نموذج زرع قلب الفئران غير المتجانسة باستخدام قلوب المتبرعين بموت الدورة الدموية

هنا ، نصف التحضير والتفاصيل الفنية لزراعة القلب غير المتجانس في الفئران باستخدام قلب متبرع بموت الدورة الدموية.

الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج لزراعة القلب غير المتجانسة للفئران مع التبرع بقلوب المتبرعين بعد موت الدورة الدموية (DCD). هناك نوعان من الإعدادات لهذا البروتوكول: إعداد المتبرع بالقلب وإعداد المستلم. في إعداد المتبرع بالقلب ، يتم تخدير فئران Sprague Dawley وتنبيبها في القصبة الهوائية والتهوية. يتم قنية الشريان السباتي الأيمن لتوصيل الهيبارين والعامل الشللي فيكورونيوم بروميد. تبدأ عملية DCD عن طريق إنهاء التهوية. بعد 20 دقيقة ، يتعرض القلب ويتم تثبيت الشريان الأورطي البعيد عن الفرع العضدي. في غضون 25 دقيقة من إنهاء جهاز التنفس الصناعي ، يتم ترشيح محلول جامعة ويسكونسن (UW) المثلج من خلال القسطرة السباتية لتنظيف القلب. يتم شراء القلب عن طريق تقسيم الشريان الأورطي والشريان الرئوي والأوردة الأجوف والأوردة الرئوية وتخزينها في محلول UW للزرع. في إعداد المتلقي ، يتم تخدير فأر لويس بالأيزوفلوران. يتم إعطاء البوبرينورفين بطيء الإطلاق تحت الجلد لتسهيل التعافي السلس بعد الجراحة. من خلال شق البطن في خط الوسط ، يتم عزل الشريان الأورطي تحت الكلوي والوريد الأجوف السفلي وتثبيتها بمشبك وعائي غير رضحي. يتم خياطة الشريان الأورطي القلبي والشريان الرئوي للمتبرع بالشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف المتلقي ، على التوالي ، مع تشغيل 8-0 البرولين. تتم إزالة المشبك الوعائي لإعادة إنفاذ القلب. جدار البطن مغلق ويتم استرداد الفئران. بعد فترة زمنية محددة (24 ساعة إلى أسبوعين) ، يتم تخدير الجرذ المتلقي ، ويتعرض القلب المزروع ، ويتم إدخال قسطرة طرف بالون في البطين الأيسر عبر القمة لتسجيل الضغط المتطور و dP / dt باستخدام نظام الحصول على البيانات. يتم جمع أنسجة القلب لعلم الأنسجة أو المناعة أو التحليل الجزيئي. سيسمح نموذج زراعة قلب الفئران المتبرع ب DCD بمزيد من الدراسات حول مناهج حماية القلب لتحسين نتائج زراعة القلب من المتبرعين ب DCD.

يعد النموذج الحيواني الصغير لزراعة القلب (HTx) أمرا بالغ الأهمية لإجراء البحوث التي تدرس الحالات الفيزيولوجية المرضية التي تؤثر على القلب المزروع. سمح HTx غير المتجانس في نموذج الفئران ، كما وصفه أوتو وليندسي ، للباحثين بدراسة التغيرات الفيزيولوجية المرضية التي لوحظت في ظروف نقص التروية وإعادة التروية¹. تقليديا ، تم شراء قلوب المتبرعين للزرع من المتبرعين بالقلب النابض ، والمعروف أيضا باسم التبرع بعد موت الدماغ (DBD). ومع ذلك ، كانت هناك زيادة غير متناسبة في عدد المرضى الذين يحتاجون إلى HTx². في الآونة الأخيرة ، تم استخدام قلوب المتبرعين بموت الدورة الدموية ، والمعروفة أيضا باسم المتبرعين بالتبرع بعد الموت الدوري (DCD) ، للزرع في البيئات^{التجريبية 3}. يتمثل الفرق الرئيسي بين قلوب المتبرعين DBD و DCD في أنه في الأخير ، تتعرض القلوب لفترات متفاوتة من نقص التروية ، مما يحول دون استخدامها في ممارسة HTx الروتينية.

الأدبيات الموصوفة سابقا حول الفئران غير المتجانسة HTx استخدمت فقط ظروف المتبرع بالقلب^{النابض 4،5،6}. تتطلب زراعة القلب DCD غير المتجانسة تعديلات طفيفة ، والتي بدونها لن ينبض القلب المزروع⁷. يهدف هذا البروتوكول إلى مشاركة القراء تقنية محسنة ل DCD HTx في الفئران. نقص تروية عضلة القلب العالمي فطري في التبرع بأعضاء DCD. تمت دراسة إعداد تجريبي يحاكي نقص تروية عضلة القلب العالمي فقط في إعداد خارج الجسم الحي ⁵. قد لا تنطبق نتائج الدراسات خارج الجسم الحي على عمل DCD HTx نظرا لوجود اختلافات كبيرة بين نماذج نقص التروية العالمية في الجسم الحي (DCD) ونماذج نقص التروية العالمية^{خارج الجسم الحي 5}. قد لا تكون النتائج ، أو عدم وجودها ، من التدخلات للتخفيف من نقص تروية عضلة القلب المعاد تروية في نماذج خارج الجسم الحي قابلة للتكرار في نموذج DCD HTx. وبالتالي ، من الضروري محاكاة DCD HTx البشري في نموذج حيواني ، يمكن أن يكون للنتائج التي يمكن أن يكون لها قيمة انتقالية أعلى. سيسمح نموذج DCD HTx الموصوف هنا للباحث بمحاكاة DCD HTx السريري عن كثب وتوفير الفرصة للتخفيف من إصابة إعادة التروية من خلال التدخلات في كل من قلب المتبرع والمتلقي. عند تعافي الجرذ المتلقي ، يمكن دراسة وظيفة القلب المزروع ، وعلم الأنسجة المرضية ، والمناعة على فترات متفاوتة من وقت الزرع.

