Ein heterotopes Rattenherztransplantationsmodell unter Verwendung von Spenderherzen mit Kreislauftod

Im Folgenden beschreiben wir die Vorbereitung und die technischen Details der murinen heterotopen Herztransplantation mit einem zirkulatorischen Spenderherzen.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein heterotopes Herztransplantationsmodell für Ratten mit Spende von Spenderherzen nach Kreislauftod (DCD) einzurichten. Es gibt zwei Setups für dieses Protokoll: die Einrichtung des Herzspenders und die Einrichtung des Empfängers. Bei der Herzspendereinrichtung werden Sprague Dawley-Ratten anästhesiert, endotracheal intubiert und beatmet. Die rechte Halsschlagader wird kanüliert, um Heparin und das Lähmungsmittel Vecuronium-bromid abzugeben. Der DCD-Prozess wird durch das Beenden der Lüftung eingeleitet. Nach 20 min wird das Herz freigelegt und die Aorta distal zum brachiozephalen Ast geklemmt. 25 Minuten nach Beendigung des Beatmungsgeräts wird eiskalte Lösung der University of Wisconsin (UW) durch den Karotiskatheter perfundiert, um das Herz zu spülen. Das Herz wird durch Teilung der Aorta, der Lungenarterie, der Hohlvenen und der Lungenvenen gewonnen und zur Implantation in UW-Lösung gelagert. Im Empfänger-Setup wird die Lewis-Ratte mit Isofluran betäubt. Buprenorphin mit langsamer Freisetzung wird subkutan verabreicht, um eine reibungslose postoperative Genesung zu ermöglichen. Durch einen Mittellinienschnitt werden die infrarenale Aorta und die untere Hohlvene isoliert und mit einer atraumatischen Gefäßklemme abgeklemmt. Die Herzaorta und die Lungenarterie des Spenders werden mit der Bauchaorta bzw. der Hohlvene des Empfängers vernäht, wobei ein laufendes 8-0 Prolen. Die Gefäßklemme wird entfernt, um das Herz zu reperfundieren. Die Bauchdecke wird geschlossen und die Ratte geborgen. Nach einem festgelegten Intervall (24 h bis 2 Wochen) wird die Empfängerratte anästhesiert, das transplantierte Herz freigelegt und ein Ballonspitzenkatheter über die Spitze in den linken Ventrikel eingeführt, um den entwickelten Druck und dP/dt mit Hilfe eines Datenerfassungssystems aufzuzeichnen. Das Herzgewebe wird für die Histologie, Immunologie oder molekulare Analyse entnommen. Ein erfolgreiches DCD-Spenderherztransplantationsmodell für Ratten wird weitere Studien zu den kardioprotektiven Ansätzen zur Verbesserung der Herztransplantationsergebnisse von DCD-Spendern ermöglichen.

Ein Kleintiermodell für die Herztransplantation (HTx) ist entscheidend für die Durchführung von Forschungen zur Untersuchung der pathophysiologischen Bedingungen, die das transplantierte Herz beeinflussen. Heterotopes HTx in einem Mausmodell, wie es von Oto und Lindsey beschrieben wurde, ermöglichte es den Forschern, die pathophysiologischen Veränderungen zu untersuchen, die bei den Bedingungen von Ischämie und Reperfusion beobachtet wurden¹. Traditionell wurden Spenderherzen für die Transplantation von Spendern mit schlagendem Herzen beschafft, die auch als Spender nach Hirntod (DBD) bezeichnet werden. Die Zahl der Patienten, die^{HTx 2} benötigen, ist jedoch überproportional gestiegen. In jüngerer Zeit wurden Herzen von Spendern mit Kreislauftod, auch bekannt als Spende nach dem Kreislauftod (DCD), für die Transplantation in experimentellen Umgebungen^{verwendet 3}. Der Hauptunterschied zwischen DBD- und DCD-Spenderherzen besteht darin, dass die Herzen bei letzteren unterschiedlich langen Ischämien ausgesetzt sind, was ihre Verwendung in der routinemäßigen HTx-Praxis ausschließt.

Die zuvor beschriebene Literatur über murines heterotopes HTx hat nur Spenderbedingungen am schlagenden Herzen^{verwendet 4,5,6}. Die heterotope DCD-Herztransplantation erfordert subtile Modifikationen, ohne die das transplantierte Herz nicht^{schlägt 7}. Dieses Protokoll zielt darauf ab, den Lesern eine verfeinerte Technik von DCD HTx bei Ratten vorzustellen. Die globale myokardiale Ischämie ist der DCD-Organspende angeboren. Ein Versuchsaufbau, der die globale myokardiale Ischämie nachahmt, wurde nur im ex vivo Aufbau untersucht⁵. Die Ergebnisse aus Ex-vivo-Studien lassen sich möglicherweise nicht auf die DCD-HTx-Arbeit übertragen, da signifikante Unterschiede zwischen in vivo (DCD) und ex vivo globalen Ischämiemodellen bestehen⁵. Die Ergebnisse oder das Fehlen solcher Ergebnisse von Interventionen zur Milderung der Reperfusionsmyokardischämie in ex vivo-Modellen sind im DCD HTx-Modell möglicherweise nicht reproduzierbar. Daher ist es unerlässlich, das humane DCD HTx in einem Tiermodell zu simulieren, dessen Erkenntnisse einen höheren translationalen Wert haben können. Das hier beschriebene DCD HTx-Modell wird es dem Forscher ermöglichen, das klinische DCD HTx genau zu simulieren und die Möglichkeit zu bieten, Reperfusionsschäden durch Interventionen sowohl im Spenderherz als auch im Empfänger zu mildern. Nach der Genesung der Empfängerratte können die Funktion, die Histopathologie und die Immunologie des transplantierten Herzens in unterschiedlichen Abständen ab dem Zeitpunkt der Transplantation untersucht werden.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, der von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde (NIH-Veröffentlichung Nr. 86-23, überarbeitet 2011)⁸. Die folgenden Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Virginia Commonwealth University genehmigt. Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der OSHA (Occupational Safety and Health Administration) und den empfohlenen sterilen Techniken durchgeführt⁹. Die Sprague Dawley-Ratten wurden unter kontrollierter Luftfeuchtigkeit bei einer Temperatur von 23 °C und 12 Stunden Dunkel-/Hell-Zyklen untergebracht.

