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) pour augmenter la capacité d’expansion et retarder la sénescence dans ces cellules, comme décrit précédemment^39,42, ce qui permet un passage efficace et plus tardif des nTAECs. Le protocole décrit les méthodes d’établissement de cultures ALI 3D à l’aide de nTAECs et d’exposition à l’hyperoxie sur les monocouches de nTAEC. L’inhibition de Rho et Smad est utilisée pendant les 7 premiers jours de la culture de l’ALI (jours 0 à 7 de l’ALI), après quoi ces inhibiteurs sont retirés du milieu de différenciation pour le reste de la durée de la culture de l’ALI. La surface apicale de la monocouche de cellules épithéliales des voies respiratoires cultivée par l’ALI reste exposée à l’environnement⁴³, ce qui permet d’étudier les perturbations atmosphériques et ressemble beaucoup à la pathobiologie d’une voie respiratoire néonatale en développement exposée à l’hyperoxie in vivo. La concentration d’O₂ utilisée dans les études antérieures sur les cultures cellulaires (qu’il s’agisse de cellules immortalisées ou primaires) de lésions pulmonaires hyperoxiques néonatales varie considérablement (allant de 40 % à 95 %), de même que la durée de l’exposition (allant de 15 minutes à 10 jours)36,44,45,46,47. Pour cette étude, la monocouche de cellules ALI a été exposée à 60 %_d’O2 pendant 7 jours du 7e au 14e jour de l’ALI (après élimination des inhibiteurs de Rho/Smad du milieu de différenciation). L’exposition à l’hyperoxie a été réalisée au cours de la phase précoce-intermédiaire de la différenciation mucociliaire (jours 7 à 14 de l’ALI), par opposition à l’épithélium mature entièrement différencié, et simule ainsi le développement in vivo de l’épithélium des voies respiratoires chez les nouveau-nés prématurés. Cette stratégie d’exposition minimise le risque de toxicité aiguë de l’O2 (qui est attendu avec des concentrations plus élevées d’O2) tout en exerçant un stress oxydatif dans une plage physiologiquement pertinente et ressemble à la fenêtre critique de transition d’un environnement intra-utérin relativement hypoxique à un environnement externe hyperoxique chez les nouveau-nés humains prématurés.

Les échantillons néonatals d’aspiration trachéale n’ont été prélevés qu’après le consentement éclairé des parents, et le protocole utilisé pour la collecte, le transport et le stockage a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma (IRB 14377).

1. Préparation à l’isolement, au passage et à la culture ALI de nTAEC

1. Préparation des milieux
   1. Milieu des voies respiratoires épithéliales bronchiques (BLEAM) avec inhibiteurs (BLEAM-I) : Préparez 500 mL (1 flacon, conservé à 4 °C) de BLEAM en ajoutant 1,25 mL de supplément HLL (500 μg/mL d’albumine sérique humaine, 0,6 μM d’acide linoléique, 0,6 μg/mL de lécithine), 15 mL de L-Glutamine (6 mM), 2 mL d’extrait P (0,4 %, extrait hypophysaire bovin), 5 mL de TM1 (1 μM d’épinéphrine, 5 μg/mL de transferrine, 10 nM de triiodothyronine, 0,1 μg/mL d’hydrocortisone, 5 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF), 5 ng/mL d’insuline), 1 mL de solution d’antibiotique (Normocin, 0,1 mg/mL). Pour prévenir la sénescence des cellules primaires et améliorer l’efficacité de l’expansion, ajoutez les inhibiteurs du facteur de croissance suivants, comme décrit précédemment³⁹ : Y-27632 (protéine kinase associée à Rho ou inhibiteur de ROCK) avec une concentration finale de 5 μM, A83-01 (inhibe la signalisation Smad) avec une concentration finale de 1 μM, CHIR 99021 (inhibiteur de la glycogène synthase kinase-3 ou inhibiteur de GSK3) avec une concentration finale de 0,4 μM et Rapamycine (inhibiteur de la cible moléculaire de la rapamycine ou mTOR) avec une concentration finale concentration de 5 nM. Filtrez le média à travers un filtre de la taille des pores de 0,22 μm. Reportez-vous au Tableau 1 pour obtenir la liste des composants du support.
   2. Milieu ALI à cellules épithéliales bronchiques/trachéales humaines (HBTEC) : Préparez 500 ml de milieu HBTEC en décongelant le flacon à 37 °C et en ajoutant 1 ml de solution d’antibiotique (Normocin, 0,1 mg/mL). Une fois ajouté, filtrez le média à travers un filtre de la taille d’un pore de 0,22 μm.
   3. Milieu HBTEC avec inhibiteurs (HBTEC-I) : Préparez le milieu HBTEC comme ci-dessus. Avant de filtrer, ajoutez les inhibiteurs suivants : Y-27632 avec une concentration finale de 5 μM et A83-01 avec une concentration finale de 0,5 μM. Filtrez le média à travers un filtre de la taille d’un pore de 0,22 μm.
      REMARQUE : Conservez les milieux BLEAM-I, HBTEC et HBTEC-I à 4 °C, datés et étiquetés, dans l’obscurité (enveloppés dans du papier d’aluminium) et ne réchauffez que les aliquotes de ce qui est nécessaire (la durée de conservation est de 30 jours).
   4. HEPES/FBS : Ajouter 500 mL de solution saline tamponnée HEPES et 88 mL de FBS (la concentration finale est de 15 %). Une fois ajoutée, filtrez la solution à travers un filtre de la taille d’un pore de 0,22 μm et conservez-la à 4 °C, daté et étiqueté.
      REMARQUE : Aliquote et BLEAM CHAUD, HEPES-FBS et Trypsine-EDTA à 37 °C (au moins 30 min) avant utilisation.
2. Enrobage des flacons de culture et des inserts de culture cellulaire ALI avec un milieu conditionné 804G
   1. Préparez des milieux conditionnés matriciels à base de cellules 804G (lignée de cellules épithéliales de la vessie de rat) comme décrit précédemment³⁹.
   2. Enduire le ballon de culture cellulaire et les inserts de culture cellulaire avec un milieu conditionné 804G pendant au moins 4 h dans l’incubateur à 37 °C, avec 5 % de CO₂. Voir le tableau 2 pour connaître les quantités de milieu nécessaires pour enduire les différents flacons de culture et inserts de culture cellulaire.