أجريت جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ودليل رعاية واستخدام المختبر ، الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة (منشور المعاهد الوطنية للصحة رقم 86-23 ، تمت مراجعته عام 2011)⁸. تمت الموافقة على الإجراءات التالية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة فرجينيا كومنولث. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإرشادات OSHA (إدارة السلامة والصحة المهنية) والتقنيات المعقمة الموصى^{بها 9}. تم إيواء فئران Sprague Dawley تحت رطوبة خاضعة للرقابة عند درجة حرارة 23 درجة مئوية و 12 ساعة من دورات الظلام / الضوء.

1. إعداد المختبر

ملاحظة: خصص مساحة مخصصة لإجراء جراحات البقاء على قيد الحياة المعقمة للقوارض باستخدام مجهر تشغيلي. الحفاظ على درجة الحرارة المحيطة لغرفة العمليات دافئة ؛ يعد استخدام وسادات الاحترار للجراحة وعملية التعافي أمرا ضروريا للحفاظ على درجة حرارة جسم الفئران المتلقية.

1. احتفظ بالإمدادات الأساسية (جدول المواد) ، بما في ذلك المحاقن ، والمحلول الملحي العادي 0.9٪ (كلوريد الصوديوم) ، وعوامل التخدير (الأيزوفلوران ، والكيتامين / الزيلازين) ، والهيبارين ، وبروميد الفيكورونيوم ، ومحلول الحفظ ، ودلو الثلج ، وعامل المسكن (البوبرينورفين البطيء الإطلاق) مخزنة ومتاحة بسهولة.
2. ضع بدقة أدوات الجراحة المجهرية (الشكل 1 أ ، ب) في المجال الجراحي. احتفظ بمجموعة أدوات التعقيم السريع متاحة بسهولة لتنظيف الأدوات الأساسية الملوثة على الفور.

