评估高氧对人新生儿气道上皮细胞影响的转化 3D 细胞培养模型

我们描述了一种利用新生儿气管气道上皮细胞 （nTAEC） 建立气液界面 （ALI） 培养模型的方案，并进行生理相关的高氧暴露，以研究大气诱导的氧化应激对来自发育中的新生儿气道表面上皮细胞的影响。

早产新生儿气道上皮经常暴露于环境压力源中。患有肺部疾病的新生儿的这些压力源之一包括高于周围大气的氧 （O₂） 张力 - 称为高氧 （>21% O₂）。高氧对气道的影响取决于多种因素，包括气道的发育阶段、高氧的程度和暴露的持续时间，不同的暴露可能导致独特的表型。虽然对高氧对新生儿肺泡形成和气道高反应性的影响进行了广泛的研究，但对高氧对人类新生儿气道上皮细胞的短期和长期潜在影响知之甚少。造成这种情况的一个主要原因是缺乏用于研究人类新生儿气道上皮发育和功能的有效 体外 模型。在这里，我们描述了一种利用人新生儿气管抽吸物分离和扩增人新生儿气管气道上皮细胞 （nTAECs） 并在气液界面 （ALI） 培养物中培养这些细胞的方法。我们证明 nTAECs 在 ALI 培养物中形成成熟的极化细胞单层并发生粘膜纤毛分化。我们还提出了一种使用专用培养箱在 ALI 培养物中对细胞单层进行中度高氧暴露的方法。此外，我们描述了一种使用荧光定量测量 ALI 培养物中高氧暴露后细胞氧化应激的测定法，该测定证实中度高氧暴露会诱导细胞氧化应激，但不会导致显着的细胞膜损伤或细胞凋亡。该模型可能用于模拟新生儿重症监护病房 （NICU） 中新生儿气道遇到的临床相关高氧暴露，并用于研究 O₂ 对新生儿气道上皮编程的短期和长期影响。使用该模型的研究可用于探索减轻发育中的气道的早期氧化损伤的方法，这与前早产儿长期气道疾病的发展有关。

治疗性氧气 （O₂） 是新生儿重症监护病房 （NICU） 最常用的疗法之一¹。因此，高氧暴露 （>21% O₂） 是有和没有严重肺部疾病的新生儿遇到的常见大气应激源。肺对高氧的反应可能因暴露的强度和/或持续时间以及解剖位置、细胞类型和肺发育阶段而异 2,3,4,5,6。新生儿高氧肺损伤的大部分研究都集中在出生后肺泡形成背景下高氧暴露对模型支气管肺发育不良 （BPD） 的影响 - 影响早产儿的最常见慢性肺病 6,7,8,9,10,11。BPD 严重程度按呼吸支持量和胎后 36 周所需的 O₂ 进行分类⁹.随着肺部的继续生长，大多数患有 BPD 的婴儿在临床上会随着时间的推移而改善，其中大多数婴儿在一岁生日之前就停止了呼吸支持^12,13。无论出生后 BPD 的严重程度如何，影响前早产儿的重大发病率包括学龄前喘息、哮喘、整个儿童时期反复呼吸道感染和早发性慢性阻塞性肺病的风险增加 5 倍 12,14,15,16,17,18,19.已使用体外和体内动物模型研究了高氧对早产儿长期气道疾病和肺部感染的影响 20,21,22,23,24。然而，这些模型中的大多数都集中在间充质组织、肺泡上皮和气道平滑肌的作用^上 25,26,27,28。