1. Aufbau des Labors

HINWEIS: Weisen Sie einen speziellen Raum für die Durchführung steriler Überlebensoperationen an Nagetieren mit einem Operationsmikroskop zu. Halten Sie die Umgebungstemperatur des Operationssaals so warm wie möglich. Die Verwendung von Wärmekissen sowohl für die Operation als auch für den Genesungsprozess ist unerlässlich, um die Körpertemperatur der Empfängerratte aufrechtzuerhalten.

1. Halten Sie wichtige Vorräte (Materialtabelle), einschließlich Spritzen, normaler Kochsalzlösung 0,9 % (NaCl), Anästhetika (Isofluran, Ketamin/Xylazin), Heparin, Vecuroniumbromid, Konservierungslösung, einen Eiskübel und ein Analgetikum (Buprenorphin mit langsamer Freisetzung) vorrätig und griffbereit.
2. Legen Sie die mikrochirurgischen Instrumente (Abbildung 1A, B) sauber auf das Operationsfeld. Halten Sie ein Flash-Sterilisationsset bereit, um die kontaminierten wichtigen Instrumente sofort zu reinigen.

2. Vorbereitung der In-vivo-DCD-Spende von Ratten

1. Betäuben Sie die Ratte für die Trachealintubation und die Karotiskanüle. Betäuben Sie die Sprague-Dawley-Ratte (8-12 Wochen alt) in einer 3%igen Isofluran-Kammer und betäuben Sie sie dann mit Ketamin/Xylazin (100/10 mg/kg, intramuskulär).
2. Um die Luftröhre und die rechte Halsschlagader freizulegen, legen Sie eine vollständig betäubte Rattenrückenlage auf und reinigen Sie die Vorderseite von Hals und Brust mit Alkohol und Povidonlösung. Machen Sie einen V-förmigen Schnitt, wobei die Spitze des V in der Nähe des Kiefers der Ratte in der Mittellinie liegt und jeder Glied des V auf die entsprechende Schulter zeigt. Trennen Sie die Haut vom Unterhautgewebe und drehen Sie die Haut auf die Brust, um die Gurtmuskulatur des Halses freizulegen (Abbildung 2A).
   1. Intubieren Sie die Ratte, indem Sie die Mittelliniengurtmuskeln (Sternomastoideus und Sternohyoid) mit einer Pinzette trennen, um die Luftröhre freizulegen (Abbildung 2B). Umschließen Sie die Luftröhre mit einer 5-0-Seide und öffnen Sie sie, indem Sie das Muskelgewebe teilweise zwischen den Trachealringen teilen.
   2. Führen Sie einen 14 G Angiokath in die Luftröhre ein und befestigen Sie ihn mit der 5-0 Seide (Abbildung 2C). Schließen Sie den Angiokath an ein Beatmungsgerät an (1 ml/kg bei 90 Atemzügen/min).
   3. Für die Kanülierung der rechten Halsschlagader identifizieren Sie die Arteria carotis communis (sie liegt parallel und unmittelbar auf der rechten Seite der Luftröhre), isolieren Sie sie vorsichtig über die gesamte Länge des Halses und binden Sie das distale (kraniale) Ende mit einer 5-0-Seide ab.
   4. Befestigen Sie ein Blutstillmittel am freien Ende des Kabelbinders, um die Traktion zu ermöglichen und die Kanülierung der Halsschlagader zu erleichtern.
   5. Mobilisieren Sie den proximalsten Aspekt der Halsschlagader (in Richtung der Halswurzel) und klemmen Sie ihn mit einem Gefäßhämostaten ab. Verwenden Sie unter einem Operationsmikroskop eine Mikro-Irisschere, um die Halsschlagader zu öffnen, indem Sie sie am distalsten Ende teilweise nach vorne teilen. Kanülieren Sie die Halsschlagader mit einem 22 G Angiokath und sichern Sie sie mit einer 5-0 Seidenkrawatte (Abbildung 2D).
   6. Befestigen Sie einen Drei-Wege-Durchflusshahnadapter am Angiokath zur einfachen Abgabe von Medikamenten oder Kardioplegielösung in die Halsschlagader und schließen Sie ihn an einen Drucksensor an, um die Herzfrequenz und den Druck während des DCD-Prozesses zu überwachen (Abbildung 2D). Ein pulsierender Rückfluss des Blutes sollte bemerkt werden, wenn die proximale Gefäßklemme gelöst wird.
   7. Sobald er gesichert ist, schließen Sie den Katheter der Halsschlagader an den Drucksensor an und geben Sie Heparin (1.000 U/kg) und Vecuroniumbromid (4 mg/kg) ab.
