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Method Article
我们描述了一种利用新生儿气管气道上皮细胞 (nTAEC) 建立气液界面 (ALI) 培养模型的方案,并进行生理相关的高氧暴露,以研究大气诱导的氧化应激对来自发育中的新生儿气道表面上皮细胞的影响。
早产新生儿气道上皮经常暴露于环境压力源中。患有肺部疾病的新生儿的这些压力源之一包括高于周围大气的氧 (O2) 张力 - 称为高氧 (>21% O2)。高氧对气道的影响取决于多种因素,包括气道的发育阶段、高氧的程度和暴露的持续时间,不同的暴露可能导致独特的表型。虽然对高氧对新生儿肺泡形成和气道高反应性的影响进行了广泛的研究,但对高氧对人类新生儿气道上皮细胞的短期和长期潜在影响知之甚少。造成这种情况的一个主要原因是缺乏用于研究人类新生儿气道上皮发育和功能的有效 体外 模型。在这里,我们描述了一种利用人新生儿气管抽吸物分离和扩增人新生儿气管气道上皮细胞 (nTAECs) 并在气液界面 (ALI) 培养物中培养这些细胞的方法。我们证明 nTAECs 在 ALI 培养物中形成成熟的极化细胞单层并发生粘膜纤毛分化。我们还提出了一种使用专用培养箱在 ALI 培养物中对细胞单层进行中度高氧暴露的方法。此外,我们描述了一种使用荧光定量测量 ALI 培养物中高氧暴露后细胞氧化应激的测定法,该测定证实中度高氧暴露会诱导细胞氧化应激,但不会导致显着的细胞膜损伤或细胞凋亡。该模型可能用于模拟新生儿重症监护病房 (NICU) 中新生儿气道遇到的临床相关高氧暴露,并用于研究 O2 对新生儿气道上皮编程的短期和长期影响。使用该模型的研究可用于探索减轻发育中的气道的早期氧化损伤的方法,这与前早产儿长期气道疾病的发展有关。
治疗性氧气 (O2) 是新生儿重症监护病房 (NICU) 最常用的疗法之一1。因此,高氧暴露 (>21% O2) 是有和没有严重肺部疾病的新生儿遇到的常见大气应激源。肺对高氧的反应可能因暴露的强度和/或持续时间以及解剖位置、细胞类型和肺发育阶段而异 2,3,4,5,6。新生儿高氧肺损伤的大部分研究都集中在出生后肺泡形成背景下高氧暴露对模型支气管肺发育不良 (BPD) 的影响 - 影响早产儿的最常见慢性肺病 6,7,8,9,10,11。BPD 严重程度按呼吸支持量和胎后 36 周所需的 O2 进行分类9.随着肺部的继续生长,大多数患有 BPD 的婴儿在临床上会随着时间的推移而改善,其中大多数婴儿在一岁生日之前就停止了呼吸支持12,13。无论出生后 BPD 的严重程度如何,影响前早产儿的重大发病率包括学龄前喘息、哮喘、整个儿童时期反复呼吸道感染和早发性慢性阻塞性肺病的风险增加 5 倍 12,14,15,16,17,18,19.已使用体外和体内动物模型研究了高氧对早产儿长期气道疾病和肺部感染的影响 20,21,22,23,24。然而,这些模型中的大多数都集中在间充质组织、肺泡上皮和气道平滑肌的作用上 25,26,27,28。
气道表面上皮排列在呼吸系统的整个路径上,从气管向下延伸到终末细支气管,在肺泡水平之前结束29。气道基底细胞是气道上皮细胞中的初级干细胞,能够分化成成熟气道上皮谱系的全部库,包括纤毛细胞和分泌细胞(俱乐部细胞:非粘液产生,杯状细胞:产生粘液)29,30,31,32。在新生儿高氧性肺损伤的背景下,细胞培养研究主要使用成人人或小鼠癌细胞系33,34。此外,大多数体外实验都使用了浸没式培养系统,该系统不允许细胞分化成类似于人类体内气道上皮的粘液纤毛气道上皮35。因此,关于高氧诱导的肺损伤对人类新生儿气道上皮细胞发育的影响存在知识空白。原因之一是缺乏用于研究大气暴露对人类新生儿气道上皮影响的转化模型。生命早期的高氧性肺损伤会导致长期气道疾病和感染风险增加,从而改变前早产儿的生活 14,36,37。在患有严重 BPD 的非存活婴儿中,气道表面上皮具有明显的异常,包括杯状细胞增生和纤毛发育紊乱,表示粘膜纤毛清除异常和上皮高度增加损害气道口径38。在过去的十年中,人们对在气液界面 (ALI) 培养原代气道上皮细胞以研究出生后气道上皮发育的兴趣越来越大 39,40,41,42。然而,新生儿气道上皮细胞的 ALI 模型尚未用于大气氧化还原扰动模型(例如高氧暴露)的背景下。