气道表面上皮排列在呼吸系统的整个路径上，从气管向下延伸到终末细支气管，在肺泡水平之前结束²⁹。气道基底细胞是气道上皮细胞中的初级干细胞，能够分化成成熟气道上皮谱系的全部库，包括纤毛细胞和分泌细胞（俱乐部细胞：非粘液产生，杯状细胞：产生粘液）29,30,31,32。在新生儿高氧性肺损伤的背景下，细胞培养研究主要使用成人人或小鼠癌细胞系^33,34。此外，大多数体外实验都使用了浸没式培养系统，该系统不允许细胞分化成类似于人类体内气道上皮的粘液纤毛气道上皮³⁵。因此，关于高氧诱导的肺损伤对人类新生儿气道上皮细胞发育的影响存在知识空白。原因之一是缺乏用于研究大气暴露对人类新生儿气道上皮影响的转化模型。生命早期的高氧性肺损伤会导致长期气道疾病和感染风险增加，从而改变前早产儿的生活 14,36,37。在患有严重 BPD 的非存活婴儿中，气道表面上皮具有明显的异常，包括杯状细胞增生和纤毛发育紊乱，表示粘膜纤毛清除异常和上皮高度增加损害气道口径³⁸。在过去的十年中，人们对在气液界面 （ALI） 培养原代气道上皮细胞以研究出生后气道上皮发育的兴趣越来越大 39,40,41,42。然而，新生儿气道上皮细胞的 ALI 模型尚未用于大气氧化还原扰动模型（例如高氧暴露）的背景下。

使用先前发表的方法³⁹，我们利用了从 NICU 插管新生儿获得的新生儿气管抽吸物样本，并成功分离和扩增了原代新生儿气管气道上皮细胞 （nTAECs）。我们利用 Rho、Smad、糖原合成酶激酶 （GSK3） 和哺乳动物雷帕霉素靶标 （mTOR） 信号传导的抑制剂来增加这些细胞的扩增能力并延缓衰老，如前所述^39,42，这允许高效和更晚地传代 nTAECs。该方案描述了使用 nTAEC 建立 3D ALI 培养物和在 nTAEC 单层上进行高氧暴露的方法。Rho 和 Smad 抑制用于 ALI 培养的前 7 天 （ALI 第 0 至 7 天），之后在 ALI 培养持续时间的其余时间内从分化培养基中去除这些抑制剂。ALI 培养的气道上皮细胞单层的顶端表面保持暴露在环境中⁴³，这使得大气扰动研究成为可能，并且与体内暴露于高氧的发育中的新生儿气道的病理学非常相似。新生儿高氧性肺损伤的先前细胞培养研究中使用的 O₂ 浓度（无论永生化细胞或原代细胞）差异很大（范围从 40% 到 95%），暴露持续时间（范围从 15 分钟到 10 天）也是如此36,44,45,46,47。在本研究中，从 ALI 第 7 天到第 14 天（从分化培养基中去除 Rho/Smad 抑制剂后），ALI 细胞单层暴露于 60% O₂ 中 7 天。高氧暴露是在粘膜纤毛分化的早期-中期（ALI 第 7 至 14 天）进行的，而不是在完全分化的成熟上皮进行，因此模拟了早产儿体内发育的气道上皮。这种暴露策略将急性 O₂ 毒性的风险降至最低（预计 O₂ 浓度较高时会发生），同时仍会在生理相关范围内施加氧化应激，并且类似于早产儿从相对缺氧的宫内环境过渡到高氧外部环境的关键窗口。

新生儿气管抽吸物样本仅在父母知情同意后收集，用于收集、运输和储存的方案已获得俄克拉荷马大学健康科学中心机构审查委员会 （IRB） （IRB 14377） 的批准。