2. Isolement et expansion des nTAECs et préparation à la culture ultérieure de l’ALI

1. Prélever une aspiration trachéale fraîche (environ 1 ml) lors de l’aspiration régulière de la sonde endotrachéale des nouveau-nés intubés et recueillir l’aspiration dans un piège à mucus. Si le volume d’aspiration est insuffisant pour atteindre le piège à mucus, rincez le cathéter d’aspiration avec 1 à 3 ml de solution saline stérile.
2. Étiquetez l’échantillon et rangez-le dans un sac à risque biologique sur de la glace.
   REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés sur de la glace à 4 °C pendant un maximum de 24 h. Cependant, le rendement est plus élevé avec des échantillons frais.
3. Transporter l’échantillon de l’USIN au laboratoire. Enduire un flacon T25 d’un milieu conditionné au 804G et préparer l’inoculation de l’échantillon au moment du transport de l’aspiration trachéale au laboratoire.
4. Retirez le piège à mucus du sac à matières biodangereuses et nettoyez soigneusement les surfaces extérieures avec de l’éthanol à 70 % pour éviter toute contamination. Ouvrez avec précaution le capuchon du piège à mucus sous un capot stérile de culture cellulaire.
5. Diluez l’échantillon d’aspiration trachéale avec du PBS stérile à 5 mL (pour diluer le mucus) et transférez tout le contenu dans un tube conique de 50 mL.
6. Centrifugez le tube à 250 x g, 20 °C-23 °C pendant 5 min, et jetez le surnageant (y compris le mucus).
   REMARQUE : Toutes les centrifugations ici sont effectuées à 250 x g, 20 °C-23 °C pendant 5 min, sauf indication contraire.
7. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de BLEAM-I.
8. Retirez le ballon T25 de l’incubateur et jetez le milieu conditionné 804G avant de plaquer l’échantillon.
9. Plaquez l’échantillon dans la fiole T25 et placez-le dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ (on parlera de passage 0 ou P0).
10. Changez le média avec BLEAM-I 24 h après le placage pour laver les cellules non attachées, puis toutes les 48 h.
    REMARQUE : Après le traitement de l’échantillon d’aspiration trachéale et son incubation dans le milieu BLEAM-I, des cellules de forme cuboïde apparaissent 7 à 10 jours après le placage. Environ 3 semaines après le placage, les cellules sont densément tassées et nécessitent une trypsinisation pour le passage, l’expansion et le stockage ultérieurs. Les cellules à passage précoce (P1 - P2) sont placées dans des cryotubes (2,5 x 10⁶ cellules par 500 μL de milieu de congélation par cryotube) et stockées dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
11. Décongelez rapidement les cellules congelées de l’azote liquide dans un bain d’eau à 37 °C et transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de taille appropriée contenant du BLEAM-I.
12. Comptez les cellules pour déterminer le nombre total et le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un colorant au bleu trypan et d’un compteur de cellules automatisé ou manuel, comme décrit précédemment⁴⁸. Diluer la suspension cellulaire avec un volume approprié de BLEAM-I, de sorte que la concentration finale soit de 2,1 x 10⁶ cellules dans 15 mL de suspension cellulaire (pour la fiole T75).
    REMARQUE : Pour une fiole T25, on utilise généralement 0,7 x 10⁶ cellules dans 5 mL de suspension cellulaire pour l’ensemencement.
13. Transvaser la suspension cellulaire de 15 mL dans une fiole T75 et incuber toute la nuit à 37 °C, 5 % de CO₂.
14. Le lendemain matin, échangez le média avec le nouveau BLEAM-I. Ensuite, remplacez le support par un nouveau BLEAM-I tous les 2 jours. Une fois que les cellules sont d’environ 80 à 90 %, elles sont prêtes à être trypsinisées pour la culture ALI.
15. Appliquer 5 mL de trypsine-EDTA (T75) sur la monocouche cellulaire.
    REMARQUE : N’oubliez pas d’utiliser de la trypsine fraîche. Évitez d’utiliser de la trypsine qui a été chauffée plusieurs fois.
16. Incuber le ballon à 37 °C pendant 5 min dans l’incubateur. Ensuite, tapotez le côté de la fiole 8x-10x pour déloger les cellules. Vérifiez au microscope pour confirmer que les cellules ont été délogées après la trypsinisation. Si >50 % des cellules restent sur le ballon, laver avec du PBS 2x et répéter l’étape de trypsinisation avec un temps d’incubation réduit de 2 à 3 minutes.
17. Arrêtez la réaction avec 15 ml de HEPES-FBS et pipetez de haut en bas 4x-5x. Transférez les cellules dans un tube stérile de taille appropriée et centrifugez à 250 x g pendant 5 min pour granuler les cellules.
18. Après la centrifugation, aspirez soigneusement le surnageant. Dissoudre la pastille cellulaire dans 1 mL de BLEAM-I en pipetant doucement de haut en bas 5x-10x.
19. Comptez les cellules pour déterminer le nombre total et le nombre de cellules vivantes. Diluer la suspension cellulaire avec un volume approprié de BLEAM-I, de sorte que la concentration finale soit de 1 x 10⁵ cellules vivantes pour 100 μl de suspension cellulaire.

3. Culture ALI des nTAEC

REMARQUE : Les inserts de culture cellulaire doivent être recouverts d’un milieu conditionné au 804G et incubés pendant au moins 4 h à 37 °C, 5 % de CO₂ avant l’étape suivante (voir étape 1.2).

