循環器死ドナー心臓を用いた異所性ラット心臓移植モデル

ここでは、循環死ドナー心臓を利用したマウス異所性心移植の調製と技術的な詳細について述べる。

このプロトコルの目的は、循環器死 (DCD) ドナー心臓後の提供を伴うラット異所性心臓移植モデルを設定することです。このプロトコルには、心臓ドナー設定とレシピエント設定の2つの設定があります。心臓ドナーのセットアップでは、Sprague Dawleyラットに麻酔をかけ、気管内に挿管し、換気を行います。右頸動脈にカニューレを挿入して、ヘパリンと麻痺薬の臭化ベクロニウムを送達します。DCDプロセスは、換気を終了することによって開始されます。20分後、心臓が露出し、腕頭枝の遠位にある大動脈が固定されます。人工呼吸器の終了から 25 分後に、氷のように冷たいウィスコンシン大学 (UW) の溶液が頸動脈カテーテルを介して灌流され、心臓が洗い流されます。心臓は、大動脈、肺動脈、大静脈、肺静脈を分割して調達し、UW溶液に貯めて着床します。レシピエントのセットアップでは、ルイスラットをイソフルランで麻酔します。徐放性ブプレノルフィンは、術後のスムーズな回復を促進するために皮下投与されます。正中線腹部切開を通じて、腎下大動脈と下大静脈を分離し、非外傷性血管クランプで固定します。ドナーの心臓大動脈と肺動脈は、それぞれレシピエントの腹部大動脈と大静脈に縫合され、8-0プロレーヌ。血管クランプを取り外して心臓を再灌流します。腹壁を閉じ、ラットを回収する。設定された間隔(24時間から2週間)の後、レシピエントラットに麻酔をかけ、移植した心臓を露出させ、バルーン先端カテーテルを頂点を介して左心室に挿入し、データ収集システムを使用して発達した圧力とdP / dtを記録します。心臓組織は、組織学、免疫学、または分子分析のために収集されます。DCDドナーラット心臓移植モデルが成功すれば、DCDドナーからの心臓移植転帰を改善するための心臓保護アプローチに関するさらなる研究が可能になります。

心臓移植(HTx)の小動物モデルは、移植された心臓に影響を与える病態生理学的状態を研究する研究を行うために重要です。OtoとLindseyによって記述されたように、マウスモデルにおけるヘテロトピアHTxは、研究者が虚血および^再灌流の条件で観察される病態生理学的変化を研究することを可能にしました1。伝統的に、移植用のドナー心臓は、脳死後ドナー(DBD)ドナーとしても知られる鼓動する心臓ドナーから調達されてきました。しかし、HTx²を必要とする患者の数は不釣り合いに増加しています。最近では、循環死ドナーからの心臓、または循環死後ドナー(DCD)ドナーとも呼ばれ、実験環境での移植に使用されています³。DBDとDCDドナー心臓の主な違いは、後者では、心臓はさまざまな期間の虚血にさらされるため、日常的なHTx診療での使用が不可能であることです。

マウスのヘテロトピー性HTxに関する前述の文献は、鼓動する心臓ドナー条件のみを利用しています^4,5,6。ヘテロトピア性DCD心臓移植には微妙な修正が必要であり、それなしでは移植された心臓は鼓動しません⁷。このプロトコルは、ラットにおけるDCD HTxの洗練された技術を読者と共有することを目的としています。全体的な心筋虚血は、DCD臓器提供に先天的です。全体的な心筋虚血を模倣した実験セットアップは、ex vivoセットアップ⁵でのみ研究されています。ex vivo 研究の結果は、in vivo (DCD) と ex vivo の全球虚血モデルとの間に有意差が存在するため、DCD HTx 研究には適用されない可能性があります⁵。ex vivoモデルで再灌流心筋虚血を緩和するための介入から得られる結果、またはその欠如は、DCD HTxモデルでは再現できない場合があります。したがって、ヒトDCD HTxを動物モデルでシミュレートすることが不可欠であり、その結果はより高い並進値を持つことができます。ここで説明するDCD HTxモデルにより、研究者は臨床DCD HTxを綿密にシミュレートし、ドナーの心臓とレシピエントの両方への介入を通じて再灌流障害を軽減する機会を提供できます。レシピエントラットが回復すると、移植された心臓の機能、組織病理学、および免疫学を移植時からさまざまな間隔で研究できます。