1. nTAEC 的分离、传代和 ALI 培养的准备工作

1. 培养基制备
   1. 含抑制剂的支气管上皮气道培养基 （BLEAM） （BLEAM）：添加 1.25 mL HLL 补充剂（500 μg/mL 人血清白蛋白、0.6 μM 亚油酸、0.6 μg/mL 卵磷脂）、15 mL L-谷氨酰胺 （6 mM）、2 mL 提取物 P（0.4%，牛垂体提取物）、5 mL TM1（1 μM 肾上腺素、 1 μM 肾上腺素、 5 μg/mL 转铁蛋白、10 nM 三碘甲状腺原氨酸、0.1 μg/mL 氢化可的松、5 ng/mL 表皮生长因子 （EGF）、5 ng/mL 胰岛素）、1 mL 抗生素溶液（Normocin，0.1 mg/mL）。为了防止原代细胞衰老并提高扩增效率，如前所述添加以下生长因子抑制剂³⁹：Y-27632（Rho 相关蛋白激酶或 ROCK 抑制剂）终浓度为 5 μM，A83-01（抑制 Smad 信号传导），终浓度为 1 μM，CHIR 99021（糖原合成酶激酶-3 或 GSK3 抑制剂）终浓度为 0.4 μM 和雷帕霉素（雷帕霉素或 mTOR 分子靶标抑制剂），最终浓度为 5 nM。通过 0.22 μm 孔径过滤器过滤介质。有关媒体组件的列表，请参阅 表 1 。
   2. 人支气管/气管上皮细胞 （HBTEC） ALI 培养基：通过在 37 °C 下解冻瓶子并加入 1 mL 抗生素溶液（Normocin，0.1 mg/mL）来制备 500 mL HBTEC 培养基。添加后，通过 0.22 μm 孔径过滤器过滤介质。
   3. 含抑制剂的 HBTEC 培养基 （HBTEC-I）：如上所述制备 HBTEC 培养基。过滤前，添加以下抑制剂：终浓度为 5 μM 的 Y-27632 和终浓度为 0.5 μM 的 A83-01。通过 0.22 μm 孔径过滤器过滤培养基。
      注意：将 BLEAM-I、HBTEC 和 HBTEC-I 培养基储存在 4 °C 下，注明日期并贴上标签，在黑暗中（用箔纸包裹），并且只加热所需的等分试样（保质期为 30 天）。
   4. HEPES/FBS：添加 500 mL HEPES 缓冲盐水和 88 mL FBS（终浓度为 15%）。添加后，通过 0.22 μm 孔径过滤器过滤溶液并将其储存在 4 °C，注明日期并标记。
      注意：使用前将 BLEAM、HEPES-FBS 和胰蛋白酶-EDTA 等分装并加热至 37 °C（至少 30 分钟）。
2. 用 804G 条件培养基包被培养瓶和 ALI 细胞培养小室
   1. 如前所述，准备 804G 细胞（大鼠膀胱上皮细胞系）基质条件培养基³⁹。
   2. 用 804G 条件培养基包被细胞培养瓶和细胞培养插入物，在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中至少4 小时。请参阅 表 2 ，了解包被不同培养瓶和细胞培养小室所需的培养基量。