2. في الجسم الحي إعداد المتبرع DCD للفئران

1. تخدير الجرذ للتنبيب الرغامي والقنية السباتية. تخدير فأر Sprague Dawley (8-12 أسبوعا) في غرفة الأيزوفلوران 3٪ ، ثم تخديره بالكيتامين / الزيلازين (100/10 مجم / كجم ، في العضل).
2. لفضح القصبة الهوائية والشريان السباتي الأيمن ، ضع فأر مخدر بالكامل ضعيفا ونظف الجزء الأمامي من الرقبة والصدر بالكحول ومحلول بوفيدون. قم بعمل شق على شكل حرف V مع ذروة V بالقرب من فك الفئران في خط الوسط ويشير كل طرف من أطراف V إلى الكتف المقابل. افصل الجلد عن الأنسجة تحت الجلد واقلب الجلد على الصدر لكشف عضلات حزام الرقبة (الشكل 2 أ).
   1. قم بتنبيب الجرذ عن طريق فصل عضلات حزام خط الوسط (القص القصي والقص الورمي) بالملقط لفضح القصبة الهوائية (الشكل 2 ب). أطوق القصبة الهوائية بحرير 5-0 وافتحها عن طريق تقسيم الأنسجة العضلية جزئيا بين حلقات القصبة الهوائية.
   2. أدخل 14 جم من الأوعية الدموية في القصبة الهوائية وقم بتثبيتها بالحرير 5-0 (الشكل 2 ج). قم بتوصيل الأوعية الدموية بجهاز التنفس الصناعي (1 مل / كجم عند 90 نفسا / دقيقة).
   3. بالنسبة لقنية الشريان السباتي الأيمن ، حدد الشريان السباتي المشترك (يقع موازيا للجانب الأيمن من القصبة الهوائية وعليها مباشرة) ، وعزله بعناية إلى طول الرقبة بالكامل ، واربط الطرف البعيد (الجمجمة) بحرير 5-0.
   4. قم بتوصيل hemostat بالطرف الحر من ربطة العنق للجر لتسهيل قنية الشريان السباتي.
   5. قم بتعبئة الجانب القريب من الشريان السباتي (باتجاه قاعدة الرقبة) وتثبيته باستخدام تمرق الأوعية الدموية. تحت مجهر التشغيل ، استخدم مقص القزحية الدقيقة لفتح الشريان السباتي عن طريق تقسيمه جزئيا إلى الأمام على الطرف البعيد. قم بتقنيد الشريان السباتي بوعائية 22 جم وثبته برباط حريري 5-0 (الشكل 2 د).
   6. قم بتوصيل محول محبس التدفق ثلاثي الاتجاهات بالأوعية الدموية لسهولة توصيل الأدوية أو محلول شلل القلب إلى الشريان السباتي ، وقم بتوصيله بمستشعر الضغط لمراقبة معدل ضربات القلب والضغط أثناء عملية DCD (الشكل 2 د). يجب ملاحظة ارتجاع الدم النابض عند تحرير المشبك الوعائي القريب.
   7. بمجرد تأمينه، قم بتوصيل قسطرة الشريان السباتي بمستشعر الضغط، وقم بتوصيل الهيبارين (1,000 وحدة / كجم) وبروميد الفيكورونيوم (4 ملغم/كجم).
   8. بدء عملية DCD: دع بروميد الفيكورونيوم يدور لمدة 1 دقيقة. راقب أي علامات على ضائقة ، وقم بتخدير إضافي إذا لزم الأمر. أوقف جهاز التنفس الصناعي (نقص الأكسجة / نقص التروية) لبدء عملية DCD. لاحظ عدم وجود نشاط تنفسي.
      ملاحظة: يبدأ الوقت الإقفاري DCD من وقت سحب دعامة جهاز التنفس الصناعي. في الفئران ، تم تحديد 25 دقيقة من نقص التروية على أنها أقصى مدة زمنية تؤدي إلى إصابة كبيرة ولكن قابلة للعكس⁷. ستظهر تتبع الضغط أنه من لحظة انقطاع دعم التهوية عند ~ 3.5 دقيقة ، ينخفض الضغط الجهازي إلى أقل من 50 مم زئبق ، وهو ضغط يعتبر غير كاف لاختراق القلب بشكل فعال (الشكل 3).
3. شراء قلب المتبرع: خصص ~ 4-7 دقائق لشراء القلب وإدارة شلل القلب البارد. لتحقيق وقت نقص التروية المستهدف وهو 25 دقيقة ، ابدأ شراء القلب بعد 18-21 دقيقة بعد إنهاء دعم التنفس الصناعي.
   ملاحظة: تعديل مدة وقت الاشتراء استنادا إلى خبرة الشخص الذي يقوم بعملية الاشتراء.
   1. قسم جدار البطن على طول الهامش الساحلي بدءا من مستوى الخنجري ، ثم قسم القفص الصدري الموازي لعظم القص على كلا الجانبين حتى الترقوة لإجراء استئصال الصدر الأمامي الثنائي (الشكل 4 أ). استخدم مجهر التشغيل تحت تكبير منخفض (5x) لتسهيل هذه الخطوة.
   2. اقلب جدار الصدر المقسم الملقي على الترقوة باتجاه الرأس وثبته بمرق (الشكل 4 ب).
   3. قم بتطويق الوريد الأجوف السفلي (IVC) بحرير 5-0 ، ثم قسمه جزئيا بمقص دقيق بالقرب من قبة الكبد (الشكل 4 ج). يسمح IVC المفتوح جزئيا بخروج شلل القلب لأنه يمتد إلى الجانب الأيمن من القلب.
   4. قم بتشريح المستوى بين الشريان الأورطي الصاعد والشريان الرئوي (PA) ، ثم اعزل الجذع الرئوي عن طريق الجيوب الأنفية المستعرضة باستخدام ملقط منحني غير حاد إلى تشعبه. قسم الشريان الرئوي بعناية بالقرب من نقطة التشعب باستخدام مقص صغير (الشكل 4 ج).
   5. تطويق قوس الأبهر بتشريح حاد. هذا للسماح بالوصول إلى مشبك وعائي صغير بزاوية قائمة ليتم وضعه عبر قوس الأبهر البعيد إلى أصل الشريان غير المسمى.
   6. عند علامة 25 دقيقة من إنهاء جهاز التنفس الصناعي ، قم بتثبيت قوس الأبهر وتوصيل شلل القلب يدويا (10 مل من محلول جامعة ويسكونسن عند 4 درجات مئوية ، أكثر من 2-3 دقائق) من خلال القسطرة السباتية (الشكل 4 د).
   7. باستخدام مقص دقيق ، قسم الشريان الأورطي الصاعد بعيدا قبل قوس الأبهر (الشكل 4E).
   8. اربط IVC باتجاه القلب بحرير 5-0 وقسمه بعيدا.
   9. اربط الأوردة الرئوية والوريد الأجوف العلوي (SVCs) مع 5-0 حرير (الشكل 4F). نظرا لأن هذه الأربطة تحتوي على كمية كبيرة من الأنسجة ، يفضل ربطة عنق اليد على ربطة عنق الأداة. اسحب القلب برفق لأسفل باتجاه البطن باستخدام مسحة من القطن لتسهيل ربط الوريد الرئوي دون تجميع الزوائد الأذينية في ربطة العنق.
   10. قسم الأوردة الرئوية بمقص القزحية الدقيقة ، واجمع القلب ، وضعه في محلول ملحي طبيعي بارد مثلج (الشكل 4G).