1. Retirez de l’incubateur la ou les plaques de culture cellulaire à 24 puits contenant les inserts de culture cellulaire et jetez le milieu conditionné au 804G.
2. Ajouter 1 mL de BLEAM-I dans la chambre basolatérale (inférieure) de chaque puits ALI. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire (1 x 10⁵ cellules) dans la chambre apicale des inserts de culture cellulaire ALI et incuber les cellules à 37 °C, 5 % CO₂. Cette étape est définie comme le jour ALI -2.
3. Le lendemain, changer le milieu dans les chambres basolatérale (1 mL) et apicale (100 μL) avec du BLEAM-I frais. Lors du changement de média dans la chambre apicale, veillez à ne pas perturber la monocouche cellulaire. Cette étape est définie comme le jour ALI -1.
4. Le lendemain, retirez le milieu des chambres basolatérale et apicale.
   REMARQUE : Il faut 2 jours pour que les cellules de la membrane de culture cellulaire deviennent confluentes dans des conditions immergées. À ce stade, l’ALI peut être établie.
5. Ajouter 1 mL de média HBTEC-I dans la chambre basolatérale, mais laisser le média de la chambre apicale libre et exposé à l’air. Cette étape est définie comme le jour 0 de l’ALI.
6. Continuez à remplacer le milieu HBTEC-I (1 ml) dans la chambre basolatérale toutes les 48 heures du jour 0 à 6 de l’ALI. Passer à un substrat HBTEC régulier (sans inhibiteurs) le jour 7 de l’ALI jusqu’au moment désiré de la récolte.
   REMARQUE : Au cours des 7 premiers jours de la culture de l’ALI, les milieux de la chambre basolatérale peuvent s’infiltrer dans la chambre apicale. Ce milieu doit être aspiré soigneusement chaque jour pour maintenir la santé de la couche cellulaire et lui permettre de se différencier.
7. Récoltez des cellules, des inserts de culture cellulaire et des milieux basolatéraux à différents moments pour des techniques moléculaires, des tests et des analyses.
   1. Pour ce protocole, les jours 0, 7 et 28 de l’ALI, récolter des cellules pour l’analyse de l’expression génique qPCR (protocole standard du fabricant) des marqueurs de différenciation épithéliale. Les jours 0, 7, 14 et 28 de l’ALI, prélever des inserts de culture cellulaire pour tester la fonction barrière (méthodes décrites ci-dessous).
   2. Les jours 0 et 28 de l’ALI, utiliser des inserts de culture cellulaire fixés au formol pour la coloration immunofluorescente avec des marqueurs de différenciation épithéliale (en utilisant le protocole précédemment publié)⁴⁹. Le 14e jour de l’ALI, récolter les milieux basolatéraux pour la libération de lactate déshydrogénase (LDH) (protocole standard du fabricant), les lysats cellulaires pour la qPCR des marqueurs de stress oxydatif, l’immunotransfert avec des anticorps caspase-3 et la caspase-3 clivée (protocole standard du fabricant), et des inserts de culture cellulaire pour le dosage du stress oxydatif (méthode décrite ci-dessous).

4. Test de la fonction barrière lors de la différenciation ALI

1. Mesure de la résistance électrique trans-épithéliale (TEER)