2. nTAEC 的分离和扩增以及后续 ALI 培养的准备

1. 在常规抽吸插管新生儿的气管插管时获取新鲜的气管抽吸物（约 1 mL），并将抽吸物收集在粘液陷阱中。如果抽吸物量不足以到达粘液收集器，请用 1-3 mL 无菌盐水冲洗抽吸导管。
2. 标记样品并将其存放在冰上的生物危害袋中。
   注意：样品可以在 4 °C 的冰上储存最多 24 小时。然而，新鲜样品的产量更高。
3. 将样本从 NICU 运送到实验室。用 804G 条件培养基包被 T25 培养瓶，并准备在将气管抽吸物运输到实验室时接种样品。
4. 从生物危害袋中取出粘液捕获器，并用 70% 乙醇彻底清洁外表面，以避免任何污染。在无菌细胞培养罩下小心地打开粘液捕集器上的盖子。
5. 用无菌 PBS 将气管抽吸样品稀释至 5 mL（以稀释粘液），并将全部内容物转移到 50 mL 锥形管中。
6. 将试管在 250 x g 、20 °C-23 °C 下离心 5 分钟，并弃去上清液（包括粘液）。
   注意：除非另有说明，否则此处的所有离心均在 250 x g、20 °C-23 °C 下进行 5 分钟。
7. 将沉淀重悬于 5 mL 的 BLEAM-I 中。
8. 从培养箱中取出 T25 培养瓶，并在铺板样品前丢弃 804G 条件培养基。
9. 将样品接种在 T25 培养瓶中，并置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中（这称为第 0 代或 P0）。
10. 接种后 24 小时用 BLEAM-I 更换培养基以洗掉未附着的细胞，随后每 48 小时更换一次。
    注意：处理气管抽吸物样品并在 BLEAM-I 培养基中孵育后，长方体形状的细胞在接种后 7-10 天出现。铺板后约 3 周，细胞密集堆积，需要胰蛋白酶消化以进行后续传代、扩增和储存。将早期传代 （P1 - P2） 细胞置于冻存管中（每个冻存管每 500 μL 冻存培养基 2.5 x 10⁶ 个细胞），并储存在液氮中以便长期储存。
11. 在 37 °C 水浴中从液氮中快速解冻冷冻细胞，并将细胞悬液转移到含有 BLEAM-I 的适当大小的无菌管中。
12. 如前所述，使用台盼蓝染色剂和自动或手动细胞计数器对细胞进行计数以确定总细胞数和活细胞数⁴⁸。用适当体积的 BLEAM-I 稀释细胞悬液，使最终浓度为 15 mL 细胞悬液中的 2.1 x 10⁶ 个细胞（用于 T75 培养瓶）。
    注：对于 T25 培养瓶，通常使用 5 mL 细胞悬液中的 0.7 x 10⁶ 个细胞进行接种。
13. 将 15 mL 细胞悬液转移到 T75 培养瓶中，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育过夜。
14. 第二天早上，用新的 BLEAM-I 交换媒体。然后，每 2 天更换一次新的 BLEAM-I 培养基。一旦细胞达到 80%-90% 左右，就可以进行胰蛋白酶消化以进行 ALI 培养。
15. 将 5 mL 胰蛋白酶-EDTA （T75） 涂在细胞单层上。
    注意：记得使用新鲜的胰蛋白酶。避免使用已多次加热的胰蛋白酶。
16. 将培养瓶在 37 °C 下在培养箱中孵育 5 分钟。然后，敲击培养瓶的侧面 8x-10x 以去除细胞。在显微镜下检查以确认胰蛋白酶消化后细胞已脱落。如果培养瓶上仍有 >50% 的细胞，则用 PBS 2x 洗涤并重复胰蛋白酶消化步骤，孵育时间缩短 2-3 分钟。
17. 用 15 mL 的 HEPES-FBS 终止反应，并上下移液 4 次至 5 次。将细胞转移至适当大小的无菌管中，并以 250 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。
18. 离心后，小心吸出上清液。轻轻上下吹打 5 次至 10 次，将细胞沉淀溶解在 1 mL BLEAM-I 中。
19. 对细胞进行计数以确定细胞总数和活细胞数。用适当体积的 BLEAM-I 稀释细胞悬液，使终浓度为每 100 μl 细胞悬液 1 x 10⁵ 个活细胞。

