순환 사망 기증자 심장을 사용한 이종토피 쥐 심장 이식 모델

여기에서는 순환 사멸 기증자 심장을 활용한 쥐 이소성 심장 이식의 준비 및 기술적 세부 사항에 대해 설명합니다.

이 프로토콜의 목적은 순환기 사망(DCD) 기증자 심장 기증 후 기증으로 쥐 이종 심장 이식 모델을 설정하는 것입니다. 이 프로토콜에는 심장 기증자 설정과 수혜자 설정의 두 가지 설정이 있습니다. 심장 기증자 설정에서 Sprague Dawley 쥐는 마취, 기관 내 삽관 및 인공호흡을 합니다. 우측 경동맥은 헤파린과 마비제인 베쿠로늄-브로마이드를 전달하기 위해 캐뉼레이트됩니다. DCD 프로세스는 환기를 종료하여 시작됩니다. 20분 후, 심장이 노출되고 상완두분지 원위부의 대동맥이 고정됩니다. 인공호흡기 종료 후 25분이 지나면 얼음처럼 차가운 위스콘신 대학교(UW) 용액이 경동맥 카테터를 통해 관류되어 심장을 세척합니다. 심장은 대동맥, 폐동맥, 대정맥, 폐정맥을 분열하여 조달하고 UW 용액에 저장하여 이식합니다. 수용자 설정에서 Lewis 쥐는 이소플루란으로 마취됩니다. 서방형 부프레노르핀을 피하로 투여하여 수술 후 원활한 회복을 촉진합니다. 복부 정중선 절개를 통해 신하부 대동맥과 하대정맥을 분리하고 외상성 혈관 클램프로 고정합니다. 기증자 심장 대동맥과 폐동맥은 각각 수혜자 복부 대동맥과 대정맥에 봉합되며, 8-0으로 프롤렌. 심장을 재관류하기 위해 혈관 클램프를 제거합니다. 복벽을 닫고 쥐를 회복시킵니다. 설정된 간격(24시간 - 2주) 후에 수혜자 쥐를 마취하고 이식된 심장을 노출시킨 다음 정점을 통해 좌심실에 풍선 팁 카테터를 삽입하여 데이터 수집 시스템을 사용하여 개발된 압력과 dP/dt를 기록합니다. 심장 조직은 조직학, 면역학 또는 분자 분석을 위해 수집됩니다. 성공적인 DCD 기증자 쥐 심장 이식 모델은 DCD 기증자의 심장 이식 결과를 개선하기 위한 심장 보호 접근법에 대한 추가 연구를 가능하게 할 것입니다.

심장 이식의 소동물 모델(HTx)은 이식된 심장에 영향을 미치는 병태생리학적 상태를 연구하는 연구를 수행하는 데 중요합니다. Oto와 Lindsey가 설명한 바와 같이 쥐 모델에서 이소성 HTx를 통해 연구자들은 허혈 및 재관류 조건에서 관찰된 병태생리학적 변화를 연구할 수 있었습니다¹. 전통적으로 이식을 위한 기증자 심장은 뇌사 후 기증(DBD) 기증자라고도 하는 박동 심장 기증자로부터 조달되었습니다. 그러나 HTx²를 필요로 하는 환자의 수가 불균형적으로 증가하고 있습니다. 보다 최근에는 순환기 사망 후 기증(DCD) 기증자라고도 하는 순환기 사망 기증자의 심장이 실험 환경에서 이식에 사용되었습니다³. DBD와 DCD 기증자 심장의 주요 차이점은 후자의 경우 심장이 다양한 허혈 기간을 겪기 때문에 일상적인 HTx 실습에서 사용할 수 없다는 것입니다.

앞서 설명한 쥐 이종성 HTx에 대한 문헌에서는 심장 박동 기증자의 상태만 활용했습니다 ^4,5,6. 이소성 DCD 심장 이식은 미묘한 변형이 필요하며, 미묘한 변형이 없으면 이식된 심장이 박동할 수 없다⁷. 이 프로토콜은 쥐에서 DCD HTx의 세련된 기술을 독자와 공유하는 것을 목표로 합니다. 전골적 심근허혈은 DCD 장기 기증에 선천적으로 존재합니다. 전신 심근허혈을 모방한 실험적 설정은 생체 외 설정⁵에서만 연구되었습니다. 생체 외 연구의 결과는 생체 내(DCD)와 생체 외 전반적 허혈 모델 간에 유의한 차이가 있기 때문에 DCD HTx 연구에 적용되지 않을 수 있습니다⁵. 체외 모델에서 재관류 심근허혈을 완화하기 위한 중재의 결과 또는 부족은 DCD HTx 모델에서 재현되지 않을 수 있습니다. 따라서 동물 모델에서 인간 DCD HTx를 시뮬레이션하는 것이 필수적이며, 그 결과는 더 높은 번역 가치를 가질 수 있습니다. 여기에 설명된 DCD HTx 모델을 통해 연구자는 임상 DCD HTx를 면밀히 시뮬레이션하고 기증자 심장과 수혜자 모두에 대한 중재를 통해 재관류 손상을 완화할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 수혜자 쥐가 회복되면 이식된 심장의 기능, 조직 병리학 및 면역학을 이식 시점부터 다양한 간격으로 연구할 수 있습니다.