   8. Einleitung des DCD-Prozesses: Lassen Sie das Vecuroniumbromid 1 min zirkulieren. Achten Sie auf Anzeichen von Leiden der Tiere und führen Sie bei Bedarf eine zusätzliche Narkose durch. Stoppen Sie das Beatmungsgerät (Hypoxie/Ischämie), um den DCD-Prozess zu starten. Auf das Fehlen von Atmungsaktivität achten.
      HINWEIS: Die ischämische Zeit der DCD beginnt ab dem Zeitpunkt, an dem die Beatmungsunterstützung zurückgezogen wird. Bei Ratten wurde eine Ischämie von 25 Minuten als die maximale Zeitdauer identifiziert, die zu einer signifikanten, aber reversiblen Verletzung führt⁷. Die Druckverfolgung zeigt, dass ab dem Zeitpunkt der Unterbrechung der Beatmungsunterstützung bei ~3,5 min der systemische Druck auf unter 50 mmHg abfällt, einen Druck, der als unzureichend angesehen wird, um das Herz effektiv zu perfundieren (Abbildung 3).
3. Beschaffung des Spenderherzs: Planen Sie ~4-7 Minuten für die Entnahme des Herzens und die Verabreichung der kalten Kardioplegie ein. Um die angestrebte Ischämiezeit von 25 Minuten zu erreichen, beginnen Sie mit der Entnahme des Herzens nach 18-21 Minuten nach Beendigung der Beatmungsunterstützung.
   HINWEIS: Ändern Sie die Dauer der Beschaffungszeit basierend auf der Erfahrung der Person, die die Beschaffung durchführt.
   1. Teilen Sie die Bauchdecke entlang des Rippenrandes, beginnend auf Höhe des Xiphoids, und teilen Sie dann den Brustkorb parallel zum Brustbein auf beiden Seiten bis zu den Schlüsselbeinen, um bilaterale anteriore Thorakotomien durchzuführen (Abbildung 4A). Verwenden Sie ein Operationsmikroskop mit geringer Vergrößerung (5x), um diesen Schritt zu erleichtern.
   2. Drehen Sie die geteilte Brustwand, die an den Schlüsselbeinen angelenkt ist, in Richtung Kopf und sichern Sie sie mit einem Blutstiller (Abbildung 4B).
   3. Umschließen Sie die untere Hohlvene (IVC) mit einer 5-0-Seide und teilen Sie sie dann teilweise mit einer Mikroschere in der Nähe der Leberkuppel (Abbildung 4C). Die teilweise geöffnete IVC ermöglicht den Austritt von Kardioplegie, da sie die rechte Seite des Herzens dehnt.
   4. Präparieren Sie die Ebene zwischen der aufsteigenden Aorta und der Lungenarterie (PA) und isolieren Sie dann den Lungenstamm über den Sinus transversum mit einer gekrümmten Pinzette bis zu seiner Bifurkation. Teilen Sie die Lungenarterie vorsichtig mit einer Mikroschere in der Nähe ihres Bifurkationspunktes (Abbildung 4C).
   5. Umschließen Sie den Aortenbogen mit einer stumpfen Dissektion. Dies dient dazu, den Zugang für eine kleine rechtwinklige Gefäßklemme zu ermöglichen, die distal des Aortenbogens zum Ursprung der Arteria innominatis platziert werden kann.
   6. 25 Minuten nach Beendigung des Beatmungsgeräts klemmen Sie den Aortenbogen ein und führen Sie die Karoplegie (10 ml Lösung der University of Wisconsin bei 4 °C, über 2-3 Minuten) manuell durch den Karotiskatheter ein (Abbildung 4D).
   7. Teilen Sie mit einer Mikroschere die aufsteigende Aorta distal vor dem Aortenbogen (Abbildung 4E).
   8. Binden Sie die IVC in Richtung Herz mit 5-0 Seide ab und teilen Sie sie distal.
   9. Ligate die Lungenvenen und die Vena cavae superior (SVCs) zusammen mit 5-0 Seide (Abbildung 4F). Da diese Krawatten eine große Menge an Gewebe enthalten, wird ein Handbinder einem Instrumentenbinder vorgezogen. Ziehen Sie das Herz mit einem Wattestäbchen vorsichtig in Richtung Bauch, um die Lungenvenenligatur zu erleichtern, ohne die Vorhofanhänge in die Krawatte zu bündeln.
   10. Teilen Sie die Lungenvenen mit einer Mikro-Irisschere, sammeln Sie das Herz und legen Sie es in eiskalte normale Kochsalzlösung (Abbildung 4G).