3. nTAEC 的 ALI 培养

注：细胞培养小室应涂有 804G 条件培养基，并在下一步之前在 37 °C、5% CO₂ 下孵育至少 4 小时（参见步骤 1.2）。

1. 从培养箱中取出含有细胞培养小室的 24 孔细胞培养板，并丢弃 804G 条件培养基。
2. 将 1 mL 的 BLEAM-I 添加到每个 ALI 孔的基底外侧（下）腔中。将 100 μL 细胞悬液（1 x 10⁵ 个细胞）添加到 ALI 细胞培养小室的顶腔中，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育细胞。此阶段定义为 ALI 第 -2 天。
3. 第二天，用新鲜的 BLEAM-I 更换基底外侧 （1 mL） 和顶端 （100 μL） 腔室中的培养基。更换顶腔中的培养基时，注意不要干扰细胞单层。此阶段定义为 ALI 第 -1 天。
4. 第二天，从基底外侧和根尖腔中取出培养基。
   注：在浸没条件下，细胞培养膜上的细胞需要 2 天才能汇合。在这个阶段，可以建立 ALI。
5. 向基底外侧腔中添加 1 mL 的 HBTEC-I 培养基，但让顶腔培养基自由并暴露在空气中。此阶段定义为 ALI 第 0 天。
6. 从 ALI 第 0 天到第 6 天，继续每 48 小时在基底外侧腔室更换 HBTEC-I 培养基 （1 mL）。在 ALI 第 7 天切换到常规 HBTEC 培养基（不含抑制剂），直到所需的收获时间点。
   注意：在 ALI 培养的前 7 天，来自基底外侧腔的培养基可能会泄漏到根尖腔中。这种培养基需要每天仔细吸出，以保持细胞层的健康并允许它们分化。
7. 在不同时间点收获细胞、细胞培养插入物和基底外侧培养基，用于分子技术、测定和分析。
   1. 对于该方案，在 ALI 第 0、7 和 28 天，收获细胞用于上皮分化标志物的 qPCR 基因表达分析（标准制造商方案）。在 ALI 第 0、7、14 和 28 天，收获细胞培养插入物以测试屏障功能（方法如下）。
   2. 在 ALI 第 0 天和第 28 天，使用福尔马林固定的细胞培养插入物进行上皮分化标志物的免疫荧光染色（利用先前发布的方案）⁴⁹。在 ALI 第 14 天，收获用于乳酸脱氢酶 （LDH） 释放的基底外侧培养基（标准制造商方案），用于氧化应激标志物 qPCR 的细胞裂解物，以及用 caspase-3 和裂解的 caspase-3 抗体进行免疫印迹（标准制造商方案），以及用于氧化应激测定的细胞培养插入物（方法如下所述）。

4. 测试 ALI 分化过程中的屏障功能

1. 测量跨上皮电阻 （TEER）
   注：在 ALI 分化过程中使用上皮电压/欧姆表 （EVOM） 测量 TEER，以评估细胞层完整性⁵⁰。
   1. 在测量测试过滤器电阻值之前，使用 804G 条件培养基包被的细胞培养物（不含任何细胞）测量以欧姆 （Ω） 为单位的背景电阻值
   2. 从测试过滤器电阻值中减去背景电阻值，然后将差值乘以细胞生长表面积，以获得每个测试过滤器的 TEER 值。
      TEER = （Ω_T - Ω_B） X C
      TEER = 跨上皮电阻 （Ω.cm²）
      Ω_T = 测试滤波器电阻值 （Ω）
      Ω_B = 背景电阻值 （Ω）
      C = 细胞生长表面积 （cm²）
      注：用于TEER测量的细胞培养插入物随后用10%缓冲福尔马林固定，并立即用于免疫荧光染色和荧光显微镜检查（方法如下所述）或储存在4°C以备后染色。
2. 异羟乙基磺酸葡聚糖荧光素 （FITC-葡聚糖） 上皮通透性测定
   注：在 ALI 分化过程中，使用两种不同分子量的 FITC-葡聚糖（10 kD 和 20 kD）进行上皮通透性测定。
   1. 制备 FITC-葡聚糖工作溶液 （1 mg/mL）：测量 5 mg FITC 并混入 1 mL DMSO （5 mg/mL）。在加热至 37 °C 至 1 mg/mL 浓度的 HBTEC 培养基中重悬 5 mg/mL 原液。避光保护溶液。
   2. 将测试过滤器（包含细胞）转移到新的 12 孔板中，并在基底外侧隔室中加入 1 mL 的 HBTEC 培养基。
   3. 吸出根尖隔室培养基（如果有），并用 250 μL 的 FITC-葡聚糖工作溶液代替。在室温下避光孵育 60 分钟。
   4. 通过从 12 孔板中取出测试过滤器（含有 FITC-葡聚糖工作溶液）来结束 FITC-葡聚糖测定。
   5. 从 1.5 mL 微量离心管中的 12 孔板中收集基底外侧培养基并涡旋。
   6. 将 100 μL 等分试样从每管转移到 96 孔透明底部黑色聚苯乙烯微孔板中，一式三份。将 100 μL HBTEC 培养基转移到 96 孔板中的其他孔中作为阴性对照，以测量背景荧光。
   7. 使用分光光度计使用 490 nm 激发波长和 520 nm 最大发射波长测量荧光强度。
   8. 从测试滤光片荧光值中减去平均背景荧光值以获得校正的荧光，并将这些值表示为相对于 FITC 10 kD 和 20 kD 的 ALI 第 0 天校正荧光值的百分比。