3. في الجسم الحي زرع القلب غير المتجانس DCD الفئران

1. تخدير المتلقي في غرفة الأيزوفلوران (تحريض 3٪) ، وقص الشعر على البطن ، وتنظيف المنطقة ببوفيدون والكحول. لا تتخثر المتلقي. سيؤدي ذلك إلى نزيف مفرط من مفاغرة وفشل الكسب غير المشروع.
2. ضع الفئران على وسادة تدفئة. ضع مسبارا بين الجرذ ووسادة التدفئة لمراقبة درجة الحرارة. حافظ على درجة حرارة جسم الفئران عند 38 درجة مئوية. ضع أنبوبين للطرد المركزي معقما مسبقا سعة 50 مل مملوءين بالمحلول الملحي الدافئ أو الخرز الزجاجي على جانبي بطن الفئران لتسهيل الحفاظ على دفء الفئران.
3. على الرغم من الخطوات المذكورة أعلاه ، إذا انخفضت درجة حرارة الجسم إلى أقل من 37.5 درجة مئوية ، فقم بزيادة درجة حرارة الغرفة (RT) ، وقم بتغطية جميع المناطق المكشوفة من الجسم باستخدام رقائق الألومنيوم المعقمة لترك مساحة كافية لإجراء جراحة البطن.
4. تحفيز التخدير العام مع 3٪ الأيزوفلوران عبر مخروط الأنف وانخفض تدريجيا إلى 2٪.
5. افتح البطن على طول الخط (الشكل 5 أ) وكشف مساحة العمل عن طريق وضع ضاعات جدار البطن (الشكل 5 ب).
6. باستخدام أدوات تطبيق ذات أطراف قطنية معقمة ، حرك القولون الموسع أو الممتلئ وضعه في شاش رطب دافئ على يسار المشغل ، مع الري بشكل دوري بمحلول ملحي دافئ (38 درجة مئوية) (الشكل 5 ج). يوفر تحريك القولون جانبا مساحة أكبر لقلوب DCD لأنها شديدة الصلابة وتتطلب مساحة إضافية لاستيعابها في البطن.
7. افتح خلف الصفاق في خط الوسط مع تشريح حاد باستخدام مسحات من القطن. كشف الشريان الأورطي تحت الكلوي و IVC.
8. باستخدام مشبك وعائي متعدد الزوايا للأطفال غير الرضحي ، قم بعزل 3-5 مم من الشريان الأورطي تحت الكلوي و IVC للمفاغرة (الشكل 5 د).
9. أدخل الشريان الأورطي بإبرة 30 جم مثبتة على حقنة 1 سم³ مملوءة بمحلول ملحي عادي ممزوج ب 100 وحدة من الهيبارين. اغسل 0.2-0.3 مل من المحلول (الشكل 5E). ربت على المحلول الزائد باستخدام قضيب طرف القطن المعقم ، حيث قد يتم امتصاص الهيبارين ويسبب نزيفا من خطوط الخياطة.
10. باستخدام مقص دقيق ، افتح الشريان الأورطي على طول المحور الطويل ليتناسب مع حجم الشريان الأورطي المتبرع. لا يتم فتح IVC في هذه المرحلة ، ولا تحاول إنشاء مستوى بين IVC والشريان الأورطي. هذا سيؤدي إلى النزيف.
11. يعد التوجيه الصحيح لقلب المتبرع أثناء مفاغرة أمرا بالغ الأهمية (الشكل 5F). قم بتوجيه قلب المتبرع من أجل مفاغرة بحيث يكون السطح الأمامي للبطين الأيمن مواجها للسقف ، وتشير القمة إلى يمين المشغل ، ويكون الشريان الأورطي المتبرع أقل قليلا من الشريان الرئوي. ينتج عن هذا الاتجاه توتر أقل على مفاغرة الشريان الرئوي.
    1. مفاغرة الأبهر: استخدم مفترة إبرة مدببة وملاقط دقيقة لمفاغرة الأوعية الدموية الدقيقة. أداء مفاغرة مع 8-0 خياطة أحادية الشعيرات على إبرة مدببة مقاس 4 مم محملة على حامل إبرة بطرف 0.3 مم مع إزالة قفل سائق الإبرة ، لمنع صدمة الأنسجة العرضية عند القفل وفتحها.
    2. ضع خياطة البقاء في موضع الساعة 6 على مفاغرة الأبهر. يتم ذلك لتوفير خط خياطة متماثل ومرقئ. بعد ذلك ، ابدأ مفاغرة عند موضع الساعة 12 مع الخارج إلى الداخل على الشريان الأورطي المتبرع ومن الداخل إلى الخارج على الشريان الأورطي المتلقي (الشكل 6 أ ، ب). احتفظ ب 5-7 سم فقط من خياطة العمل واقطع الباقي.
    3. تحرك عكس اتجاه عقارب الساعة، وسافر في مسافات قصيرة باتجاه موضع موضع الساعة 6، ثم أكمل مفاغرة بطريقة عداد الساعة حتى موضع الساعة 12 عن طريق قلب القلب إلى اليسار (الشكل 6ج).
    4. تحقق من وجود أي خط خياطة فضفاض قبل الربط.
       ملاحظة: يجب أن يكون مفاغرة الأمان متماثلا ويجب أن يقترب من الجزء الداخلي للمتبرع والمتلقي دون فجوات.
    5. مفاغرة الشريان الرئوي: حرر الشريان الرئوي من الشريان الأورطي ووجهه من أجل مفاغرة الوريد الوريدي دون التقلبات. جهز حجم دم المتلقي لملء قلب المتبرع وتجنب انخفاض ضغط الدم عن طريق حقن 3-5 مل من محلول ملحي طبيعي تحت الجلد (مؤخرة العنق).
    6. راقب نمط الجهاز التنفسي للفئران وخفض الأيزوفلوران من 2.0٪ إلى 1.5٪ حيث أن مفاغرة الشريان الرئوي على وشك الانتهاء.
    7. افتح رأسية IVC فيما يتعلق بمفاغرة الأبهر باستخدام مقص القزحية الدقيقة (الشكل 6C). استخدم 0.2-0.3 مل من المحلول الملحي لغسل IVC. سيكون هناك عدد قليل من الجلطات الدموية التي شوهدت ؛ اغسلهم بعناية.
    8. على عكس مفاغرة الأبهر ، ابدأ مفاغرة الرئة دون خياطة البقاء. سوف يعيق التعرض. ابدأ من موضع الساعة 12 مع تحريك الإبرة من الخارج إلى الداخل على الشريان الرئوي المتبرع ومن الداخل إلى الخارج على IVC المتلقي. اربط الخيط وأكمل مفاغرة الجدار الخلفي أولا في اتجاه عقارب الساعة.
    9. بمجرد الوصول إلى موضع الساعة 6 ، استمر في الخياطة في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم الوصول إلى موضع الساعة 12 ، ثم اربطه بالطرف القصير للخياطة من ربطة العنق السابقة. احرص على عدم انقباض مفاغرة لأن أي تضيق سيحد من التصريف الوريدي من القلب. في المتوسط ، يستغرق إكمال كلا المفاغرة 30 دقيقة أو أقل.
    10. ضع قطعا صغيرة من الإرقاء القابل للامتصاص فوق مفاغرة لاحتواء النزيف من فتحات الإبرة.
    11. قم بفك الأوعية وإضافة المزيد من مرقئ الدم القابل للامتصاص فوق فتحات الإبرة حسب الحاجة (الشكل 6E). يبدأ القلب المزروع في النبض مع الرجفان العرضي قبل أن يستأنف التنفس الإيقاعي. اترك الإرقاء القابل للامتصاص في مكانه لمدة 5 دقائق طالما أن القلب ينبض ولا يوجد نزيف علني.
    12. بمجرد الرضا عن الإرقاء (~ 3-5 دقائق) ، استخدم أدوات تطبيق ذات طرف قطني معقم لإزالة المرقئ الزائد القابل للامتصاص ، والري بالمحلول الملحي ، وإعادة الأمعاء مرة أخرى إلى تجويف البطن (الشكل 6F). ضع الثرب فوق مفاغرة للمساعدة في الإرقاء.
    13. أغلق جدار البطن في طبقتين باستخدام 5-0 أحادي كريل على إبرة قطع 13 مم عن طريق إغلاق linea alba أولا ثم إغلاق الجلد (الشكل 6G ، H).