すべての動物実験は、施設のガイドラインと、国立衛生研究所が発行した実験動物のケアと使用に関するガイド(NIH Publication No. 86-23, revised 2011)⁸に従って実施されました。以下の手順は、バージニアコモンウェルス大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。すべての手順は、OSHA(労働安全衛生局)のガイドラインと推奨される滅菌技術⁹に従って行われました。Sprague Dawleyラットは、23°Cの温度と12時間の暗/明サイクルで制御された湿度の下で飼育されました。

1. ラボのセットアップ

注:手術用顕微鏡で無菌のげっ歯類の生存手術を行うための専用スペースを割り当てます。手術室の周囲温度を暖かく保ちます。手術と回復プロセスの両方に加温パッドを使用することは、レシピエントラットの体温を維持するために不可欠です。

1. 注射器、生理食塩水0.9%(NaCl)、麻酔薬(イソフルラン、ケタミン/キシラジン)、ヘパリン、臭化ベクロニウム、保存液、アイスバケツ、鎮痛剤(ブプレノルフィン徐放性)などの必需品(材料表)を備蓄し、すぐに利用できるように保管してください。
2. 顕微手術器具(図1A、B)を術野にきちんと置きます。汚染された必須器具をすぐに洗浄するために、フラッシュ滅菌キットをすぐに利用できるようにしておいてください。