모든 동물 실험은 기관 지침과 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험 동물의 관리 및 사용 가이드(NIH 간행물 번호 86-23, 2011년 개정)⁸에 따라 수행되었습니다. 다음 절차는 버지니아 커먼웰스 대학교(Virginia Commonwealth University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 OSHA(산업안전보건청) 지침과 권장 멸균 기술⁹에 따라 수행되었습니다. Sprague Dawley 쥐는 23 ° C의 온도와 12 시간의 어둡고 밝은 주기에서 습도가 조절 된 상태에서 사육되었습니다.

1. 실습 설정

참고: 작동 현미경으로 멸균 설치류 생존 수술을 수행할 수 있는 전용 공간을 지정합니다. 수술실의 주변 온도를 따뜻하게 유지하십시오. 수술과 회복 과정 모두에 보온 패드를 사용하는 것은 수혜 쥐의 체온을 유지하는 데 필수적입니다.

1. 주사기, 생리식염수 0.9%(NaCl), 마취제(이소플루란, 케타민/자일라진), 헤파린, 베쿠로늄 브로마이드, 보존액, 얼음 양동이, 진통제(부프레노르핀 서방성)를 포함한 필수 용품(재료 목록)을 비축하고 쉽게 구할 수 있도록 보관하십시오.
2. 수술 부위에 미세 수술 기구(그림 1A, B)를 깔끔하게 놓습니다. 오염된 필수 기구를 즉시 세척할 수 있도록 플래시 멸균 키트를 쉽게 사용할 수 있도록 보관하십시오.