5. 使用 TriGas 培养箱暴露高氧

1. 在 ALI 第 7 天，根据实验和收获需要确定要放入高氧环境中的细胞培养插入片段的数量。
2. 将 TriGas 培养箱中的 O₂ 水平设置为 60% O₂。O₂ 水平通常需要 ~30-45 分钟才能达到 60%。
3. 一旦 O₂ 水平稳定在 60%，将 24 孔细胞培养板和分配给高氧组的细胞培养小室放入培养箱内，然后关闭培养箱门。
   注意：此步骤需要尽可能高效地执行，以防止培养箱内的 O₂ 水平显着下降。
4. 按照与对照（21% O₂ 暴露）孔相同的时间表更换高氧暴露的细胞培养插入物中的培养基。每天检查细胞培养小室是否有培养基泄漏，并轻轻将任何泄漏吸入细胞培养室中。
5. 继续高氧暴露 7 天（ALI 第 7 至 14 天）。一旦完成高氧暴露，在 ALI 第 14 天收获细胞或使用细胞培养插入片段进行检测。

6. 氧化应激测定以评估高氧的影响

注：我们使用 CM-H2DCFDA 测定试剂盒并在 ALI 第 14 天测量荧光强度，作为 O₂ 暴露后细胞培养插入物中氧化应激的标志物。H₂DCFDA 是 2′，7′-二氯荧光素 （DCF） 的化学还原和乙酰化形式，DCF 是活性氧 （ROS） 的活细胞通透性指示剂。CM-H₂DCFDA 是 H₂DCFDA 的巯基反应性氯甲基衍生物，可促进与细胞内组分的进一步共价结合，从而延长染料在细胞内的保留时间。这些分子在乙酸酯基团被细胞内酯酶的作用去除之前是无荧光的，并且在细胞中发生氧化⁵¹。细胞内氧化后，可以用荧光显微镜测量由此产生的荧光增加，作为细胞氧化应激的替代测量⁵²。该试剂重量轻且对空气敏感，因此需要避光并尽可能保持密封。