2. In vivo ラットDCDドナー調製

1. ラットに麻酔をかけ、気管挿管と頸動脈カニューレ挿入を行います。Sprague Dawleyラット(8〜12週齢)を3%イソフルランチャンバーで鎮静し、ケタミン/キシラジン(100/10 mg / kg、筋肉内)で麻酔します。.
2. 気管と右頸動脈を露出させるには、完全に麻酔をかけたラットの仰臥位を置き、アルコールとポビドン溶液で首と胸の前部を洗浄します。.V字型の切開を行い、Vのピークを正中線のラットの顎に近づけ、Vの各肢が対応する肩を指すようにします。皮下組織から皮膚を分離し、皮膚を胸に裏返して首のストラップ筋を露出させます(図2A)。
   1. 正中線ストラップ筋(胸骨乳様突起筋と胸骨舌骨筋)を鉗子で分離して気管を露出させることにより、ラットに挿管します(図2B)。気管を5-0シルクで囲み、気管リング間の筋肉組織を部分的に分割して開きます。
   2. 14 Gの血管カテーテルを気管に挿入し、5-0シルクで固定します(図2C)。血管カテを人工呼吸器に接続します(90呼吸/分で1 mL / kg)。
   3. 右頸動脈カニューレ挿入術の場合は、総頸動脈(気管と平行ですぐに右側にある)を特定し、首の全長まで慎重に分離し、遠位(頭蓋)の端を5-0シルクで結びます。
   4. 頸動脈のカニューレ挿入を容易にするために、牽引のためにタイの自由端に止血器を取り付けます。
   5. 頸動脈の近位端(首の付け根に向かって)を動員し、血管止血剤を使用してクランプします。手術用顕微鏡で、マイクロアイリスハサミを使用して、頸動脈を最も遠位端の前方に部分的に分割することにより、頸動脈を開きます。頸動脈を22G血管カテでカニューレし、5-0シルクタイで固定します(図2D)。
   6. 血管腫に三元フローストップコックアダプターを取り付けて、薬物や心臓麻痺溶液を頸動脈に簡単に送達し、圧力センサーに接続してDCDプロセス中の心拍数と圧力を監視します(図2D)。近位血管クランプが解放されると、血液の拍動性逆流に注意する必要があります。
   7. 固定したら、頸動脈カテーテルを圧力センサーに接続し、ヘパリン(1,000 U/Kg)と臭化ベクロニウム(4 mg/kg)を送達します。
   8. DCDプロセスの開始:臭化ベクロニウムを1分間循環させます。動物の苦痛の兆候がないか注意し、必要に応じて追加の麻酔を提供します。人工呼吸器(低酸素症/虚血)を停止して、DCDプロセスを開始します。呼吸活動がないことを観察します。
      注:DCD虚血時間は、人工呼吸器のサポートが引き抜かれた時点から始まります。ラットでは、25 分間の虚血が、重大ではあるが可逆的な損傷をもたらす最大時間として特定されています⁷。圧力トレースは、~3.5分で換気サポートが中断された瞬間から、全身圧力が50mmHg未満に低下し、心臓を効果的に灌流するには不十分と見なされる圧力であることを示しています(図3)。
3. ドナーの心臓調達: 心臓の調達と冷温心麻痺の投与に 4 ~ 7 分を割り当てます。目標の虚血時間である25分を達成するためには、換気サポート終了後18〜21分後に心臓の調達を開始します。
   注:調達時間の長さは、調達を実行する人の経験に基づいて変更してください。
   1. 剣状突起のレベルから始めて、肋骨縁に沿って腹壁を分割し、次に胸郭を両側の胸骨に平行に鎖骨まで分割して、両側の前方開胸術を行います(図4A)。このステップを容易にするために、低倍率(5倍)で手術用顕微鏡を使用します。
   2. 鎖骨にヒンジで固定された分割された胸壁を頭に向けて反転させ、止血器で固定します(図4B)。
   3. 下大静脈(IVC)を5-0シルクで囲み、肝臓のドームの近くでマイクロハサミで部分的に分割します(図4C)。部分的に開いたIVCは、心臓の右側を広げるため、心臓麻痺の出口を可能にします。
   4. 上行大動脈と肺動脈(PA)の間の平面を解剖し、次に、先端が鈍く湾曲した鉗子で横静脈洞を介して肺幹を分離します。マイクロハサミで肺動脈を分岐点の近くで慎重に分割します(図4C)。
   5. 大動脈弓を鈍的解剖で囲みます。これは、小さな直角血管クランプを無名動脈の起点から遠位の大動脈弓を横切って配置するためのアクセスを可能にするためです。
   6. 人工呼吸器の終了から25分のマークで、大動脈弓をクランプし、手動で心臓麻痺(ウィスコンシン大学の溶液10 mLを4°Cで2〜3分かけて)を頸動脈カテーテル(図4D)を通じて送達します。
   7. マイクロハサミを使用して、大動脈弓の手前で上行大動脈を遠位に分割します(図4E)。
   8. IVCを5-0シルクで心臓に向けて結び、遠位に分割します。
   9. 肺静脈と上大静脈(SVC)を5-0シルクと一緒に結紮します(図4F)。これらのネクタイは大量の組織を保持するため、器具のネクタイよりも手のネクタイが好まれます。綿先綿棒で心臓を腹部に向かってそっと引き下げ、心房付属器をネクタイに束ねずに肺静脈結紮を促進します。
   10. マイクロアイリスハサミで肺静脈を分割し、心臓を採取し、氷冷した生理食塩水に入れます(図4G)。