3. In-vivo-DCD-Transplantation des heterotopen Herzens von Ratten

1. Betäuben Sie den Empfänger in einer Isoflurankammer (3% Induktion), schneiden Sie das Haar über den Bauch und reinigen Sie die Region mit Povidon und Alkohol. Antikoagulieren Sie den Empfänger nicht; Dies führt zu übermäßigen Blutungen aus den Anastomosen und zum Versagen des Transplantats.
2. Lege die Rückenlage der Ratte auf ein Heizkissen. Platzieren Sie eine Sonde zwischen der Ratte und dem Heizkissen, um die Temperatur zu überwachen. Halten Sie die Körpertemperatur der Ratte bei 38 °C. Legen Sie zwei vorsterilisierte 50-ml-Zentrifugenröhrchen, die mit warmer Kochsalzlösung oder Glasperlen gefüllt sind, auf beide Seiten des Bauches der Ratte, um die Ratte leichter warm zu halten.
3. Wenn die Körpertemperatur trotz der oben genannten Schritte auf unter 37,5 °C sinkt, erhöhen Sie die Raumtemperatur (RT) und decken Sie alle exponierten Bereiche des Körpers mit autoklavierter Aluminiumfolie ab, um gerade genug Platz für die Durchführung von Bauchoperationen zu lassen.
4. Induzieren Sie eine Vollnarkose mit 3 % Isofluran über einen Nasenkonus und verringern Sie sie allmählich auf 2 %.
5. Öffnen Sie den Bauch entlang der Linea-alba (Abbildung 5A) und legen Sie den Arbeitsbereich frei, indem Sie Bauchwandretraktoren platzieren (Abbildung 5B).
6. Bewegen Sie den erweiterten oder vollen Dickdarm mit sterilen Wattestäbchen-Applikatoren und legen Sie ihn in eine warme, feuchte Gaze links vom Bediener, wobei Sie ihn regelmäßig mit warmer (38 °C) Kochsalzlösung spülen (Abbildung 5C). Das Verschieben des Dickdarms zur Seite bietet mehr Platz für die DCD-Herzen, da sie sehr steif sind und zusätzlichen Platz benötigen, um im Bauch unterzukommen.
7. Eröffnen Sie das Retroperitoneum in der Mittellinie mit einer stumpfen Dissektion mit Wattestäbchen. Legen Sie die infrarenale Aorta und die IVC frei.
8. Mit einer atraumatischen pädiatrischen Mehrwinkel-Gefäßklemme werden 3-5 mm der infrarenalen Aorta und der IVC für die Anastomose isoliert (Abbildung 5D).
9. Betreten Sie die Aorta mit einer 30-G-Nadel, die auf einer 1 cm 3-Spritze montiert ist, die mit normaler Kochsalzlösung gefüllt ist, die mit 100 Einheiten Heparin gemischt ist. Bündig mit 0,2-0,3 mL der Lösung (Abbildung 5E). Tupfen Sie die überschüssige Lösung mit den sterilen Wattestäbchen-Applikatoren ab, da Heparin absorbiert werden und Blutungen aus den Nahtlinien verursachen kann.
10. Öffnen Sie die Aorta mit einer Mikroschere entlang der Längsachse, um sie an die Größe der Spenderaorta anzupassen. Die IVC ist an dieser Stelle nicht geöffnet, und versuchen Sie nicht, eine Ebene zwischen der IVC und der Aorta zu erstellen. Dies führt zu Blutungen.
11. Die richtige Ausrichtung des Spenderherzens während der Anastomose ist entscheidend (Abbildung 5F). Richten Sie das Spenderherz für die Anastomose so aus, dass die vordere Oberfläche des rechten Ventrikels zur Decke zeigt, die Spitze nach rechts vom Bediener zeigt und die Spenderaorta etwas niedriger als die Lungenarterie ist. Diese Ausrichtung führt zu einer geringeren Spannung der Anastomose der Lungenarterie.
    1. Aortenanastomose: Verwenden Sie bei mikrovaskulärer Anastomose einen spitzen Nadeltreiber und eine Präzisionspinzette. Führen Sie Anastomosen mit 8-0 durch Monofilamentes Nahtmaterial auf einer konischen 4-mm-Nadel, die auf einen 0,3-mm-Spitzennadelhalter geladen ist, wobei die Nadeltreibersperre entfernt wurde, um ein versehentliches Gewebetrauma beim Ver- und Entriegeln zu vermeiden.
    2. Legen Sie eine Haltenaht in der 6-Uhr-Position an der Aortenanastomose an. Dies geschieht, um eine symmetrische und hämostatische Nahtlinie zu erhalten. Beginnen Sie dann mit der Anastomose in der 12-Uhr-Position von außen nach innen an der Spenderaorta und von innen nach außen an der Empfängeraorta (Abbildung 6A, B). Behalten Sie nur 5-7 cm Arbeitsnaht und schneiden Sie den Rest ab.
    3. Bewegen Sie sich gegen den Uhrzeigersinn, bewegen Sie sich in kurzen Strecken zur 6-Uhr-Position und schließen Sie dann die Anastomose gegen die Uhr bis zur 12-Uhr-Position ab, indem Sie das Herz nach links drehen (Abbildung 6C).
    4. Überprüfen Sie vor dem Binden auf lose Nahtlinie.
       HINWEIS: Eine sichere Anastomose sollte symmetrisch sein und sich der Intimität von Spender und Empfänger lückenlos annähern.
    5. Pulmonalarterienanastomose: Befreien Sie die Lungenarterie von der Aorta und richten Sie sie für die Anastomose ohne Verdrehungen zur IVC aus. Bereiten Sie das Blutvolumen des Empfängers vor, um das Herz des Spenders zu füllen und Hypotonie zu vermeiden, indem Sie 3-5 ml subkutane (Nacken) normale Kochsalzlösung injizieren.
    6. Überwachen Sie das Atmungsmuster der Ratte und senken Sie den Isofluranspiegel von 2,0 % auf 1,5 %, da die Anastomose der Lungenarterie kurz vor dem Abschluss steht.
    7. Öffnen Sie das IVC-Cephalad in Bezug auf die Aortenanastomose mit einer Mikro-Irisschere (Abbildung 6C). Verwenden Sie 0,2-0,3 ml Kochsalzlösung, um die IVC zu spülen. Es wird eine kleine Anzahl von Blutgerinnseln zu sehen sein; Spülen Sie sie vorsichtig aus.
    8. Im Gegensatz zur Aortenanastomose beginnen Sie die Lungenanastomose ohne Bleinaht. Es wird die Exposition behindern. Beginnen Sie in der 12-Uhr-Position, wobei sich die Nadel von außen nach innen auf der Spender-Lungenarterie und von innen nach außen auf der Empfänger-IVC bewegt. Binden Sie die Naht und schließen Sie zunächst die Rückwandanastomose im Uhrzeigersinn ab.
    9. Sobald Sie sich in der 6-Uhr-Position befinden, fahren Sie mit der Naht im Uhrzeigersinn fort, bis die 12-Uhr-Position erreicht ist, und binden Sie sie dann an das kurze Ende der Naht aus der vorherigen Verbindung. Achten Sie darauf, die Anastomose nicht einzuklemmen, da jede Verengung den venösen Abfluss aus dem Herzen einschränkt. Im Durchschnitt dauert es 30 Minuten oder weniger, um beide Anastomosen abzuschließen.
    10. Legen Sie kleine Stücke eines resorbierbaren Hämostatums über die Anastomose, um Blutungen aus den Nadellöchern einzudämmen.
    11. Löse die Gefäße und füge bei Bedarf mehr resorbierbare Hämostatika über die Nadellöcher hinzu (Abbildung 6E). Das transplantierte Herz beginnt mit gelegentlichem Flimmern zu schlagen, bevor es die rhythmische Atmung wieder aufnimmt. Lassen Sie das resorbierbare Blutstillungsmittel 5 Minuten lang an Ort und Stelle, solange das Herz schlägt und keine offensichtlichen Blutungen auftreten.
    12. Sobald Sie mit der Blutstillung zufrieden sind (~3-5 Minuten), verwenden Sie sterile Wattestäbchenapplikatoren, um das überschüssige resorbierbare Hämostatat zu entfernen, spülen Sie mit Kochsalzlösung und führen Sie den Darm zurück in die Bauchhöhle (Abbildung 6F). Legen Sie das Omentum über die Anastomose, um die Blutstillung zu unterstützen.
    13. Verschließen Sie die Bauchdecke in zwei Schichten mit 5-0 monocryl auf einer 13 mm Schneidenadel, indem Sie zuerst die Linea alba schließen und dann die Haut schließen (Abbildung 6G, H).