2. 생체 내 쥐 DCD 기증자 제제

1. 기관 삽관 및 경동맥 삽관을 위해 쥐를 마취합니다. Sprague Dawley 쥐(8-12주령)를 3% 이소플루란 챔버에서 진정시킨 다음 케타민/자일라진(100/10mg/kg, 근육 주사)으로 마취합니다.
2. 기관과 우측 경동맥을 노출시키기 위해 완전히 마취된 쥐를 누운 자세로 놓고 알코올과 포비돈 용액으로 목과 가슴 앞쪽을 청소합니다. V의 봉우리가 정중선의 쥐의 턱에 가깝고 V의 각 팔다리가 해당 어깨를 가리키도록 V자 절개를 만듭니다. 피하 조직에서 피부를 분리하고 피부를 가슴으로 뒤집어 목의 스트랩 근육을 노출시킵니다(그림 2A).
   1. 기관을 노출시키기 위해 집게로 정중선 스트랩 근육(흉골유방과 흉골)을 분리하여 쥐를 삽관합니다(그림 2B). 기관을 5-0 실크로 둘러싸고 기관 고리 사이의 근육 조직을 부분적으로 나누어 엽니다.
   2. 14G의 혈관을 기관에 삽입하고 5-0 실크로 고정합니다(그림 2C). 혈관을 인공호흡기에 연결합니다(1호흡/분에서 90mL/kg).
   3. 우측 경동맥 캐뉼레이션의 경우, 총경동맥(기관의 오른쪽과 평행하게 바로 오른쪽에 있음)을 확인하고, 조심스럽게 목 전체 길이로 분리한 다음 원위(두개골) 끝을 5-0 실크로 묶습니다.
   4. 경동맥의 캐뉼레이션을 용이하게 하기 위해 견인을 위해 넥타이의 자유 끝에 지혈제를 부착합니다.
   5. 경동맥의 가장 근위부(목 아래쪽 방향)를 동원하고 혈관 지혈을 사용하여 고정합니다. 작동 현미경 아래에서 마이크로 홍채 가위를 사용하여 경동맥을 가장 말단의 앞쪽으로 부분적으로 나누어 경동맥을 엽니다. 22G 혈관류로 경동맥을 캐뉼레이션하고 5-0 실크 넥타이로 고정합니다(그림 2D).
   6. 약물 또는 심정지 용액을 경동맥으로 쉽게 전달할 수 있도록 혈관에 3방향 흐름 스톱콕 어댑터를 부착하고, 압력 센서에 연결하여 DCD 프로세스 중 심박수와 압력을 모니터링합니다(그림 2D). 근위 혈관 클램프가 해제될 때 박동성 혈액의 역류를 알아차려야 합니다.
   7. 고정되면 경동맥 카테터를 압력 센서에 연결하고 헤파린(1,000 U/Kg)과 베쿠로늄 브로마이드(4 mg/kg)를 전달합니다.
   8. DCD 프로세스 시작: 베쿠로늄 브로마이드를 1분 동안 순환시킵니다. 동물이 고통받는 징후가 있는지 관찰하고 필요한 경우 추가 마취를 제공합니다. 인공호흡기(저산소증/허혈)를 중지하여 DCD 프로세스를 시작합니다. 호흡기 활동이 없는지 관찰하십시오.
      참고: DCD 허혈 시간은 인공호흡기 지원이 중단된 시점부터 시작됩니다. 쥐의 경우, 허혈 25분은 심각하지만 되돌릴 수 있는 손상을 초래하는 최대 시간으로 확인되었다⁷. 압력 추적은 ~3.5분에 인공호흡 지원이 중단되는 순간부터 전신 압력이 50mmHg 미만으로 떨어지는 것을 보여주며, 이 압력은 심장을 효과적으로 관류하기에 충분하지 않은 것으로 간주됩니다(그림 3).
3. 기증자 심장 조달: 심장을 조달하고 차가운 심마비를 투여하기 위해 ~4-7분을 할당합니다. 목표 허혈 시간인 25분을 달성하려면 인공호흡 지원이 종료된 후 18-21분 후에 심장 조달을 시작합니다.
   참고: 조달을 수행하는 사람의 경험에 따라 조달 시간을 수정합니다.
   1. xiphoid 수준에서 시작하여 늑골 가장자리를 따라 복벽을 분할한 다음 쇄골까지 양쪽의 흉골과 평행하게 흉곽을 나누어 양측 전방 개흉술을 수행합니다(그림 4A). 이 단계를 용이하게 하기 위해 저배율(5x)에서 작동하는 현미경을 사용하십시오.
   2. 쇄골에 경첩이 달린 갈라진 흉벽을 머리 쪽으로 뒤집고 지혈로 고정합니다(그림 4B).
   3. 하대정맥(IVC)을 5-0 실크로 둘러싼 다음 간 돔에 가까운 마이크로 가위로 부분적으로 나눕니다(그림 4C). 부분적으로 열린 IVC는 심장의 오른쪽을 구부리기 때문에 심정지의 출구를 허용합니다.
   4. 상행 대동맥과 폐동맥(PA) 사이의 평면을 절개한 다음 끝이 뭉툭한 구부러진 집게가 있는 횡동 동을 통해 폐줄기를 분기점으로 분리합니다. 마이크로 가위를 사용하여 분기점에 가까운 폐동맥을 조심스럽게 나눕니다(그림 4C).
   5. 뭉툭한 박리로 대동맥궁을 둘러쌉니다. 이것은 작은 직각 혈관 클램프가 대동맥궁을 가로질러 innominate artery의 원점까지 배치될 수 있도록 하기 위한 것입니다.
   6. 인공호흡기 종료 후 25분 지점에서 대동맥궁을 고정하고 경동맥 카테터를 통해 심정지 상태(4°C에서 2-3분에 걸쳐 위스콘신 대학교 용액 10mL)를 수동으로 전달합니다(그림 4D).
   7. 마이크로 가위를 사용하여 상행 대동맥을 대동맥궁 원위부로 분열합니다(그림 4E).
   8. IVC를 심장 쪽으로 5-0 실크로 묶고 원위부로 나눕니다.
   9. 폐정맥과 상대정맥(SVC)을 5-0 실크로 접합합니다(그림 4F). 이러한 넥타이는 많은 양의 조직을 보유하기 때문에 악기 넥타이보다 핸드 타이가 선호됩니다. 면봉으로 심장을 복부 쪽으로 부드럽게 당겨 심방 부속기를 넥타이에 묶지 않고 폐정맥 결찰을 용이하게 합니다.
   10. 마이크로 홍채 가위로 폐정맥을 나누고 심장을 채취하여 얼음처럼 차가운 생리식염수에 넣습니다(그림 4G).