3. in vivo ラットDCDヘテロトピア性心移植

1. イソフルランチャンバー(3%誘導)でレシピエントを鎮静させ、腹部の髪をクリップし、ポビドンとアルコールでその領域を洗浄します。.レシピエントを抗凝固させないでください。これは、吻合からの過度の出血と移植片の失敗につながります。
2. ラットの仰臥位を加熱パッドの上に置きます。ラットと加熱パッドの間にプローブを配置して、温度を監視します。ラットの体温を38°Cに保ちます。 ラットの腹部の両側に、温かい生理食塩水またはガラスビーズを充填した50mLの滅菌済み遠心チューブを2本置き、ラットを暖かく保ちます。
3. 上記の手順にもかかわらず、体温が37.5°C未満に下がった場合は、室温(RT)を上げ、オートクレーブ滅菌されたアルミホイルを使用して体の露出部分をすべて覆い、腹部手術を行うのに十分な領域を残します。
4. ノーズコーンを介して3%イソフルランで全身麻酔を誘発し、徐々に2%まで減少させます。.
5. linea-albaに沿って腹部を開き(図5A)、腹壁リトラクターを配置して作業スペースを露出させます(図5B)。
6. 滅菌綿チップアプリケーターを使用して、拡張した結腸または完全な結腸を移動させ、オペレーターの左側にある温かく湿ったガーゼに入れ、温かい(38°C)生理食塩水で定期的に洗浄します(図5C)。結腸を脇に動かすと、DCD心臓は非常に硬く、腹部に収容するために追加のスペースが必要なため、DCD心臓により多くのスペースが提供されます。
7. 綿先綿棒を使用して鈍い解剖で正中線の後腹膜を開きます。腎下大動脈とIVCを露出させます。
8. 非外傷性小児多角度血管クランプを使用して、吻合のために腎下大動脈とIVCの3〜5mmを分離します(図5D)。
9. 100単位のヘパリンを混合した生理食塩水で満たされた^1cm3 シリンジに30Gの針を取り付けて大動脈に入ります。0.2〜0.3mLの溶液でフラッシュします(図5E)。ヘパリンが吸収され、縫合線からの出血を引き起こす可能性があるため、滅菌綿チップアプリケーターで余分な溶液を軽くたたきます。
10. マイクロハサミを使用して、ドナーの大動脈のサイズに合わせて長軸に沿って大動脈を開きます。この時点ではIVCは開かず、IVCと大動脈の間に平面を作ろうとはしません。これは出血につながります。
11. 吻合中のドナーの心臓の適切な向きは重要です(図5F).右心室の前面が天井を向いており、頂点がオペレーターの右側を指し、ドナー大動脈が肺動脈よりわずかに低くなるように、吻合のためにドナー心臓を向けます。この向きにより、肺動脈吻合部への緊張が軽減されます。
    1. 大動脈吻合:微小血管吻合には、先の尖った針ドライバーと精密ピンセットを使用します。8-0で吻合を行います0.3mmの先端ニードルホルダーに装填されたテーパー状の4mm針にモノフィラメント縫合糸を装着し、ニードルドライバーロックを取り外して、ロックおよびロック解除時の偶発的な組織外傷を防ぎます。
    2. 大動脈吻合の6時位置にステー縫合糸を留置します。これは、対称的で止血性の縫合ラインを提供するために行われます。次に、12時の位置から、ドナー大動脈の外側から内側へ、レシピエント大動脈の内側から外側に吻合を開始します(図6A、B)。作業用縫合糸は5〜7cmのみ保持し、残りは切り捨てます。
    3. 反時計回りに動き、6時の位置に向かって短い距離を移動し、心臓を左に反転させて12時の位置まで反時計方式で吻合を完了します(図6C)。
    4. 結ぶ前に縫合線が緩んでいないか確認してください。
       注:安全な吻合は対称的である必要があり、隙間なくドナーとレシピエントの内膜に近似する必要があります。
    5. 肺動脈吻合:肺動脈を大動脈から解放し、ねじれなくIVCに吻合の向きを合わせます。ドナーの心臓を満たすためにレシピエントの血液量を準備し、3〜5 mLの皮下(首のうなじ)生理食塩水を注射して低血圧を回避します。
    6. ラットの呼吸パターンを監視し、肺動脈吻合が完了に近づいているため、イソフルランを2.0%から1.5%に減らします。.
    7. 大動脈吻合に関連してIVCセファラッドをマイクロ虹彩ハサミで開きます(図6C)。0.2〜0.3mLの生理食塩水を使用してIVCを洗い流します。少数の血栓が見られます。それらを慎重に洗い流します。
    8. 大動脈吻合とは異なり、滞在縫合なしで肺吻合を開始します。露出を妨げます。12時の位置から開始し、針をドナー肺動脈の外側から内側に、レシピエントIVCを内側から外側に移動します。縫合糸を結び、まず後壁の吻合を時計回りに完了します。
    9. 6時の位置になったら、12時の位置に達するまで時計回りに縫合を続け、前のタイの縫合糸の短い方の端に結びます。狭窄すると心臓からの静脈ドレナージが制限されるため、吻合を締めないように注意してください。平均して、両方の吻合を完了するのに30分以内かかります。
    10. 針穴からの出血を封じ込めるために、吸収性止血剤の小片を吻合の上に置きます。
    11. 血管のクランプを解除し、必要に応じて針穴に吸収性止血剤を追加します(図6E)。移植された心臓は、リズミカルな呼吸を再開する前に、時折細動を伴って鼓動を開始します。心臓が鼓動し、明らかな出血がない限り、吸収性止血剤を5分間そのままにしておきます。
    12. 止血に満足したら(3~5分)、滅菌綿チップアプリケーターを使用して余分な吸収性止血剤を取り除き、生理食塩水で洗浄し、腸を腹腔に戻します(図6F)。止血を助けるために、大網を吻合の上に置きます。
    13. 最初にlinea albaを閉じ、次に皮膚を閉じることにより、13 mmの切断針に5-0 monocrylを使用して腹壁を2層に閉じます(図6G、H)。