4. التعافي والمراقبة

1. عند الانتهاء من إغلاق البطن ، اقلب الجرذ على بطنه على وسادة دافئة للتعافي. استمر في تناول الأيزوفلوران عبر مخروط الأنف بنسبة 1٪ لمدة 5 دقائق ، ثم توقف.
2. بمجرد أن يصبح التنفس التلقائي منتظما ، انقل الجرذ إلى قفص استرداد نظيف وضعه على وسادة دافئة لمواصلة عملية الشفاء. ستؤدي الحركات المفاجئة للفئران إلى خطر النزيف أو التواء في مفاغرة. يسهل المسكن طويل المفعول الذي يتم إعطاؤه قبل بدء الجراحة بشكل كبير عملية الشفاء السلسة.

5. شراء وزرع القلب النابض للتحكم

1. شراء قلوب المتبرع بالقلب النابض (CBD) كعنصر تحكم لتقييم جودة قلب المتبرع في حالة عدم وجود نقص التروية.
   ملاحظة: يخضع المتبرع باتفاقية التنوع البيولوجي لجميع الخطوات التي تم وصفها لقلب DCD ، باستثناء إنهاء دعم التنفس الصناعي. يتم شراء قلوب CBD أثناء النبض ودعمها بالكامل على جهاز التنفس الصناعي. يؤدي إعطاء شلل القلب إلى إيقاف القلب ، ويتم الانتهاء من الشراء والزرع بنفس الطريقة الموضحة لقلوب DCD.

6. تقييم وظائف القلب المزروعة:

1. في فترة زمنية محددة مسبقا من وقت زراعة القلب (24 ساعة إلى 14 يوما) ، قم بتخدير الجرذ المتلقي (3٪ استنشاق إيزوفلوران) ، وضعه على وسادة دافئة ، وافتح شق البطن لكشف القلب المزروع.
2. ضع قسطرة ذات طرف بالون عبر قمة البطين الأيسر لقياس الضغط المتطور (DP) ، والحد الأقصى + dP / dt ، والحد الأدنى −dP / dt.
   ملاحظة: هنا تم استخدام محطة PowerLab كنظام للحصول على البيانات لتسجيلات ضغط الدم.

بعد 24 ساعة إلى 14 يوما من زراعة القلب غير المتجانس ، يمكن إعادة فتح البطن ، ويمكن تعريض القلب لقياس الضغط الذي يحدثه البطين الأيسر. يتم إدخال قسطرة ذات طرف بالون في البطين الأيسر لقلب DCD (أو CBD) لقياس الضغط المتطور (DP) ، والحد الأقصى + dP / dt ، والحد الأدنى −dP / dt. يوضح الشكل 7 مثالا على DP المتوقع و + dP / dt و −dP / dt لقلب DCD مقارنة بقلب CBD بعد 24 ساعة من الزرع. بالمقارنة مع قلوب اتفاقية التنوع البيولوجي ، انخفض DP لقلوب DCD بشكل كبير ، وساءت + dP / dt (max) و −dP / dt (min).