3. 생체 내 쥐 DCD 이소성 심장 이식

1. 이소플루란 챔버(3% 유도)에서 수혜자를 진정시키고, 복부 위의 머리카락을 자르고, 포비돈과 알코올로 해당 부위를 청소합니다. 수혜자를 항응고시키지 마십시오. 이것은 문합으로 인한 과도한 출혈과 이식 실패로 이어질 것입니다.
2. 쥐를 누운 자세로 가열 패드에 놓습니다. 쥐와 가열 패드 사이에 프로브를 놓아 온도를 모니터링합니다. 쥐의 체온을 38°C로 유지하십시오. 따뜻한 식염수 또는 유리 구슬로 채워진 50mL 사전 멸균 원심분리기 튜브 2개를 쥐의 복부 양쪽에 놓아 쥐를 따뜻하게 유지할 수 있도록 합니다.
3. 위의 단계에도 불구하고 체온이 37.5°C 이하로 떨어지면 실온(RT)을 높이고 노출된 모든 신체 부위를 오토클레이브 알루미늄 호일로 덮어 복부 수술을 할 수 있는 충분한 면적만 남겨둡니다.
4. 콧방울을 통해 3% 이소플루란으로 전신 마취를 유도하고 점차 2%로 낮춥니다.
5. linea-alba를 따라 복부를 열고(그림 5A) 복벽 견인기를 배치하여 작업 공간을 노출시킵니다(그림 5B).
6. 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 확장된 결장 또는 전체 결장을 이동하고 따뜻하고 촉촉한 거즈에 넣어 작업자의 왼쪽에 놓고 주기적으로 따뜻한(38°C) 식염수를 세척합니다(그림 5C). 결장을 옆으로 옮기면 DCD 심장이 매우 뻣뻣하고 복부에 수용할 수 있는 추가 공간이 필요하기 때문에 DCD 심장에 더 많은 공간을 제공할 수 있습니다.
7. 면봉을 사용하여 무딘 해부로 정중선의 후복막을 엽니다. 대동맥과 IVC를 노출시킵니다.
8. 무외상성 소아 다각도 혈관 클램프를 사용하여 문합을 위해 신장 하부 대동맥과 IVC를 3-5mm 분리합니다(그림 5D).
9. 헤파린 100단위와 섞인 생리식염수로 채워진 1cm³ 주사기에 장착된 30G 바늘로 대동맥에 들어갑니다. 용액 0.2-0.3mL로 플러시합니다(그림 5E). 헤파린이 흡수되어 봉합선에서 출혈을 유발할 수 있으므로 멸균 면 팁 어플리케이터로 여분의 용액을 두드려냅니다.
10. 마이크로 가위를 사용하여 긴 축을 따라 대동맥을 열어 공여자의 대동맥 크기에 맞춥니다. 이 시점에서 IVC는 열리지 않으며 IVC와 대동맥 사이에 평면을 만들려고 시도하지 마십시오. 이것은 출혈로 이어질 것입니다.
11. 문합 중 기증자의 심장 방향이 적절하게 잡히는 것은 매우 중요합니다(그림 5F). 문합을 위해 기증자 심장의 방향을 정하여 우심실의 전방면이 천장을 향하고, 정점이 작업자의 오른쪽을 가리키며, 기증자 대동맥이 폐동맥보다 약간 낮도록 합니다. 이 방향은 폐동맥 문합에 대한 긴장을 줄이는 결과를 낳습니다.
    1. 대동맥 문합: 미세 혈관 문합을 위해 뾰족한 팁 바늘 드라이버와 정밀 핀셋을 사용합니다. 8-0으로 문합 수행 니들 드라이버 잠금 장치가 제거된 0.3mm 팁 바늘 홀더에 로드된 테이퍼드 4mm 바늘의 모노필라멘트 봉합사로 잠금 및 잠금 해제 시 우발적인 조직 외상을 방지합니다.
    2. 대동맥 문합부의 6시 위치에 스테이 봉합사를 놓습니다. 이것은 대칭 및 지혈 봉합 라인을 제공하기 위해 수행됩니다. 그런 다음 12시 방향에서 공여자 대동맥의 바깥쪽에서 안쪽으로, 수용자 대동맥의 안쪽에서 바깥쪽으로 문합을 시작합니다(그림 6A, B). 작업 봉합사를 5-7cm만 유지하고 나머지는 자릅니다.
    3. 시계 반대 방향으로 이동하여 6시 위치를 향해 짧은 거리를 이동한 다음 심장을 왼쪽으로 뒤집어 12시 위치까지 시계 반대 방향으로 문합을 완료합니다(그림 6C).
    4. 묶기 전에 느슨한 봉합사 라인이 있는지 확인하십시오.
       참고: 안전한 문합은 대칭이어야 하며 틈 없이 기증자와 수혜자 인피를 근사화해야 합니다.
    5. 폐동맥 문합: 대동맥에서 폐동맥을 분리하고 비틀림 없이 IVC로 문합할 수 있도록 방향을 잡습니다. 기증자의 심장을 채우기 위해 수혜자의 혈액량을 준비하고 3-5mL의 피하(목덜미) 생리식염수를 주사하여 저혈압을 예방합니다.
    6. 쥐의 호흡 패턴을 모니터링하고 폐동맥 문합이 거의 완료됨에 따라 이소플루란을 2.0%에서 1.5%로 줄입니다.
    7. 마이크로 홍채 가위로 대동맥 문합과 관련하여 IVC 두부를 엽니다(그림 6C). 0.2-0.3mL의 식염수를 사용하여 IVC를 세척합니다. 소수의 혈전이 보일 것입니다. 조심스럽게 씻어내십시오.
    8. 대동맥 문합과 달리 스테이 봉합사 없이 폐 문합을 시작하십시오. 노출을 방해합니다. 12시 방향에서 바늘이 기증자 폐동맥의 바깥쪽에서 안쪽으로, 수혜자 IVC의 안쪽에서 바깥쪽으로 바늘이 움직이면서 시작합니다. 봉합사를 묶고 먼저 시계 방향으로 뒷벽 문합을 완료합니다.
    9. 6시 위치에 있으면 12시 위치에 도달할 때까지 시계 방향으로 계속 봉합한 다음 이전 타이에서 봉합사의 짧은 끝에 묶습니다. 문합이 좁아지면 심장에서 정맥 배출이 제한되므로 문합을 조이지 않도록 주의하십시오. 평균적으로 두 문합을 모두 완료하는 데 30분 이하가 소요됩니다.
    10. 바늘 구멍에서 출혈을 억제하기 위해 문합 위에 흡수성 지혈의 작은 조각을 놓습니다.
    11. 혈관을 풀고 필요에 따라 바늘 구멍 위에 더 많은 흡수성 지혈기를 추가합니다(그림 6E). 이식된 심장은 리드미컬한 호흡을 재개하기 전에 가끔 세동과 함께 박동하기 시작합니다. 심장이 뛰고 명백한 출혈이 없는 한 흡수성 지혈제를 5분 동안 그대로 두십시오.
    12. 지혈이 만족스러우면(~3-5분) 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 과도한 흡수성 지혈기를 제거하고 식염수로 세척한 다음 장을 복강으로 되돌립니다(그림 6F). 지혈을 돕기 위해 문합 위에 망막을 놓습니다.
    13. 13mm 절단 바늘에 5-0 모노크릴로 두 층으로 된 복벽을 먼저 리네아 알바를 닫은 다음 피부를 닫습니다(그림 6G, H).