4. Wiederherstellung und Überwachung

1. Drehen Sie die Ratte nach Abschluss des Bauchverschlusses auf einem warmen Polster auf den Bauch, um sich zu erholen. Isofluran über einen Nasenkonus bei 1% für 5 min fortsetzen und dann aufhören.
2. Sobald die Spontanatmung regelmäßig ist, bringen Sie die Ratte in einen sauberen Erholungskäfig und legen Sie sie auf ein warmes Polster, um den Erholungsprozess fortzusetzen. Plötzliche Bewegungen der Ratte führen zu einem Blutungsrisiko oder einer Verdrehung der Anastomose. Ein langwirksames Analgetikum, das vor Beginn der Operation verabreicht wird, erleichtert den reibungslosen Genesungsprozess erheblich.

5. Beschaffung und Transplantation des kontrollierenden schlagenden Herzens

1. Beschaffen Sie Kontroll-Spenderherzen (CBD) als Kontrolle, um die Qualität des Spenderherzens ohne Ischämie zu beurteilen.
   HINWEIS: Der CBD-Spender durchläuft alle Schritte, die für das DCD-Herz beschrieben wurden, mit Ausnahme der Beendigung der Beatmungsunterstützung. CBD-Herzen werden während des Schlagens beschafft und an einem Beatmungsgerät vollständig gestützt. Die Verabreichung der Kardioplegie führt zum Stillstand des Herzens, und die Entnahme und Transplantation erfolgen auf die gleiche Weise wie bei DCD-Herzen.

6. Beurteilung der Funktion des transplantierten Herzens:

1. In einem festgelegten Intervall ab dem Zeitpunkt der Herztransplantation (24 h bis 14 Tage) betäuben Sie die Empfängerratte (3% Inhalationsisofluran), legen Sie sie auf ein warmes Rückenpolster und öffnen Sie den Bauchschnitt, um das transplantierte Herz freizulegen.
2. Legen Sie einen Ballonspitzenkatheter über die Spitze des linken Ventrikels, um den entwickelten Druck (DP), den maximalen +dP/dt und den min -dP/dt zu messen.
   HINWEIS: Hier wurde eine PowerLab-Station als Datenerfassungssystem für die Blutdruckmessung verwendet.

24 h bis 14 Tage nach der heterotopen Herztransplantation kann der Bauch wieder geöffnet und das Herz freigelegt werden, um den vom linken Ventrikel entwickelten Druck zu messen. Ein Ballonkatheter wird in den linken Ventrikel des DCD- (oder CBD-) Herzens eingeführt, um den entwickelten Druck (DP), den maximalen +dP/dt und den minimalen -dP/dt-Wert zu messen. Abbildung 7 zeigt ein Beispiel für die erwartete DP, +dP/dt und -dP/dt eines DCD-Herzens im Vergleich zu einem CBD-Herz 24 h nach der Transplantation. Im Vergleich zu den CBD-Herzen war die DP der DCD-Herzen signifikant reduziert und die +dP/dt(max) und -dP/dt(min) verschlechterten sich.