   REMARQUE : Mesurer TEER à l’aide d’un voltmètre/ohmmètre épithélial (EVOM) pendant la différenciation ALI pour évaluer l’intégrité de la couche cellulaire⁵⁰.
   1. Avant de mesurer les valeurs de résistance du filtre de test, utilisez une culture cellulaire enrobée d’un média conditionné 804G (dépourvue de toute cellule) pour mesurer la valeur de résistance de fond en Ohms (Ω)
   2. Soustrayez la valeur de résistance de fond des valeurs de résistance du filtre d’essai et multipliez la différence par la surface de croissance cellulaire pour obtenir la valeur TEER pour chaque filtre d’essai.
      FEER = (Ω_T - Ω_B) X C
      TEER = Résistance électrique trans-épithéliale (Ω,cm²)
      Ω_T = Valeur de résistance du filtre d’essai (Ω)
      Ω_B = Valeur de résistance d’arrière-plan (Ω)
      C = Surface de croissance cellulaire (cm²)
      REMARQUE : Les inserts de culture cellulaire utilisés pour les mesures TEER sont ensuite fixés avec du formol tamponné à 10 % et utilisés immédiatement pour la coloration immunofluorescente et la microscopie fluorescente (méthode décrite ci-dessous) ou stockés à 4 °C pour une coloration ultérieure.
2. Dosage de la perméabilité épithéliale de l’iséthionate de fluorescéine dextran (FITC-dextran)
   REMARQUE : Le test de perméabilité épithéliale a été réalisé en utilisant deux poids moléculaires différents de FITC-dextran (10 kD et 20 kD) lors de la différenciation ALI.
   1. Préparez la solution de travail FITC-dextran (1 mg/mL) : mesurez 5 mg de FITC et mélangez 1 mL de DMSO (5 mg/mL). Mettre à nouveau en suspension 5 mg/mL dans un milieu HBTEC chauffé à 37 °C à une concentration de 1 mg/mL. Protégez la solution de la lumière.
   2. Transférez les filtres d’essai (contenant des cellules) dans une nouvelle plaque à 12 puits et ajoutez 1 mL de média HBTEC dans le compartiment basolatéral.
   3. Aspirer le milieu du compartiment apical (le cas échéant) et le remplacer par 250 μL de solution de travail FITC-dextran. Incuber à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 60 min.
   4. Terminez le test FITC-dextran en retirant les filtres d’essai (contenant la solution de travail FITC-dextran) de la plaque à 12 puits.
   5. Prélever le milieu basolatéral de la plaque à 12 puits dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et un vortex.
   6. Transférez 100 μL d’aliquotes de chaque tube dans une microplaque de polystyrène noir à fond transparent de 96 puits en trois exemplaires. Transférez 100 μL de milieu HBTEC vers des puits supplémentaires dans la plaque de 96 puits comme contrôle négatif pour mesurer la fluorescence de fond.
   7. Mesurez l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un spectrophotomètre en utilisant des maxima d’excitation de 490 nm et d’émission de 520 nm.
   8. Soustraire la valeur moyenne de fluorescence de fond des valeurs de fluorescence du filtre d’essai pour obtenir la fluorescence corrigée et exprimer les valeurs en pourcentage par rapport aux valeurs de fluorescence corrigées au jour 0 de l’ALI pour les CTFI de 10 kD et 20 kD.