4. 복구 및 모니터링

1. 복부 폐쇄가 완료되면 회복을 위해 쥐를 따뜻한 패드에 엎드려 눕힙니다. 콧방울을 통해 1%로 5분 동안 이소플루란을 계속 투여한 다음 중지합니다.
2. 자발적 호흡이 규칙적으로 이루어지면 쥐를 깨끗한 회복 케이지로 옮기고 따뜻한 패드에 올려 놓고 회복 과정을 계속합니다. 쥐의 갑작스런 움직임은 출혈 위험이나 문합에 뒤틀림을 초래할 수 있습니다. 수술 시작 전에 투여되는 지속성 진통제는 원활한 회복 과정을 크게 촉진합니다.

5. 통제 박동 심장의 조달 및 이식

1. 허혈이 없는 경우 기증자 심장의 품질을 평가하기 위한 대조군으로 대조군 심장 기증자(CBD) 심장을 조달합니다.
   참고: CBD 기증자는 인공호흡 지원 종료를 제외하고 DCD 심장에 대해 설명된 모든 단계를 거칩니다. CBD 심장은 박동하는 동안 조달되고 인공 호흡기로 완전히지지됩니다. 심정지 투여는 심장을 정지시키며, DCD 심장에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 조달 및 이식이 완료됩니다.

6. 이식된 심장 기능 평가:

1. 심장 이식 시점부터 미리 정해진 간격(24시간에서 14일)으로 수혜자 쥐(3% 흡입 이소플루란)를 마취하고 따뜻한 패드에 올려 놓고 복부 절개를 열어 이식된 심장을 노출시킵니다.
2. 좌심실의 정점을 통해 풍선 팁 카테터를 삽입하여 개발된 압력(DP), 최대 +dP/dt 및 최소 -dP/dt를 측정합니다.
   알림: 여기에서 PowerLab 스테이션은 혈압 기록을 위한 데이터 수집 시스템으로 사용되었습니다.

이종성 심장 이식 후 24시간에서 14일 후에 복부를 다시 열 수 있으며 심장을 노출시켜 좌심실에서 발생하는 압력을 측정할 수 있습니다. DCD(또는 CBD) 심장의 좌심실에 풍선 팁 카테터를 삽입하여 개발된 압력(DP), 최대 +dP/dt 및 최소 -dP/dt를 측정합니다. 그림 7 은 이식 24시간 후 CBD 심장과 비교하여 DCD 심장의 예상 DP, +dP/dt 및 -dP/dt의 예를 보여줍니다. CBD 심장에 비해 DCD 심장의 DP는 현저히 감소했으며 + dP / dt(최대) 및 -dP / dt(최소)가 악화되었습니다.