Abbildung 1: Mikrovaskuläre Instrumente für die heterotope Herztransplantation von Ratten. (1) Pinzetten mit gebogenen Spitzen; (2) Iris-Mikroschere mit geraden Spitzen; (3) Pinzette mit einer hochpräzisen Spitze; (4) Ebakey atraumatische pädiatrische Mehrwinkel-Gefäßklemme; (5) Nadelhalter mit entferntem Verriegelungsmechanismus; (6) Mikroschere, rechtwinklige und gebogene Spitzen; (7) Schwere Gefäßklemme; (8a) Autoklavierbare, gebogene, handgeformte Bauchwandretraktoren mit großen Büroklammern an der Naht (Vorderansicht); (8b) Autoklavierbare, gebogene, handgeformte Bauchwand-Retraktoren (Seitenansicht). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Spenderintubation und der Karotiskanülierung. (A) Mit einer Schere wird die Haut über der Halsregion durchtrennt und das Weichgewebe freigelegt. (B) Mit einer stumpfen Dissektionstechnik werden die Luftröhre und die rechte Halsschlagader freigelegt. (C) Es wird ein transversaler Schnitt an der Luftröhre durchgeführt und ein Trachealtubus wird eingeführt, um ihn an ein Beatmungsgerät anzuschließen und zu sichern. (D) Ein Phlebotomiekatheter wird in die rechte Halsschlagader eingeführt, gesichert und mit einem Dreiwege-Absperrhahn an eine Schlauchleitung angeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beispiel für systemische arterielle Druckaufzeichnungen während des DCD-Prozesses. Zur Messung des arteriellen Drucks wurde ein Karotiskatheter verwendet. Druck und Zeit werden auf der Y-Achse bzw. der X-Achse angegeben. Die Pfeile zeigen den Zeitpunkt der Beendigung der Beatmungsunterstützung und den Zeitpunkt an, zu dem der mittlere systemische Druck unter 30 mmHg gefallen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Beschaffung des Spenderherzens. (A) Die Karotiskanüle wird zur Verabreichung eines Lähmungsmittels und Heparins verwendet. Nach dem richtigen DCD- oder CBD-Protokoll wird eine laterale Thorakotomie durchgeführt. (B) Der vordere Brustkorb wird über den Kopf geklappt, um den Aortenbogen und die großen Brustgefäße richtig freizulegen. (C) Die Lungenarterie wird so distal wie möglich durchtrennt. Die untere Hohlvene wird eingekerbt, um die rechte Herzkammer zu dekomprimieren. (D) Der Aortenbogen wird zwischen der Arteria innominatis und der Halsschlagader eingeklemmt. Die eiskalte Kardioplegie wird über den Phlebotomiekatheter/Karotiszugang an das Herz abgegeben. (E) Die aufsteigende Aorta wird unterhalb des Bogens durchtrennt, und die untere Hohlvene wird proximal zum rechten Vorhof ligiert. (F) Auf der Rückseite des Herzens wird eine Nahtschlinge angelegt, um die obere Hohlvene und die Lungenvenen zu verschließen. Die Brustgefäße werden durchtrennt. (G) Das Herz, getrennt von den Brustgefäßen, und das Bindegewebe werden in eiskalter Kochsalzlösung gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Empfängervorbereitung. (A) Die Bauchhaut und die Muskelschicht werden entlang der Mittellinie in Längsrichtung geschnitten. (B) Die Bauchorgane sind freigelegt. Geweberetraktoren erweitern die Bauchöffnung. (C) Wattestäbchen werden verwendet, um die Rückseite der Höhle freizulegen und die untere Hohlvene und die Bauchschlagader zu reinigen. (D) Eine U-förmige Gefäßklemme verschließt die Bauchschlagader und die untere Hohlvene. (E) Die Bauchschlagader wird mit einer 30 G Nadel punktiert. Mit einer Mikroschere wird eine longitudinale Aortotomie angelegt. (F) Die Herzschlagader des Spenders wird neben der Öffnung an der Bauchschlagader des Empfängers ausgerichtet. Ein 8:0 Prolene-Naht wird verwendet, um die Anastomose einzuleiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Schritt-für-Schritt-Beschreibung der heterotopen Herztransplantation, der Herzreanimation und des Abschlusses des chirurgischen Eingriffs. (A) Ein 12-Uhr-Stich wird gesetzt, um die Spenderaorta in Position zu halten. (B) Auf der abgewandten Seite wird eine durchgehende Naht zwischen der Spender- und der Empfänger-Aorta eingeleitet. (C) Die Aortenanastomose ist abgeschlossen und eine Mikroschere wird verwendet, um eine Längsvenotomie zu erstellen. (D) Die Spender-Lungenarterie wird neben der Venotomie ausgerichtet und mit einem 12-Uhr-Stich daran befestigt. Eine durchgehende Naht wird verwendet, um die Anastomose zu vervollständigen. (E) Die U-förmige Gefäßklemme wird entfernt und das Herz wird reperfundiert. (F) Wattestäbchen werden verwendet, um den Darm in die Bauchhöhle umzuverteilen. (G) Eine 5-0-Nylonnaht wird verwendet, um die Bauchdecke und die Haut zu schließen. (H) Nach Abschluss des Nahtvorgangs wird das Tier von der Operation geborgen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Beispiele für entwickelte Drücke (DP), +dP/dt(max) und -dP/dt(min), gemessen an Ratten 24 h nach der Transplantation (N = 5/Gruppe). *p < 0,05. Im Vergleich zu den CBD-Herzen waren die DP, +dP/dt(max) und -dP/dt(min) des DCD-Herzens signifikant reduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Für eine erfolgreiche DCD-heterotope Ratte HTx ist es entscheidend, dass ein sorgfältiger und durchdachter Aufbau des Experiments etabliert wird. Der detaillierte Aufbau berücksichtigt mehrere Faktoren, darunter 1) die Auswahl junger Ratten als DCD-Spender, 2) die Verwendung von Isofluran als Anästhetikum der Wahl, 3) die effektive Abgabe von Kardioplegie an das Spenderherz, 4) die Lagerung des Spenderherzens in eiskalter Lösung, 5) die Begrenzung der Bauchdissektion ohne Beeinträchtigung der Lendenwirbelgefäße, um nur die infrarenale Aorta und die Hohlvene freizulegen, 6) Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des Empfängers während und nach der Operation, 7) Verwendung der avaskulären Klemme, die die Isolierung der IVC und der Aorta für die Anastomose ermöglicht, 8) genügend Platz im Bauch des Empfängers für das steife DCD-Spenderherz, 9) Auswahl der mikrovaskulären Instrumente, 10) Vermeidung einer Antikoagulation des Empfängers, 11) sorgfältige hämostatische Anastomose, und 12) Bereitstellung einer präventiven Analgesie für eine reibungslose Genesung nach der Operation. Das hier beschriebene Protokoll enthält die Details jedes Schritts, um die Ergebnisse erfolgreich zu reproduzieren.