4. 復旧と監視

1. 腹部閉鎖が完了したら、回復のために暖かいパッドでラットを腹に向けます。ノーズコーンを介してイソフルランを1%で5分間続け、その後停止します。.
2. 自発呼吸が規則的になったら、ラットを清潔な回復ケージに移し、暖かいパッドの上に置いて回復プロセスを続けます。ラットの突然の動きは、出血のリスクや吻合のねじれを引き起こします。手術開始前に長時間作用型鎮痛薬を投与することで、スムーズな回復過程を大いに促進します。

5. 制御鼓動心臓の調達と移植

1. 虚血がない場合のドナー心臓の質を評価するためのコントロールとして、コントロールビートハートドナー(CBD)心臓を調達します。
   注:CBDドナーは、換気サポートの終了を除いて、DCD心臓について説明したすべての手順を経ます。CBDの心臓は、鼓動しながら調達され、人工呼吸器で完全に支えられます。心臓麻痺の投与は心臓を停止し、DCD心臓の場合と同様に調達と移植が完了します。

6.移植された心機能評価:

1. 心臓移植時から所定の間隔(24時間から14日)で、レシピエントラット(3%吸入イソフルラン)に麻酔をかけ、温かいパッド仰臥位に置き、腹部切開を開いて移植した心臓を露出させます。
2. 左心室の頂点にバルーンチップカテーテルを留置し、発達圧力(DP)、最大+dP/dt、および最小-dP/dtを測定します。
   注:ここでは、PowerLabステーションを血圧記録のデータ収集システムとして使用しました。

異所性心臓移植の24時間から14日後、腹部を再度開き、心臓を露出させて左心室によって発達した圧力を測定することができます。DCD(またはCBD)心臓の左心室にバルーンチップカテーテルを挿入し、発達圧力(DP)、最大+dP/dt、および最小-dP/dtを測定します。 図7 は、移植後24時間後のCBD心臓と比較したDCD心臓の予想されるDP、+dP/dt、および-dP/dtの例を示しています。CBD心臓と比較して、DCD心臓のDPは大幅に低下し、+dP/dt(max)と-dP/dt(min)が悪化しました。