그림 1: 이종성 쥐 심장 이식에 사용되는 미세혈관 기구. (1) 곡선 팁이 있는 겸자; (2) 직선 팁이 있는 아이리스 마이크로 가위; (3) 고정밀 포인트가 있는 핀셋; (4) Ebakey 외상성 소아 다중 각도 혈관 클램프; (5) 잠금 장치가 제거된 바늘 홀더; (6) 마이크로 가위, 직각 및 곡선 팁; (7) 무거운 혈관 클램프; (8a) 봉합사에 큰 클립을 사용하여 오토클레이브 가능한 곡선형 수동 성형 복벽 견인기(전면 보기); (8b) 오토클레이브 가능한 곡선형 수동 성형 복벽 견인기(측면 보기). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 기증자 삽관 및 경동맥 삽관에 대한 단계별 설명. (A) 가위로 목 부위 위의 피부를 절단하고 연조직을 노출시킵니다. (B) 둔한 박리 기법을 사용하여 기관과 오른쪽 경동맥을 노출시킵니다. (C) 기관을 횡단절개하고 기관관을 삽입하여 인공호흡기에 연결하고 고정합니다. (D) 정맥 절개술 카테터를 오른쪽 경동맥에 삽입하고 고정한 다음 삼방향 스톱콕으로 튜브 라인에 연결합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: DCD 프로세스 중 전신 동맥압 기록의 예. 동맥압을 측정하기 위해 경동맥 카테터를 사용했습니다. 압력과 시간은 각각 Y축과 X축에 보고됩니다. 화살표는 인공호흡 지지대가 종료되는 순간과 평균 전신압이 30mmHg 미만으로 떨어진 시간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 기증자 심장 조달에 대한 단계별 설명. (A) 경동맥 캐뉼러는 마비제와 헤파린을 전달하는 데 사용됩니다. 적절한 DCD 또는 CBD 프로토콜에 따라 측면 개흉술이 수행됩니다. (B) 대동맥궁과 주요 흉관을 적절하게 노출시키기 위해 앞쪽 가슴을 머리 위로 뒤집습니다. (C) 폐동맥을 가능한 한 원위부로 절단한다. 하대정맥은 우심실을 감압하기 위해 흠집이 납니다. (D) 대동맥궁은 무협 동맥과 총경동맥 사이에 고정되어 있습니다. 얼음처럼 차가운 심정지 부위는 정맥 절개술 카테터/경동맥 접근을 사용하여 심장으로 전달됩니다. (E) 상행 대동맥은 아치 아래에서 절단되고 하대정맥은 오른쪽 심방 근위부에 결찰됩니다. (F) 심장 뒤쪽에 봉합 고리를 만들어 상대정맥과 폐정맥을 닫습니다. 흉부 혈관이 절단됩니다. (G) 흉혈관에서 분리된 심장과 결합 조직은 얼음처럼 차가운 식염수에 저장되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 수혜자 준비에 대한 단계별 설명. (A) 복부 피부와 근육층은 중앙선을 따라 세로로 절단됩니다. (B) 복부 장기가 노출되어 있습니다. 조직 견인기는 복부 입구를 넓힙니다. (C) Q-tip은 공동의 뒤쪽을 노출시키고 하대정맥과 복부 대동맥을 청소하는 데 사용됩니다. (D) U자형 혈관 클램프는 복부 대동맥과 하대정맥을 폐색합니다. (E) 복부 대동맥은 30G 바늘로 구멍을 뚫습니다. 마이크로 가위는 세로 대동맥 절개술을 만드는 데 사용됩니다. (F) 기증자 심장 대동맥은 수혜자 복부 대동맥의 개구부 옆에 정렬되어 있습니다. 안 8-0 프롤렌 봉합사는 문합을 시작하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 이종성 심장 이식, 심장 소생 및 수술 절차 완료에 대한 단계별 설명. (A) 기증자 대동맥을 제자리에 고정하기 위해 12시 방향 봉합이 이루어집니다. (B) 기증자와 수혜자 대동맥 사이의 지속적인 봉합은 반대쪽에서 시작됩니다. (C) 대동맥 문합이 완료되고 마이크로 가위를 사용하여 세로 정맥 절개술을 만듭니다. (D) 기증자의 폐동맥은 정맥절개술 옆에 정렬되어 있으며 12시 방향 스티치로 고정됩니다. 문합을 완료하기 위해 연속 봉합사를 사용합니다. (E) U자형 혈관 클램프를 제거하고 심장을 다시 관류합니다. (F) Q-tip은 장을 복강으로 재분배하는 데 사용됩니다. (G) 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 복벽과 피부를 봉합합니다. (H) 봉합 과정을 완료한 후 동물을 수술에서 회복합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 이식 후 24시간 후에 쥐에서 측정한 개발된 압력(DP), +dP/dt(최대) 및 -dP/dt(최소)의 예(N = 5/그룹). *P < 0.05. CBD 심장에 비해 DCD 심장의 DP, +dP/dt(최대) 및 -dP/dt(최소)가 현저히 감소했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