Die hier beschriebene DCD-Ratten-HTx-Methode hat die in der Literatur beschriebenen Modifikationen zur Verbesserung von heterotopem HTx seit der Erstbeschreibung von murinem HTx durch Abbott im Jahr 1964 übernommen¹⁰. Zu den oben beschriebenen kritischen Änderungen des Protokolls gehören die Wahl des Anästhetikums; Isofluran als Anästhetikum ist leicht zu überwachen und auf die gewünschte Anästhesietiefe zu regulieren. Die Anpassung der Anastomose des Spenderherzens und der Lungenarterie an die abdominale Aorta und die untere Hohlvene des Empfängers gegenüber der ursprünglich von Abbott beschriebenen End-to-End-Anastomosentechnik eliminierte die hohe Rate an postoperativer Querschnittslähmung und Mortalität. Um eine zirkumferenzielle Dissektion der Aorta zu vermeiden, die die Lendenwirbel schädigen und eine Querschnittslähmung riskieren kann, wird die Verwendung einer atraumatischen Gefäßklemme zur Isolierung der Bauchschlagader und der Hohlvene bevorzugt. Neben der Verringerung des Risikos einer Querschnittslähmung ist der Einsatz einer Gefäßklemme zeiteffizienter und blutstillender. Da sich Stoffwechselabfälle und Toxine nach einer ischämischen Schädigung in DCD-Herzen ausnahmslos ansammeln, ist eine wirksame Strategie zur Spülung des Herzens zum Zeitpunkt der Entnahme erforderlich. Durch die effektive Kanülierung der rechten Halsschlagader und das Einklemmen des Aortenbogens distal an den Abzug der Arteria brachiocephalica wird eine effektive Abgabe der Konservierungslösung an das DCD-Herz und das Ausspülen der Stoffwechselabfälle erreicht. Die routinemäßige Verabreichung von subkutaner Kochsalzlösung (1 ml/100 g) 10 Minuten vor dem erwarteten Abschluss der vaskulären Anastomose füllt den erwarteten Blutverlust aus den während der Anastomose entstandenen Nadellöchern und das Blutvolumen, das zur Füllung des rechten Vorhofs und des Ventrikels des Spenders bei der Reperfusion erforderlich ist, präventiv aus. Dadurch wird die potenzielle Hypotonie vermieden, die sonst bei der Freigabe der Gefäßklemme auftreten würde, und es wird eine effektive Reperfusion des transplantierten Herzens und der Empfängerratte riskiert. Die Verabreichung des langwirksamen Analgetikums Buprenorphin vor Beginn der Operation ermöglicht eine reibungslose Genesung des Empfängers. Ohne ausreichende Schmerzkontrolle kann sich die Empfängerratte zügig bewegen, was die Blutstillung der fragilen vaskulären Anastomose gefährdet. Die sorgfältige Beachtung mehrerer Faktoren, die im Protokoll beschrieben sind, führt zum Erfolg des DCD-Herztransplantationsprozesses 1,7,11,12,13.