الشكل 1: أدوات الأوعية الدموية الدقيقة المستخدمة في زراعة قلب الفئران غير المتجانسة. (1) ملقط بأطراف منحنية. (2) مقص قزحية صغيرة مع نصائح مستقيمة ؛ (3) ملاقط ذات نقطة عالية الدقة ؛ (4) مشبك الأوعية الدموية متعدد الزوايا للأطفال اللارضي Ebakey ؛ (5) حامل إبرة مع إزالة آلية القفل ؛ (6) مقص صغير ، زاوية قائمة ونصائح منحنية ؛ (7) مشبك الأوعية الدموية الثقيلة. (8 أ) مباعدات جدار البطن المنحنية المصبوبة يدويا القابلة للتعقيم ، باستخدام مشابك ورق كبيرة على خياطة (منظر أمامي) ؛ (8 ب) مباعدات جدار البطن المنحنية المصبوبة يدويا القابلة للتعقيم (منظر جانبي). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: وصف خطوة بخطوة للتنبيب المتبرع والقنية السباتية. (أ) باستخدام المقص ، يتم قطع الجلد فوق منطقة الرقبة ، ويتم الكشف عن الأنسجة الرخوة. (ب) باستخدام تقنية التسلخ الضعيف ، يتم الكشف عن القصبة الهوائية والشريان السباتي الأيمن. (ج) يتم إجراء شق عرضي على القصبة الهوائية وإدخال أنبوب القصبة الهوائية لتوصيله بجهاز التنفس الصناعي وتثبيته. (د) يتم إدخال قسطرة الفصد في الشريان السباتي الأيمن ، وتثبيتها ، وتوصيلها بخط أنبوب باستخدام محبس ثلاثي الاتجاهات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: مثال على تسجيلات الضغط الشرياني الجهازي أثناء عملية DCD. تم استخدام قسطرة الشريان السباتي لقياس الضغط الشرياني. يتم الإبلاغ عن الضغط والوقت على المحور Y والمحور X ، على التوالي. تشير الأسهم إلى لحظة إنهاء دعم التهوية والوقت الذي انخفض فيه متوسط الضغط الجهازي إلى أقل من 30 مم زئبق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: وصف خطوة بخطوة لشراء قلب المتبرع. (أ) تستخدم القنية السباتية لتوصيل عامل شلل والهيبارين. باتباع بروتوكول DCD أو CBD المناسب ، يتم إجراء بضع الصدر الجانبي. (ب) ينقلب الصدر الأمامي فوق الرأس لفضح قوس الأبهر والأوعية الصدرية الرئيسية بشكل صحيح. (ج) يتم قطع الشريان الرئوي بعيدا قدر الإمكان. يتم قطع الوريد الأجوف السفلي لفك ضغط البطين الأيمن. (د) يتم تثبيت القوس الأبهري بين الشريان غير المسمى والشريان السباتي المشترك. يتم توصيل شلل القلب المثلج إلى القلب باستخدام قسطرة الفصد / الوصول إلى الشريان السباتي. (ه) يتم قطع الشريان الأورطي الصاعد أسفل القوس ، ويتم ربط الوريد الأجوف السفلي بالقرب من الأذين الأيمن. (و) يتم إنشاء حلقة خياطة على الجزء الخلفي من القلب لإغلاق الوريد الأجوف العلوي والأوردة الرئوية. يتم قطع الأوعية الصدرية (ز) يتم تخزين القلب المنفصل عن الأوعية الصدرية والأنسجة الضامة في محلول ملحي مثلج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: وصف خطوة بخطوة لإعداد المتلقي. (أ) يتم قطع جلد البطن وطبقة العضلات طوليا على طول الخط المتوسط. (ب) أعضاء البطن مكشوفة. تعمل مباعدات الأنسجة على توسيع فتحة البطن. (ج) تستخدم أطراف Q لكشف الجزء الخلفي من التجويف وتنظيف الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي البطني. (د) يسد المشبك الوعائي على شكل حرف U الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي. (ه) يتم ثقب الشريان الأورطي البطني بإبرة 30 جرام. تستخدم المقصات الدقيقة لإنشاء بضع الأبهر الطولي. (F) محاذاة الشريان الأورطي القلبي للمتبرع بجوار فتحة الشريان الأورطي البطني المتلقي. 8-0 تستخدم خياطة البرولين لبدء مفاغرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: وصف خطوة بخطوة لزراعة القلب غير المتجانسة ، وإنعاش القلب ، وإكمال العملية الجراحية. (أ) يتم وضع غرزة الساعة 12 لتأمين الشريان الأورطي المتبرع في موضعه. (ب) يبدأ خياطة مستمرة بين الشريان الأورطي المتبرع والمتلقي على الجانب البعيد. (ج) اكتمال مفاغرة الأبهر ، ويستخدم المقص الصغير لإنشاء بضع الوريد الطولي. (د) يتم محاذاة الشريان الرئوي المتبرع بجوار بضع الوريد وتثبيته بغرزة الساعة 12. يتم استخدام خياطة مستمرة لإكمال مفاغرة. (ه) تتم إزالة المشبك الوعائي على شكل حرف U ، ويتم إعادة ضخ القلب. (و) تستخدم أطراف Q لإعادة توزيع الأمعاء في تجويف البطن. (ز) تستخدم خياطة نايلون 5-0 لإغلاق جدار البطن والجلد. (ح) بعد الانتهاء من عملية الخياطة ، يتم تعافي من الجراحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: أمثلة على الضغوط المطورة (DP) و + dP / dt (max) و -dP / dt (min) المقاسة في الفئران بعد 24 ساعة من الزرع (N = 5 / group). * ص < 0.05. بالمقارنة مع قلوب اتفاقية التنوع البيولوجي ، تم تقليل DP و + dP / dt (max) و -dP / dt (min) لقلب DCD بشكل كبير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالنسبة لفأر DCD غير متجانس ناجح HTx ، من الأهمية بمكان إنشاء إعداد دقيق ومدروس للتجربة. يأخذ الإعداد التفصيلي في الاعتبار عدة عوامل ، بما في ذلك 1) اختيار الفئران الصغيرة كمتبرعين DCD ، 2) استخدام الأيزوفلوران كعامل تخدير مفضل ، 3) التوصيل الفعال لشلل القلب إلى قلب المتبرع ، 4) تخزين قلب المتبرع في محلول مثلج ، 5) الحد من تشريح البطن دون المساس بالأوعية القطنية لتعريض الشريان الأورطي تحت الكلوي والوريد الأجوف فقط ، 6) الحفاظ على درجة حرارة جسم المتلقي أثناء الجراحة وبعدها ، 7) استخدام المشبك اللاوعائي الذي يسمح بعزل IVC والشريان الأورطي للمفاغرة ، 8) السماح بمساحة كافية في البطن المتلقي لقلب المتبرع المتيبسة DCD ، 9) اختيار أدوات الأوعية الدموية الدقيقة ، 10) تجنب مضادات تخثر المتلقي ، 11) مفاغرة الدم المرقئ الدقيقة ، و 12) توفير تسكين وقائي للشفاء السلس من الجراحة. يوفر البروتوكول الموضح هنا تفاصيل كل خطوة لإعادة إنتاج النتائج بنجاح.