성공적인 DCD 이종성 쥐 HTx를 위해서는 실험의 세심하고 사려 깊은 설정이 확립되는 것이 중요합니다. 세부 설정은 1) 어린 쥐를 DCD 기증자로 선택, 2) 이소플루란을 마취제로 선택, 3) 기증자의 심장에 심정지를 효과적으로 전달, 4) 기증자의 심장을 얼음처럼 차가운 용액에 보관, 5) 요추 혈관을 손상시키지 않고 복부 박리를 제한하여 대동맥과 대정맥만 노출시키고, 6) 수술 중 및 수술 후 수혜자의 체온 유지, 7) 문합을 위해 IVC와 대동맥을 분리할 수 있는 무혈관 클램프 활용, 8) 뻣뻣한 DCD 기증자 심장을 위한 수혜자 복부에 충분한 공간 확보, 9) 미세혈관 기구 선택, 10) 수혜자의 항응고 방지, 11) 세심한 지혈 문합, 12) 수술 후 원활한 회복을 위해 선제적 진통제를 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 결과를 성공적으로 재현하기 위한 모든 단계의 세부 정보를 제공합니다.

여기에 기술된 DCD 랫트 HTx 방법은 1964년 Abbott가 쥐 HTx를 처음 설명한 이후 문헌에 기술된 이종소성 HTx를 개선하기 위해 변형을 채택했습니다¹⁰. 위에서 설명한 프로토콜의 중요한 수정 사항에는 마취제의 선택이 포함됩니다. 마취제인 이소플루란은 모니터링이 용이하고 원하는 마취 깊이로 조절할 수 있습니다. Abbott가 처음 설명한 종단 간 문합 기법에 비해 기증자, 심장 대동맥 및 폐동맥의 좌우 문합을 수혜자의 복부 대동맥 및 하대정맥에 적용함으로써 높은 수술 후 하반신 마비 및 사망률을 제거했습니다. 요추 혈관을 손상시키고 하반신 마비의 위험을 초래할 수 있는 대동맥의 둘레 박리를 피하려면 복부 대동맥과 대정맥을 분리하기 위해 외상성 혈관 클램프를 사용하는 것이 좋습니다. 하반신 마비의 위험을 줄이는 것 외에도 혈관 클램프를 사용하면 시간 효율성이 더 높고 지혈이 더 많습니다. DCD 심장의 허혈성 손상 후 대사 폐기물 및 독소가 항상 축적되기 때문에 조달 시 심장을 세척하는 효과적인 전략이 필요합니다. 우측 경동맥을 효과적으로 캐뉼링하고 상완두동맥이 제거될 때까지 원위부의 대동맥궁을 고정함으로써 DCD 심장에 보존 용액을 효과적으로 전달하고 대사 폐기물을 씻어낼 수 있습니다. 혈관 문합이 예상되는 완료 10분 전에 피하 식염수(1mL/100g)를 정기적으로 투여하면 문합 중 생긴 바늘 구멍에서 예상되는 출혈과 재관류 시 기증자의 우심방과 심실을 채우는 데 필요한 혈액량을 선제적으로 보충합니다. 이것은 혈관 클램프가 해제될 때 발생할 수 있는 잠재적인 저혈압을 방지하여 이식된 심장과 이식 쥐의 효과적인 재관류 위험을 방지합니다. 수술 시작 전에 지속성 진통제인 부프레노르핀을 투여하면 수혜자의 원활한 회복을 할 수 있습니다. 적절한 통증 조절이 없으면 수용 쥐는 활발하게 움직일 수 있어 취약한 혈관 문합법의 지혈을 위태롭게 할 수 있습니다. 프로토콜에 설명된 몇 가지 요인에 세심한 주의를 기울이면 DCD 심장 이식 과정이 성공할 수 있습니다 1,7,11,12,13.