5. Exposition à l’hyperoxie à l’aide de l’incubateur TriGas

1. Le jour 7 de l’ALI, déterminer le nombre d’inserts de culture cellulaire à mettre en hyperoxie en fonction des besoins expérimentaux et de récolte.
2. Réglez le niveau O₂ dans l’incubateur TriGas à 60 % O₂. Il faut généralement ~30-45 min pour que le niveau O₂ atteigne 60 %.
3. Une fois que le niveau O₂ se stabilise à 60 %, placez la plaque de culture cellulaire à 24 puits avec les inserts de culture cellulaire attribués au groupe d’hyperoxie à l’intérieur de l’incubateur et fermez la porte de l’incubateur.
   REMARQUE : Cette étape doit être réalisée le plus efficacement possible pour éviter une baisse significative du niveau de O₂ à l’intérieur de l’incubateur.
4. Changer le milieu dans les inserts de culture cellulaire exposés à l’hyperoxie en suivant le même schéma que les puits témoins (21 % d’O₂ exposés). Vérifiez tous les jours que les inserts de culture cellulaire ne présentent pas de fuite et aspirez doucement toute fuite dans la chambre de culture cellulaire.
5. Poursuivre l’exposition à l’hyperoxie pendant 7 jours (jours 7 à 14 de l’ALI). Une fois l’exposition à l’hyperoxie terminée, prélever des cellules ou effectuer des tests à l’aide d’inserts de culture cellulaire le 14e jour de l’ALI.

6. Test de stress oxydatif pour évaluer les effets de l’hyperoxie

REMARQUE : Nous avons utilisé le kit de dosage CM-H2DCFDA et mesuré l’intensité de la fluorescence le jour 14 de l’ALI comme marqueur du stress oxydatif dans les inserts de culture cellulaire après une exposition à l’O₂ . H₂DCFDA est une forme chimiquement réduite et acétylée de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF) qui est un indicateur d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) perméé dans les cellules vivantes. CM-H₂DCFDA est le dérivé chlorométhyle thiol-réactif de H₂DCFDA, qui favorise une liaison covalente supplémentaire aux composants intracellulaires, permettant une rétention plus longue du colorant dans la cellule. Ces molécules ne sont pas fluorescentes jusqu’à ce que les groupes acétate soient éliminés par l’action des estérases intracellulaires, et l’oxydation se produit dans la cellule⁵¹. Après l’oxydation intracellulaire, l’augmentation résultante de la fluorescence peut être mesurée avec un microscope fluorescent comme mesure de substitution du stress oxydatif cellulaire⁵². Le réactif est léger et sensible à l’air et doit donc être protégé de la lumière et maintenu étanche à l’air dans la mesure du possible.