図1:異所性ラット心臓移植に使用される微小血管器具( 1)先端が湾曲した鉗子。(2)ストレートチップのアイリスマイクロはさみ。(3)高精度のポイントを備えたピンセット。(4)Ebakey非外傷性小児多角度血管クランプ;(5)ロック機構を取り外したニードルホルダー。(6)マイクロハサミ、直角および湾曲した先端。(7)重い血管クランプ;(8a)縫合糸に大きなペーパークリップを使用した、オートクレーブ可能な湾曲した手成形腹部壁リトラクター(正面図)。(8b)オートクレーブ可能な湾曲した手成形腹部壁リトラクター(側面図)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ドナー挿管と頸動脈カニューレ挿入の段階的な説明(A)ハサミで首の上の皮膚を切除し、軟部組織を露出させる。(B)鈍的解剖技術を使用して、気管と右頸動脈が露出します。(C)気管に横切開を行い、気管チューブを挿入して人工呼吸器に接続して固定します。(D)瀉血カテーテルを右頸動脈に挿入して固定し、三方活栓でチューブラインに接続します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:DCDプロセス中の全身動脈圧記録の例。 動脈圧の測定には頸動脈カテーテルを使用しました。圧力と時間は、それぞれY軸とX軸に報告されます。矢印は、換気支持の終了の瞬間と、平均全身圧力が30mmHgを下回った時間を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ドナー心臓の調達の段階的な説明(A)頸動脈カニューレは、麻痺剤とヘパリンを送達するために使用されます。適切なDCDまたはCBDプロトコルに従って、外側開胸術が行われます。(B)前胸部を頭の上でひっくり返して、大動脈弓と主要な胸部血管を適切に露出させます。(C)肺動脈はできるだけ遠位に切断されます。下大静脈は、右心室を減圧するために切り込まれます。(D)大動脈弓は、無名動脈と総頸動脈の間に固定されています。氷のように冷たい心臓麻痺は、瀉血カテーテル/頸動脈アクセスを使用して心臓に送達されます。(E)上行大動脈はアーチの下に切断され、下大静脈は右心房の近位に結紮されます。(F)心臓の背面に縫合ループが作成され、上大静脈と肺静脈を閉じます。胸部血管が切断されています。(G)胸部血管から分離された心臓と結合組織は、氷のように冷たい生理食塩水に保存されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:レシピエント調製の段階的な説明(A)腹部の皮膚と筋肉層は、正中線に沿って縦方向に切断されています。(B)腹部の臓器が露出している。ティッシュリトラクターは腹部の開口部を広げます。(C)Qチップは、空洞の背面を露出させ、下大静脈と腹部大動脈を洗浄するために使用されます。(D)U字型の血管クランプが腹部大動脈と下大静脈を閉塞します。(E)腹部大動脈に30Gの針で穴を開けます。マイクロハサミは、縦方向の大動脈切開術を作成するために使用されます。(F) ドナーの心臓大動脈は、レシピエント腹部大動脈の開口部の隣に整列しています。8-0Prolene縫合糸は、吻合を開始するために使用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:異所性心臓移植、心臓の蘇生、および外科的処置の完了の段階的な説明(A)ドナー大動脈を所定の位置に固定するために12時方向のステッチが配置されます。(B)ドナーとレシピエント大動脈との間の連続縫合が向こう側で開始されます。(C)大動脈吻合が完了し、マイクロハサミを使用して縦方向の静脈切開術を作成します。(D) ドナーの肺動脈は、静脈切開術の隣に整列し、12 時のステッチで固定されます。吻合を完了するために、連続縫合糸が使用されます。(E)U字型の血管クランプを取り外し、心臓を再灌流します。(F)Qチップは、腸を腹腔内に再分配するために使用されます。(G)5-0ナイロン縫合糸を使用して腹壁と皮膚を閉じます。(H)縫合プロセスが完了した後、動物は手術から回復します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:移植後24時間(N = 5 /グループ)のラットで測定された発達圧力(DP)、+ dP / dt(最大)、および-dP / dt(最小)の例。*p < 0.05.CBD心臓と比較して、DCD心臓のDP、+dP/dt(max)、-dP/dt(min)は大幅に減少しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