اعتمدت طريقة DCD الفئران HTx الموضحة هنا التعديلات لتحسين HTx غير المتجانسة الموصوفة في الأدبيات منذ الوصف الأول للفئران HTx بواسطة Abbott في عام 1964¹⁰. تشمل التعديلات الهامة في البروتوكول الموصوف أعلاه اختيار عامل التخدير. من السهل مراقبة الأيزوفلوران كعامل مخدر وتنظيمه إلى عمق التخدير المطلوب. أدى تكيف مفاغرة الشريان الأورطي القلبي المتبرع والشريان الرئوي جنبا إلى جنب مع الشريان الأورطي البطني المتلقي والوريد الأجوف السفلي على تقنية المفاغرة من طرف إلى طرف التي وصفها أبوت في البداية إلى القضاء على المعدل المرتفع للشلل النصفي والوفيات بعد الجراحة. لتجنب التسلخ المحيطي للشريان الأورطي ، والذي يمكن أن يتلف الأوعية القطنية ويخاطر بالشلل النصفي ، يفضل استخدام مشبك الأوعية الدموية اللارضية لعزل الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف. إلى جانب تقليل خطر الإصابة بالشلل النصفي ، فإن استخدام مشبك الأوعية الدموية أكثر كفاءة من حيث الوقت وأكثر مرقئا. نظرا لأن النفايات الأيضية والسموم تتراكم دائما بعد الإصابة الإقفارية في قلوب DCD ، فمن الضروري وجود استراتيجية فعالة لتنظيف القلب في وقت الشراء. من خلال قنية الشريان السباتي الأيمن بشكل فعال وتثبيت قوس الشريان الأبهري البعيد لإقلاع الشريان العضدي الرأسي ، يتم تحقيق التوصيل الفعال لمحلول الحفظ إلى قلب DCD وطرد النفايات الأيضية. الإعطاء الروتيني للمحلول الملحي تحت الجلد (1 مل/100 غ) قبل 10 دقائق من الاكتمال المتوقع لمفاغرة الأوعية الدموية يملأ بشكل استباقي فقدان الدم المتوقع من ثقوب الإبرة التي تحدث أثناء مفاغرة وحجم الدم اللازم لملء الأذين الأيمن للمتبرع والبطين عند إعادة التروية. هذا يتجنب انخفاض ضغط الدم المحتمل الذي قد يترتب على إطلاق المشبك الوعائي ، مما يخاطر بإعادة التروية الفعالة للقلب المزروع والجرذ المتلقي. يسمح إعطاء البوبرينورفين المسكن طويل المفعول قبل بدء الجراحة بالشفاء السلس للمتلقي. بدون السيطرة الكافية على الألم ، قد يتحرك الجرذ المتلقي بسرعة ، مما يعرض إرقاء مفاغرة الأوعية الدموية الهشة للخطر. إن إيلاء اهتمام دقيق للعديد من العوامل الموضحة في البروتوكول يحقق النجاح لعملية زراعة القلب DCD^{1،7،11،12،13}.