使用先前发表的方法39,我们利用了从 NICU 插管新生儿获得的新生儿气管抽吸物样本,并成功分离和扩增了原代新生儿气管气道上皮细胞 (nTAECs)。我们利用 Rho、Smad、糖原合成酶激酶 (GSK3) 和哺乳动物雷帕霉素靶标 (mTOR) 信号传导的抑制剂来增加这些细胞的扩增能力并延缓衰老,如前所述39,42,这允许高效和更晚地传代 nTAECs。该方案描述了使用 nTAEC 建立 3D ALI 培养物和在 nTAEC 单层上进行高氧暴露的方法。Rho 和 Smad 抑制用于 ALI 培养的前 7 天 (ALI 第 0 至 7 天),之后在 ALI 培养持续时间的其余时间内从分化培养基中去除这些抑制剂。ALI 培养的气道上皮细胞单层的顶端表面保持暴露在环境中43,这使得大气扰动研究成为可能,并且与体内暴露于高氧的发育中的新生儿气道的病理学非常相似。新生儿高氧性肺损伤的先前细胞培养研究中使用的 O2 浓度(无论永生化细胞或原代细胞)差异很大(范围从 40% 到 95%),暴露持续时间(范围从 15 分钟到 10 天)也是如此36,44,45,46,47。在本研究中,从 ALI 第 7 天到第 14 天(从分化培养基中去除 Rho/Smad 抑制剂后),ALI 细胞单层暴露于 60% O2 中 7 天。高氧暴露是在粘膜纤毛分化的早期-中期(ALI 第 7 至 14 天)进行的,而不是在完全分化的成熟上皮进行,因此模拟了早产儿体内发育的气道上皮。这种暴露策略将急性 O2 毒性的风险降至最低(预计 O2 浓度较高时会发生),同时仍会在生理相关范围内施加氧化应激,并且类似于早产儿从相对缺氧的宫内环境过渡到高氧外部环境的关键窗口。
新生儿气管抽吸物样本仅在父母知情同意后收集,用于收集、运输和储存的方案已获得俄克拉荷马大学健康科学中心机构审查委员会 (IRB) (IRB 14377) 的批准。
1. nTAEC 的分离、传代和 ALI 培养的准备工作
2. nTAEC 的分离和扩增以及后续 ALI 培养的准备
3. nTAEC 的 ALI 培养
注:细胞培养小室应涂有 804G 条件培养基,并在下一步之前在 37 °C、5% CO2 下孵育至少 4 小时(参见步骤 1.2)。
4. 测试 ALI 分化过程中的屏障功能
5. 使用 TriGas 培养箱暴露高氧
6. 氧化应激测定以评估高氧的影响
注:我们使用 CM-H2DCFDA 测定试剂盒并在 ALI 第 14 天测量荧光强度,作为 O2 暴露后细胞培养插入物中氧化应激的标志物。H2DCFDA 是 2′,7′-二氯荧光素 (DCF) 的化学还原和乙酰化形式,DCF 是活性氧 (ROS) 的活细胞通透性指示剂。CM-H2DCFDA 是 H2DCFDA 的巯基反应性氯甲基衍生物,可促进与细胞内组分的进一步共价结合,从而延长染料在细胞内的保留时间。这些分子在乙酸酯基团被细胞内酯酶的作用去除之前是无荧光的,并且在细胞中发生氧化51。细胞内氧化后,可以用荧光显微镜测量由此产生的荧光增加,作为细胞氧化应激的替代测量52。该试剂重量轻且对空气敏感,因此需要避光并尽可能保持密封。
为了分离 nTAECs,我们从 NICU 中插管的新生儿中收集气管抽吸物,并将冰上的抽吸物运送到实验室进行进一步处理 (图 1A)。将气管抽吸物样本接种在气道上皮生长培养基(含有 Rho/Smad、GSK3 和 mTOR 抑制剂的 BLEAM-I)中后,长方细胞在 7-10 天内出现。 到 14 天时,细胞达到 50%-60% 汇合度,铺板后约 21 天,细胞密集堆积,需要?...