1. CM-H2DCFDA 测定溶液的制备：每个小瓶含有 50 μg 粉末状试剂染料。要制备 1 mM 储备溶液，向小瓶中加入 80 μL 无菌 DMSO，用移液管充分混合，然后轻轻涡旋。对于细胞培养小室中染料的最终浓度为 1 μM 的情况，每 100 μL PBS 添加 0.1 μL 的 1 mM 原液（例如，将 0.6 μL 原液添加到 600 μL PBS 中，用于 6 个细胞培养小室）。
   注：染料的最终浓度可在 1-5 μM 之间变化。需要针对每种培养条件优化剂量。
2. 对于每个细胞培养物，对于高氧暴露组或常氧暴露组，在每种细胞培养物中加入 100 μL 的 1 μM 染料溶液。使用每个处理组的至少 1 种细胞培养物作为阴性对照（100 μL 不含染料的 PBS）。在 37 °C 下避光孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤 1 次。
3. 玻片制备：排空多余的 PBS。小心握住细胞培养小室，并使用刀片慢慢切出细胞培养膜。将 1-2 滴封固剂液体倒在载玻片上。用平头镊子小心地握住膜的一角，将其细胞面朝下放在封固剂上，然后用盖玻片盖住。去除多余的封固剂液体，并在室温下避光风干 15 分钟。载玻片现在可以进行成像了。
   注意：载玻片和荧光显微镜的制备应尽快进行，因为荧光强度在 2-3 小时内显着减弱。
4. 荧光显微镜：使用利用 Cy2 （花青-2） 通道的荧光显微镜捕获图像。从每个细胞培养物的三个独立、不重叠的区域捕获图像。
5. 氧化应激的荧光检测
   注：使用 ImageJ 软件 （https://imagej.nih.gov/ij/） 和下述工作流程，使用荧光显微镜的图像来测量校正后的总细胞荧光 （CTCF）。CTCF 作为高氧暴露后细胞培养插入物中氧化应激的标志物，并通过在 ImageJ 软件的帮助下消除背景荧光来测量。
   1. 在 ImageJ 中打开显微镜图像，然后使用矩形工具选择感兴趣的区域。右键单击并选择 Add to ROI （region of interest） manager 来保存选择区域 （α）。在图像中使用此选择区域。
   2. 在 分析>设置测量 下选择要测量的参数，然后在设置选项卡中选择 面积、积分密度和平均灰度值 。
   3. 对于每个图像，请使用 ROI 管理器中的相同选择区域，然后选择 Analyze > Measure。积分密度值表示所选区域的总荧光 （F_t）。记下弹出窗口中的测量值。
   4. 要校正每张图像中的背景荧光 （F_b），请使用矩形工具选择一小块非荧光区域。选择 此区域的 Analyze > Measure （分析 此区域的度量值）。平均强度值表示 F_b。记下弹出窗口中的测量值。
   5. 通过将背景读数的平均荧光强度乘以 ROI 的总面积并从 ROI 的积分密度值中减去该数字来计算 CTCF。对两个治疗组（Control 和 Hyperoxia）的所有图像重复此工作流程。
      CTCF = F_t - （F_b x α）
      CTCF = 校正总细胞荧光 （A.U.）
      F_t = 总荧光
      F_b = 背景荧光
      α = 选择区域

为了分离 nTAECs，我们从 NICU 中插管的新生儿中收集气管抽吸物，并将冰上的抽吸物运送到实验室进行进一步处理 （图 1A）。将气管抽吸物样本接种在气道上皮生长培养基（含有 Rho/Smad、GSK3 和 mTOR 抑制剂的 BLEAM-I）中后，长方细胞在 7-10 天内出现。 到 14 天时，细胞达到 50%-60% 汇合度，铺板后约 21 天，细胞密集堆积，需要?...

此处描述的方案详细介绍了一种从 NICU 插管新生儿中收集和处理新生儿气管抽吸物样本的方法，随后使用先前建立的方法从这些样本中分离和扩增活的 nTAEC³⁹。此外，我们描述了一种在 ALI 上培养 nTAEC 的方法，并通过测量 TEER、FITC-葡聚糖测定、免疫荧光染色和细胞类型 （即基底、纤毛、俱乐部和杯状） 特异性标志物的 qPCR 分析来表征它们分化为极化粘?...

作者无需披露任何内容，也无需报告任何利益冲突。

这项工作得到了长老会健康基金会 （PHF） 和俄克拉荷马州共享临床和转化资源（U54GM104938获得 NIGMS 机构发展奖 （IDeA））到 AG 的资助。我们要感谢马萨诸塞州波士顿哈佛医学院麻省总医院的 Paul LeRou 博士和 Xingbin Ai 博士，他们为一些实验提供了新生儿供体细胞。人物是使用 Biorender 创建的。使用 GraphPad Prism 进行统计分析。