DCD 쥐 HTx 방법의 주요 한계 및 문헌에 설명 된 다른 모든 쥐 HTx 모델의 한계는 이식 된 심장의 비 작동 상태입니다^{6 , 7 , 11 , 12 , 13} . 현재 모델을 미래에 작동하는 심장 모델로 잠재적으로 변환하는 데 필요한 수정 사항이 연구되고 있습니다. 또 다른 한계는 수혜자가 기증자 심장에 대해 반응하는 면역학적 반응입니다. 이 한계는 이식을 위해 syngeneic rats를 사용하여 쉽게 극복할 수 있습니다. syngeneic rats를 이용한 여러 rat DCD HTx가 성공적으로 수행되었으며, syngeneic rats를 조달하는 데 드는 높은 비용으로 인해 일상적인 사용이 제한됩니다. CBD 심장과 달리 DCD 심장은 수혜자의 신체에서 재관류시 박동을 재개하지 않습니다. 그러나 관상동맥 혈류가 형성되며, 관상동에서 배출될 때 상당한 양의 혈류가 심장 오른쪽에 고입니다. 이 혈액이 정체되어 있으면 응고되어 이식편이 실패합니다. 따라서 우심실 표면을 하대정맥 쪽으로 굴린 면 팁 어플리케이터로 오른쪽 심실을 기계적으로 비우는 것이 좋습니다. 기증자의 심장에 관상동맥이 계속 흐르도록 하고 팽창하는 것을 방지하면 1-2분 안에 박동을 재개할 수 있습니다. 기증자의 심장이 수혜자의 복부 대동맥/대정맥에 문합되는 동안, 수혜자의 하체는 하체 대동맥 폐색으로 인해 허혈 상태(20-30분)로 남아 있습니다. 내장과 달리 팔다리는 명백한 부상 없이 더 긴 허혈 기간(2-3시간 이상)을 견딜 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 재관류된 사지에서 사이토카인이 방출되는 것은 이식된 심장에 영향을 미칠 가능성이 매우 높습니다. 이식된 이식편 기능은 재관류 시점으로부터 더 짧은 기간에 평가되는 경우 사이토카인 방출에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 사이토카인 방출은 급성기 반응이기 때문에 이식된 심장 기능에 대한 사이토카인의 장기적인 영향은 최소화될 것입니다.

임상 DCD 프로세스와 유사한 쥐 in vivo DCD 심장 기증자 모델을 확립하는 것은 이식을 위한 기증자 심장 풀을 확장하는 데 중점을 둔 연구에 크게 기여합니다. 이 논문이 발표되기 전에는 기존 방법들이 먼저 랑겐도르프(Langendorff) 시스템에 박동하는 심장을 배치한 다음(생체 외(ex vivo)) 맥박동을 중단하여 DCD 과정을 시작함으로써 전반적 허혈을 활용했다⁶. 따라서, 체외 허혈 모델은 임상 DCD 프로토콜⁵에서 관찰된 바와 같이 생체 내 과정과 비교하여 몇 가지 차이점이 있습니다. 여기에 설명된 DCD 모델은 임상 DCD 프로세스와 매우 유사하며 DCD 심장에 대한 재관류 손상을 완화하기 위한 요인을 테스트하는 데 더 큰 유용성을 가지고 있습니다.

기존의 임상 DCD 프로토콜은 DCD 기증자가 사망 선고를 받을 때까지 장기 조달을 용이하게 하기 위해 고안된 물리적 또는 약리학적 개입이 허용되지 않는 "사망 기증자 규칙"을 엄격히 따릅니다. 이처럼 DCD 기증으로 여러 장기, 특히 심장에 대한 따뜻한 허혈은 불가피합니다. 임상 DCD 과정을 염두에 두고, 여기에 설명된 쥐 DCD HTx 모델은 완전한 무수축(사망) 후 및 25분의 따뜻한 전신 허혈 후에만 기증자 심장의 관류를 허용합니다. 쥐 DCD 모델에서 연구할 수 있는 중요한 중재는 허혈 및 재관류로 인한 총 손상의 최대 50%를 차지할 수 있는 재관류 손상을 표적으로 삼는 데 초점을 맞춰야 한다¹⁴. 재관류를 완화하기 위해 조달 시 DCD 심장에 전달되는 재관류 보존 용액에 손상제를 추가하여 미토콘드리아의 전자 수송 사슬, 인플라마솜 조절제 및 미토콘드리아 투과성 전이 공극 안정제를 표적으로 할 수 있습니다¹⁵. Na/H 펌프 억제제, 퍼퓨세이트의 산성화, NO 생성제, 에리트로포이에틴 및 멜라토닌과 같은 생체 외 전역 허혈 모델에서 연구된 다른 제제는 모두 여기에 설명된 DCD HTx 모델을 사용하여 생체 내에서 연구할 수 있습니다. 현재 임상 실습에서 30분 이상의 허혈 지속 시간은 임상 연구 프로토콜에서도 DCD 심장 조달에 대한 금기 사항입니다. 아마도 여기에 설명된 DCD 쥐 HTx 모델을 활용한 엄격한 연구 수행을 통해 과학계는 언젠가는 허혈 기간이 더 긴 임상 DCD HTx를 수행할 수 있는 개입을 제안할 수 있습니다.

이 원고의 저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 Mohammed Quader 박사(1I01 BX003859)에게 수여된 Merit Review Grant와 Pauley Heart Center에서 Mohammed Quader와 Stefano Toldo 박사에게 수여된 기금의 지원을 받았습니다.