此处描述的方案详细介绍了一种从 NICU 插管新生儿中收集和处理新生儿气管抽吸物样本的方法,随后使用先前建立的方法从这些样本中分离和扩增活的 nTAEC39。此外,我们描述了一种在 ALI 上培养 nTAEC 的方法,并通过测量 TEER、FITC-葡聚糖测定、免疫荧光染色和细胞类型 (即基底、纤毛、俱乐部和杯状) 特异性标志物的 qPCR 分析来表征它们分化为极化粘?...
作者无需披露任何内容,也无需报告任何利益冲突。
这项工作得到了长老会健康基金会 (PHF) 和俄克拉荷马州共享临床和转化资源(U54GM104938获得 NIGMS 机构发展奖 (IDeA))到 AG 的资助。我们要感谢马萨诸塞州波士顿哈佛医学院麻省总医院的 Paul LeRou 博士和 Xingbin Ai 博士,他们为一些实验提供了新生儿供体细胞。人物是使用 Biorender 创建的。使用 GraphPad Prism 进行统计分析。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-426796 | |
1X PBS (Phosphate Buffered Saline) Solution, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
A 83-01 | Tocris | 29-391-0 | |
ALI Transwell Inserts, 6.5mm | Corning | 3470 | |
Anti-Acetylated Tubulin antibody, Mouse monoclonal | Sigma | T7451 | |
Anti-alpha Tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
Anti-Cytokeratin 5 antibody | Abcam | ab53121 | |
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM) | LifeLine Cell Technology | LL-0023 | |
CHIR 99021 | Tocris | 44-231-0 | |
Cleaved caspase-3 antibody | Cell signaling | 9664T | |
SCGB1A1 or Club Cell Protein (CC16) Human, Rabbit Polyclonal Antibody | BioVendor R&D | RD181022220-01 | |
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | Thermo Scientific | C6827 | |
Corning Cell Culture Treated T25 Flasks | Corning | 430639 | |
Corning U-Shaped Cell Culture T75 Flasks | Corning | 430641U | |
CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay | Thermo Scientific | C20300 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | EN62248 | |
Dimethyl sulfoxide [DMSO] Hybri-Max | Sigma | D2650 | |
Distilled water | Gibco | 15230162 | |
EVOM Manual for TEER Measurement | World Precision Instrument | EVM-MT-03-01 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10082147 | |
Fluorescein Isothiocyanate Dextran (average mol wt 10,000) | Fisher Scientific | F0918100MG | |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (average mol wt 20,00) | Sigma | FD20-100MG | |
Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Human ads-HRP | Southern Biotech | 1031-05 | |
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21141 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRP | Southern Biotech | 4050-05 | |
HBTEC Air-Liquid Interface (ALI) Differentiation Medium | LifeLine Cell Technology | LM-0050 | |
HEPES | Lonza | CC-5024 | |
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 51030411 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
HLL supplement | LifeLine Cell Technology | LS-1001 | |
ImageJ | NIH | N/A | imagej.nih.gov/ij/ |
Invivogen Normocin - Antimicrobial Reagent | Fisher Scientific | NC9273499 | |
L-Glutamine | LifeLine Cell Technology | LS-1013 | |
Normal Goat Serum | Gibco | PCN5000 | |
Normocin | Invivogen | ant-nr-05 | |
p63 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-25268 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183025 | |
RAPAMYCIN | Thermo Scientific | AAJ62473MC | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Scientific | 4444964 | |
Taqman Gene Exression Assays: 18S rRNA | Thermo Scientific | Hs99999901_s1 | |
Taqman Gene Exression Assays: CAT | Thermo Scientific | Hs00156308_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: FOXJ1 | Thermo Scientific | Hs00230964_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: GAPDH | Thermo Scientific | Hs02786624_g1 | |
Taqman Gene Exression Assays: GPX1 | Thermo Scientific | Hs00829989_gH | |
Taqman Gene Exression Assays: GPX2 | Thermo Scientific | Hs01591589_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: GPX3 | Thermo Scientific | Hs01078668_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: KRT5 | Thermo Scientific | Hs00361185_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: MUC5AC | Thermo Scientific | Hs01365616_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: SCGB1A1 | Thermo Scientific | Hs00171092_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: SOD1 | Thermo Scientific | Hs00533490_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: SOD2 | Thermo Scientific | Hs00167309_m1 | |
Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane (0.22 μm pores, 500 ml) | Thermo Scientific | 5660020 | |
TM-1 Combined Supplement | LifeLine Cell Technology | LS-1055 | |
Total caspase-3 antibody | Cell signaling | 14220S | |
Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Gibco | 25300062 | |
Y-27632 2 HCl | Tocris | 12-541-0 |
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