القيد الرئيسي لطريقة HTx للفئران DCD ، وجميع نماذج الفئران HTx الأخرى الموصوفة في الأدبيات ، هو حالة عدم عمل القلب المزروع^{6،7،11،12،13}. تتم دراسة التعديلات الضرورية لتحويل النموذج الحالي إلى نموذج قلب عامل في المستقبل. القيد الآخر هو الاستجابة المناعية لقلب المتبرع من المتلقي. من السهل التغلب على هذا القيد باستخدام الفئران المتزابكة للزرع. تم إجراء العديد من الفئران DCD HTx بنجاح باستخدام الفئران المتزاصلة ، والتي يقتصر استخدامها الروتيني على التكلفة العالية لشراء الفئران المتزاوية. على عكس قلوب اتفاقية التنوع البيولوجي ، لا تستأنف قلوب DCD النبض عند إعادة التروية في جسم المتلقي. ومع ذلك ، يتم إنشاء تدفق الدم التاجي ، حيث يتم تجميع كمية كبيرة منه في الجانب الأيمن من القلب أثناء تصريفه من الجيوب التاجية. إذا ظل هذا الدم راكدا ، فسوف يتجلط ، ويفشل الكسب غير المشروع. ومن ثم ، يوصى بالتفريغ الميكانيكي لغرف القلب اليمنى باستخدام قضيب طرف قطني ملفوف على سطح البطين الأيمن باتجاه الوريد الأجوف السفلي. إن الحفاظ على تدفق الشريان التاجي في قلب المتبرع ومنعه من الانتفاخ يسمح له باستئناف النبض في غضون 1-2 دقيقة. أثناء مفاغرة قلب المتبرع إلى الشريان الأورطي البطني / الوريد الأجوف للمتلقي ، يظل الجزء السفلي من جسم المتلقي إقفاريا (20-30 دقيقة) من انسداد الشريان الأورطي تحت الكلى. على عكس الأحشاء ، يمكن للأطراف أن تتحمل مدة أطول من نقص التروية (ما يزيد عن 2-3 ساعات) دون إصابة علنية. ومع ذلك ، فمن المحتمل جدا أن يؤثر إطلاق السيتوكينات من الأطراف المعاد نفخها على القلب المزروع. قد تتأثر وظيفة الكسب غير المشروع المزروعة ، إذا تم تقييمها في فترة أقصر من وقت إعادة التروية ، بإطلاق السيتوكينات. نظرا لأن إطلاق السيتوكين هو استجابة طور حادة ، فإن التأثير طويل المدى للسيتوكينات على وظيفة القلب المزروعة سيكون ضئيلا.

يساهم إنشاء نموذج متبرع بقلب DCD للفئران في الجسم الحي يشبه عملية DCD السريرية بشكل كبير في البحث الذي يركز على توسيع مجموعة قلب المتبرعين للزرع. قبل هذا المنشور ، استخدمت الأساليب الحالية نقص التروية العالمي عن طريق وضع قلب نابض أولا على نظام Langendorff (ex vivo) ثم إيقاف التدفق لبدء عملية DCD⁶. وبالتالي ، فإن النموذج الإقفاري خارج الجسم الحي له العديد من الاختلافات مقارنة بالعملية في الجسم الحي ، كما لوحظ في بروتوكول DCD السريري⁵. يشبه نموذج DCD الموصوف هنا إلى حد كبير عملية DCD السريرية وله فائدة أكبر في اختبار العوامل التي تهدف إلى التخفيف من إصابة إعادة التروية لقلب DCD.

يتبع بروتوكول DCD السريري الحالي بدقة "قاعدة المتبرع بالوفاة" ، حيث لا يسمح بأي تدخلات فيزيائية أو دوائية مصممة لتسهيل شراء الأعضاء حتى يتم إعلان وفاة المتبرع DCD. على هذا النحو ، فإن نقص التروية الدافئ لمختلف الأعضاء ، وخاصة القلب ، أمر لا مفر منه مع التبرع ب DCD. مع وضع عملية DCD السريرية في الاعتبار ، فإن نموذج DCD HTx للفئران الموصوف هنا يسمح فقط بنضح قلب المتبرع بعد الانقباض الكامل (الموت) وبعد 25 دقيقة من نقص التروية العالمي الدافئ. يجب أن تركز التدخلات الحاسمة التي يمكن دراستها في نموذج DCD للفئران على استهداف إصابة إعادة التروية ، والتي يمكن أن تساهم بنسبة تصل إلى 50٪ من إجمالي الإصابة الناجمة عن نقص التروية وإعادة التروية¹⁴. للتخفيف من إعادة التروية ، يمكن إضافة عوامل الإصابة إلى محلول الحفاظ على إعادة التروية الذي يتم تسليمه إلى قلب DCD في وقت الشراء ، مستهدفا سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا ، ومعدلات الالتهابات ، ومثبتات مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا¹⁵. العوامل الأخرى التي تمت دراستها على نماذج نقص التروية العالمية خارج الجسم الحي ، مثل مثبطات مضخة Na / H ، وتحمض النفوسات ، وعوامل توليد NO ، والإريثروبويتين ، والميلاتونين ، يمكن دراستها جميعا في الجسم الحي باستخدام نموذج DCD HTx الموصوف هنا. في الوقت الحاضر ، في الممارسة السريرية ، تعد مدة نقص التروية التي تزيد عن 30 دقيقة موانع لشراء قلب DCD ، حتى في بروتوكول الدراسة السريرية. ربما مع إجراء دقيق للدراسات باستخدام نموذج DCD للفئران HTx الموصوف هنا ، قد يقترح المجتمع العلمي تدخلات يمكن أن تسمح لنا يوما ما بإجراء DCD HTx السريري مع فترات إقفار أطول.

مؤلفو هذه المخطوطة ليس لديهم تضارب في المصالح للإفصاح عنهم.

تم دعم هذا العمل من خلال منحة مراجعة الجدارة الممنوحة للدكتور محمد كودر (1I01 BX003859) وأموال من مركز بولي للقلب لمحمد كودر والدكتور ستيفانو تولدو.