Die Haupteinschränkung der DCD-HTx-Methode der Ratte und aller anderen in der Literatur beschriebenen murinen HTx-Modelle ist der Nicht-Arbeitszustand des transplantierten Herzens 6,7,11,12,13. Modifikationen, die notwendig sind, um das derzeitige Modell in Zukunft möglicherweise in ein funktionierendes Herzmodell umzuwandeln, werden untersucht. Die andere Einschränkung ist die immunologische Reaktion des Empfängers auf das Spenderherz. Diese Einschränkung ist durch die Verwendung von syngenen Ratten für die Transplantation leicht zu überwinden. Es wurden mehrere Ratten-DCD HTx mit syngenen Ratten erfolgreich durchgeführt, deren routinemäßige Anwendung durch die hohen Kosten für die Beschaffung syngener Ratten begrenzt ist. Im Gegensatz zu den CBD-Herzen schlagen DCD-Herzen nach der Reperfusion im Körper des Empfängers nicht wieder weiter. Es wird jedoch der koronare Blutfluss hergestellt, von dem sich ein erheblicher Teil in der rechten Seite des Herzens sammelt, wenn er aus dem Koronarsinus abfließt. Wenn dieses Blut stagniert, gerinnt es und das Transplantat versagt; Daher wird eine mechanische Entleerung der rechtsseitigen Herzkammern mit einem Wattestiftapplikator empfohlen, der über die Oberfläche des rechten Ventrikels in Richtung der unteren Hohlvene gerollt wird. Wenn der Koronarkranz im Spenderherzen fließt und verhindert wird, dass er sich ausdehnt, kann er in 1-2 Minuten wieder schlagen. Während der Anastomose des Spenderherzens in die Bauchaorta/Hohlvene des Empfängers bleibt der Unterkörper des Empfängers ischämisch (20-30 Minuten) nach dem Verschluss der infrarenalen Aorta. Im Gegensatz zu den Eingeweiden können die Gliedmaßen eine längere Dauer der Ischämie (mehr als 2-3 Stunden) ohne offensichtliche Verletzungen überstehen; Dennoch ist es sehr wahrscheinlich, dass die Freisetzung von Zytokinen aus reperfundierten Gliedmaßen das transplantierte Herz beeinflussen kann. Die Funktion des transplantierten Transplantats kann, wenn sie in kürzerer Zeit ab dem Zeitpunkt der Reperfusion beurteilt wird, durch die Freisetzung von Zytokinen beeinträchtigt werden. Da es sich bei der Zytokinfreisetzung um eine akute Phasenreaktion handelt, wäre der langfristige Einfluss von Zytokinen auf die transplantierte Herzfunktion minimal.

Die Etablierung eines In-vivo-DCD-Herzspendermodells für Ratten, das dem klinischen DCD-Prozess ähnelt, trägt wesentlich zu der Forschung bei, die sich auf die Erweiterung des Spenderherzpools für die Transplantation konzentriert. Vor dieser Veröffentlichung nutzten die bestehenden Methoden die globale Ischämie, indem sie zunächst ein schlagendes Herz auf das Langendorff-System (ex vivo) legten und dann den Fluss stoppten, um den DCD-Prozess zu initiieren⁶. Somit weist das ex vivo ischämische Modell mehrere Unterschiede zum in vivo Prozess auf, wie er im klinischen DCD-Protokoll⁵ beobachtet wird. Das hier beschriebene DCD-Modell ähnelt stark dem klinischen DCD-Prozess und hat einen größeren Nutzen bei der Prüfung der Faktoren, die darauf abzielen, die Reperfusionsschäden am DCD-Herzen zu mildern.

Das bestehende klinische DCD-Protokoll folgt strikt der "Todesspenderregel", nach der keine physischen oder pharmakologischen Eingriffe zur Erleichterung der Organentnahme erlaubt sind, bis der DCD-Spender für tot erklärt wird. Daher ist eine warme Ischämie für verschiedene Organe, insbesondere das Herz, mit der DCD-Spende unvermeidlich. Unter Berücksichtigung des klinischen DCD-Prozesses erlaubt das hier beschriebene Ratten-DCD-HTx-Modell nur eine Perfusion des Spenderherzens nach vollständiger Asystolie (Tod) und nach 25 Minuten warmer globaler Ischämie. Die kritischen Interventionen, die in einem DCD-Modell der Ratte untersucht werden können, sollten sich auf die Reperfusionsverletzung konzentrieren, die bis zu 50 % der Gesamtschädigung durch Ischämie und Reperfusion ausmachen kann¹⁴. Um die Reperfusion zu mildern, können der Reperfusionserhaltungslösung, die dem DCD-Herz zum Zeitpunkt der Entnahme zugeführt wird, Verletzungsmittel zugesetzt werden, die auf die Elektronentransportkette in Mitochondrien, Inflammasom-Modulatoren und mitochondriale Permeabilitätsübergangsporenstabilisatoren abzielen¹⁵. Andere Wirkstoffe, die an ex vivo globalen Ischämiemodellen untersucht wurden, wie z. B. Na/H-Pumpenhemmer, Ansäuerung von Perfusaten, NO-erzeugende Wirkstoffe, Erythropoietin und Melatonin, können alle in vivo unter Verwendung des hier beschriebenen DCD HTx-Modells untersucht werden. Gegenwärtig ist in der klinischen Praxis eine Ischämiedauer von über 30 min eine Kontraindikation für die Entnahme von DCD-Herzen, auch im klinischen Studienprotokoll. Vielleicht könnte die wissenschaftliche Gemeinschaft durch die rigorose Durchführung von Studien unter Verwendung des hier beschriebenen DCD-Ratten-HTx-Modells Interventionen vorschlagen, die es uns eines Tages ermöglichen könnten, klinische DCD HTx mit längerer Ischämiedauer durchzuführen.

Die Autoren dieses Manuskripts haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Arbeit wurde durch einen Merit Review Grant unterstützt, der an Dr. Mohammed Quader (1I01 BX003859) vergeben wurde, und durch Mittel des Pauley Heart Center an Mohammed Quader und Dr. Stefano Toldo.