DCDヘテロトピアラットHTxを成功させるためには、実験の細心の注意を払って思慮深いセットアップを確立することが重要です。詳細なセットアップでは、1)若いラットをDCDドナーとして選択する、2)イソフルランを麻酔薬として選択すること、3)ドナーの心臓に心臓麻痺を効果的に送達すること、4)ドナーの心臓を氷冷溶液で保存すること、5)腰部血管を損なうことなく腹部解剖を制限し、腎下大動脈と大静脈のみを露出させることなど、いくつかの要素を考慮に入れています。 6)手術中および手術後にレシピエントの体温を維持する、7)吻合のためにIVCと大動脈を分離できる無血管クランプを利用する、8)レシピエント腹部に硬いDCDドナー心臓のための十分なスペースを確保する、9)微小血管器具の選択、10)レシピエントの抗凝固療法を避ける、11)細心の止血吻合、 12)手術からのスムーズな回復のための先制鎮痛を提供します。ここで説明するプロトコルは、結果を正常に再現するためのすべてのステップの詳細を提供します。

ここで述べるDCDラットHTx法は、1964年にアボット社が初めてマウスHTxを記載して以来、文献に記載されたヘテロトピアHTxを改善するための修正を採用してきた¹⁰。上記のプロトコルの重要な変更には、麻酔薬の選択が含まれます。麻酔薬としてのイソフルランは、監視が容易で、麻酔の所望の深さに調整することができます。アボットが最初に説明したエンドツーエンドの吻合技術よりも、ドナーの心臓大動脈と肺動脈の側から側の吻合をレシピエントの腹部大動脈と下大静脈に適応させることで、術後対麻痺と死亡率の高さが排除されました。腰部血管を損傷し、対麻痺のリスクがある大動脈の円周方向の解離を避けるために、腹部大動脈と大静脈を分離するための非外傷性血管クランプの使用が好ましい。対麻痺のリスクを減らすだけでなく、血管クランプの使用は時間効率が高く、止血性にも優れています。代謝老廃物や毒素は、DCD心臓の虚血性損傷後に必ず蓄積するため、調達時に心臓を洗い流す効果的な戦略が必要です。右頸動脈を効果的にカニューレし、腕頭動脈の離陸に対して遠位の大動脈弓をクランプすることにより、DCD心臓への保存液の効果的な送達と代謝老廃物の洗い流しが達成されます。血管吻合が予想される完了の10分前に皮下生理食塩水(1 mL / 100 g)を日常的に投与すると、吻合中に作られた針穴からの予想される失血と、再灌流時にドナーの右心房と心室を満たすために必要な血液量が先手を打って補充されます。これにより、血管クランプの解放時に発生する可能性のある低血圧を回避し、移植された心臓とレシピエントラットの効果的な再灌流のリスクを冒します。手術開始前に長時間作用型鎮痛剤ブプレノルフィンを投与することで、レシピエントのスムーズな回復が可能になります。適切な疼痛管理がなければ、レシピエントラットは活発に動き、脆弱な血管吻合の止血を危険にさらす可能性があります。プロトコルに記載されているいくつかの要因に細心の注意を払うことで、DCD心臓移植プロセス1,7,11,12,13が成功します。