1. Préparation de la solution de dosage CM-H2DCFDA : Chaque flacon contient 50 μg de colorant réactif sous forme de poudre. Pour obtenir une solution mère de 1 mM, ajoutez 80 μL de DMSO stérile dans le flacon, mélangez bien à l’aide d’une pipette et agitez doucement. Pour une concentration finale de 1 μM du colorant dans les inserts de culture cellulaire, ajouter 0,1 μL de la substance mère de 1 mM par 100 μL de PBS (p. ex., ajouter 0,6 μL de solution mère à 600 μL de PBS pour 6 inserts de culture cellulaire).
   REMARQUE : La concentration finale du colorant peut varier entre 1 et 5 μM. La dose doit être optimisée pour chaque condition de culture.
2. Ajouter 100 μL de la solution de colorant 1 μM dans chaque culture cellulaire pour le groupe exposé à l’hyperoxie ou à la normoxie. Utiliser au moins 1 culture cellulaire comme témoin négatif de chaque groupe de traitement (100 μL de PBS sans colorant). Incuber à 37 °C pendant 30 min, à l’abri de la lumière. Laver 1x avec du PBS.
3. Préparation des lames : Égouttez tout excès de PBS. Tenez soigneusement les inserts de culture cellulaire et utilisez une lame pour découper lentement la membrane de culture cellulaire. Versez 1 à 2 gouttes de liquide de montage sur la lame. À l’aide d’une pince à bout plat, tenez soigneusement le coin de la membrane, placez-le côté cellulaire vers le bas sur le support et couvrez-le avec une lamelle. Retirez l’excès de liquide de montage et laissez sécher à l’air libre pendant 15 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Les diapositives sont maintenant prêtes à être numérisées.
   REMARQUE : La préparation de la lame et la microscopie fluorescente doivent être effectuées aussi rapidement que possible car l’intensité fluorescente diminue considérablement en 2-3 h.
4. Microscopie fluorescente : Capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence en utilisant le canal Cy2 (cyanine-2). Capturez des images à partir de trois zones distinctes et non superposées par culture cellulaire.
5. Détection fluorescente du stress oxydatif
   REMARQUE : Utilisez les images de la microscopie fluorescente pour mesurer la fluorescence totale corrigée (CTCF) à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) et du flux de travail décrit ci-dessous. Le CTCF sert de marqueur du stress oxydatif dans les inserts de culture cellulaire après une exposition à l’hyperoxie et est mesuré en éliminant la fluorescence de fond à l’aide du logiciel ImageJ.
   1. Ouvrez l’image de microscopie dans ImageJ et sélectionnez la zone d’intérêt à l’aide de l’outil rectangle. Enregistrez la zone de sélection (α) en cliquant avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Ajouter au gestionnaire de retour sur investissement (région d’intérêt). Utilisez cette zone de sélection sur toutes les images.
   2. Sélectionnez les paramètres de mesure sous Analyser > Définir les mesures , puis sélectionnez Surface, Densité intégrée et Valeur de gris moyenne dans l’onglet Paramètres.
   3. Pour chaque image, utilisez la même zone de sélection dans le gestionnaire de retour sur investissement et sélectionnez Analyser > mesurer. La valeur de la densité intégrée représente la fluorescence totale (F_t) de la zone sélectionnée. Notez les valeurs de mesure dans la fenêtre contextuelle.
   4. Pour corriger la fluorescence d’arrière-plan (F_b) dans chaque image, sélectionnez une petite zone de région non fluorescente à l’aide de l’outil rectangle. Sélectionnez Analyser > mesurer pour cette région. La valeur moyenne de l’intensité représente F,_b. Notez les valeurs de mesure dans la fenêtre contextuelle.
   5. Calculez le CTCF en multipliant l’intensité moyenne de fluorescence des lectures de fond par la surface totale du retour d’intérêt et en soustrayant ce nombre de la valeur de densité intégrée du point d’intérêt. Répétez ce flux de travail pour toutes les images des deux groupes de traitement (Contrôle et Hyperoxie).
      CTCF = F_t - (F_b x α)
      CTCF = Fluorescence cellulaire totale corrigée (U.A.)
      F_t = Fluorescence totale
      F_b = Fluorescence de fond
      α = Zone de sélection

Pour isoler les nTAEC, nous avons prélevé des aspirations trachéales de nouveau-nés intubés dans l’unité de soins intensifs néonatals et les avons transportées sur de la glace jusqu’au laboratoire pour un traitement ultérieur (figure 1A). Après l’ensemencement des échantillons d’aspiration trachéale dans un milieu de croissance épithéliale des voies respiratoires (BLEAM-I contenant des inhibiteurs de Rho/Smad, GSK3 et m...

Le protocole décrit ici détaille une méthode de collecte et de traitement d’échantillons d’aspiration trachéale néonatale de nouveau-nés intubés dans l’unité de soins intensifs néonatals, avec isolement et expansion ultérieurs de nTAECs vivants à partir de ces échantillons à l’aide de méthodes précédemment établies³⁹. De plus, nous avons décrit une méthode pour cultiver des nTAEC sur l’ALI et caractériser leur différenciation en un ...

Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêts à signaler.

Ce travail est soutenu par le financement de la Presbyterian Health Foundation (PHF) et de l’Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 avec un prix de développement institutionnel (IDeA) du NIGMS) à AG. Nous tenons à remercier le Dr Paul LeRou et le Dr Xingbin Ai du Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, pour avoir fourni des cellules de donneurs néonatals utilisées dans certaines des expériences. Les figurines ont été créées avec Biorender. L’analyse statistique a été réalisée avec GraphPad Prism.