DCDラットHTx法の主な制限、および文献に記載されている他のすべてのマウスHTxモデルの主な制限は、移植された心臓6,7,11,12,13の非機能状態である。将来、現在のモデルを動作する心臓モデルに変換するために必要な修正が研究されています。他の制限は、レシピエントからのドナー心臓に対する免疫学的反応です。この制限は、移植に同系ラットを使用することで簡単に克服できます。同系ラットを用いたいくつかのラットDCD HTxが成功裏に行われており、その日常的な使用は、同系ラットの調達コストが高いために制限されています。CBDの心臓とは異なり、DCDの心臓は、レシピエントの体内で再灌流しても鼓動を再開しません。しかし、冠状動脈の血流が確立され、そのかなりの量が冠状静脈洞から排出されるときに心臓の右側に溜まります。この血液が停滞したままの場合、血液は凝固し、移植片は失敗します。したがって、綿の先端アプリケーターを使用して右側の心室を機械的に空にすることを推奨します 右心室の表面上を転がして下大静脈に向かって。冠状動脈がドナーの心臓内を流れ続け、膨張を防ぐことで、1〜2分で鼓動を再開することができます。レシピエントの腹部大動脈/大静脈へのドナー心臓の吻合中、レシピエントの下半身は腎下大動脈の閉塞から虚血性(20〜30分)のままです。内臓とは異なり、手足は明白な損傷なしに、より長い期間(2〜3時間以上)の虚血に耐えることができます。それにもかかわらず、再灌流された肢からのサイトカインの放出が移植された心臓に影響を与える可能性が非常に高いです。移植された移植片の機能は、再灌流時からより短い期間で評価された場合、サイトカインの放出によって影響を受ける可能性があります。サイトカインの放出は急性期の反応であるため、移植された心機能に対するサイトカインの長期的な影響は最小限に抑えられます。

臨床DCDプロセスに似たラットin vivo DCD心臓ドナーモデルを確立することは、移植のためのドナー心臓プールの拡大に焦点を当てた研究に大きく貢献します。この発表に先立ち、既存の方法では、まずランゲンドルフ系に鼓動する心臓を配置し(ex vivo)、次に流れを止めてDCDプロセスを開始することにより、全体的な虚血を利用していました⁶。したがって、ex vivo 虚血モデルには、臨床 DCD プロトコル⁵ で観察されるように、in vivo プロセスと比較していくつかの違いがあります。ここで説明するDCDモデルは、臨床的なDCDプロセスによく似ており、DCD心臓の再灌流障害を軽減することを目的とした要因をテストする上でより大きな有用性を持っています。

既存の臨床DCDプロトコルは、DCDドナーが死亡したと宣告されるまで、臓器調達を促進するために設計された物理的または薬理学的介入は許可されない「死亡ドナールール」に厳密に従っています。そのため、DCD提供では、さまざまな臓器、特に心臓への温かい虚血が避けられません。臨床 DCD プロセスを念頭に置くと、ここで説明するラット DCD HTx モデルでは、完全な心収縮不全 (死亡) 後、25 分間の温かい全身虚血の後でのみ、ドナー心臓の灌流が許可されます。ラットDCDモデルで研究できる重要な介入は、虚血および再灌流による総損傷の最大50%を占める可能性のある再灌流障害を標的とすることに焦点を当てるべきである¹⁴。再灌流を緩和するために、ミトコンドリア内の電子伝達鎖、インフラマソームモジュレーター、およびミトコンドリア透過性遷移細孔安定剤¹⁵を標的として、調達時にDCD心臓に送達される再灌流保存液に傷害剤を添加することができる。Na/Hポンプ阻害剤、灌流剤の酸性化、NO発生剤、エリスロポエチン、メラトニンなど、 ex vivo 全球虚血モデルで研究されている他の薬剤は、ここで説明するDCD HTxモデルを使用して in vivo で研究できます。現在、臨床診療では、虚血の持続時間が 30 分を超えることは、臨床試験プロトコルであっても、DCD 心臓の調達に対する禁忌です。おそらく、ここで説明したDCDラットHTxモデルを利用した研究を厳密に実施することで、科学界は、いつの日か、より長い虚血期間で臨床DCD HTxを行うことを可能にする介入を提案するかもしれません。

この原稿の著者には、開示すべき利益相反はありません。

この研究は、モハメッド・クアダー博士に授与されたメリットレビュー助成金(1I01 BX003859)と、ポーリーハートセンターからモハメッド・クアダー博士とステファノ・トルド博士への資金によって支援されました。