"CLARITY"로 장을 이미지화하다

조직 절편 없이 뉴런, 신경교세포, 장내분비세포(EEC)를 포함한 상피하 조직을 시각화할 수 있도록 마우스 장의 패시브 CLARITY(PACT) 염색 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 포름알데히드로 고정된 조직을 하이드로겔로 삽입하고 음이온 세제를 사용하여 조직을 "제거"하는 후속 탈지질을 포함합니다.

CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel)는 최근 탈lipidate 조직(절편 없이)하고 면역염색을 위한 3D 조직 구조를 보존하기 위한 아크릴아마이드 포매ing과 관련된 귀중한 기술로 발전했습니다. 이 기술은 항상성 및 질병 상태 동안 서로 다른 세포 유형이 상호 작용하는 역동적인 장 환경을 이미징하는 데 매우 관련이 있습니다. 쥐의 장에 최적화된 이 방법은 상피, 장내분비, 뉴런, 신경교세포와 같은 세포 유형을 추적하고 각각 미생물 감지 또는 영양 화학 감지를 매개하는 상피 또는 장 내분비 세포로의 뉴런 돌기를 추적하는 데 도움이 됩니다. 장 조직(1-1.5cm)은 1일차 4°C에서 하룻밤 동안 인산염 완충 식염수(PBS)의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정됩니다. 2일차에는 PFA를 버리고 조직을 PBS로 세 번 세척합니다. 조직은 4 ° C에서 밤새 PBS (30 % ProtoGel에서 희석)의 4 % 하이드로 겔 (아크릴 아미드) 용액에서 배양하여 무결성을 보존하기 위해 하이드로 겔이 내장되어 있습니다. 3일차에는 조직-하이드로겔 용액을 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 하이드로겔 중합을 허용합니다. 그런 다음 조직을 PBS로 부드럽게 세 번 세척하여 과도한 하이드로겔을 제거합니다. 탈lipidation(clearing)의 후속 단계에는 실온(RT)의 셰이커에서 2일(4일 및 5일) 동안 37°C에서 sodium dodecyl sulfate(PBS의 8% SDS)에서 조직 배양이 포함됩니다. 6일째에는 투명화된 조직을 PBS로 철저히 세척하여 SDS를 제거합니다. 조직은 1차 항체(0.3% Triton X-100을 함유한 PBS의 0.5% 일반 당나귀 혈청으로 희석)에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 RT에서 1.5시간 동안 적절한 2차 Alexa Fluor 항체에서 배양하고 DAPI(1: 10000)로 핵 염색하여 면역 염색할 수 있습니다. 조직은 깨끗한 유리 슬라이드로 옮겨지고 컨포칼 이미징을 위해 VectaShield를 사용하여 장착됩니다.

CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel)는 최근 면역염색(절편 없이)을 위한 3D 조직 구조를 보존하기 위해 아크릴아마이드(하이드로겔) 포매 및 조직 탈립화와 관련된 유용한 기술로 발전했습니다^1,2. 하이드로겔이 포매된 조직은 광학적으로 투명하고 거대분자 투과성이 있으며, 단백질과 핵산은 세제로 지질을 제거한 후에도 보존됩니다. CLARITY는 2013년 Science³에서 주목할 만한 10가지 혁신 중 하나로 선정되었습니다. 처음에는 지질이 광 산란 및 이미징 품질에 영향을 미치는 지질이 풍부한 뇌 조직을 이미징하기 위해 개발되었지만, 현재 장, 간, 신장 및 심장과 같은 다른 조직을 이미징하는 데 널리 사용되고 있습니다. 이 기술은 절편의 필요성을 제거하여 조직을 염색하고 이미지화할 수 있는 기능을 제공하며, 그렇지 않으면 세포 유형의 불규칙한 분포로 인해 세포-세포 상호 작용에 대한 편향된 평가가 발생할 수 있습니다. 이 기술은 또한 컨포칼 z-스택을 수행하고 조직의 3차원 이미지를 재현할 수 있는 기회를 제공하여 조직 절편보다 더 사실적으로 다양한 세포 유형 간의 밀도, 미세 구조 및 세포 간 상호 작용을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 기술은 뼈와 같은 조밀한 조직의 면역 염색과 현장 교잡 연구를 가능하게 하도록 수정되었습니다. 하이드로겔에 내장된 3D 조직은 파킨슨병, 알츠하이머병, 자폐 스펙트럼 장애 등과 같은 질병의 병태생리학을 이해하는 데 결정적인 것으로 최근 인용된 상피세포, 장내분비세포, 신경교세포 및 신경세포 세포 간의 상호 작용을 설명하기 위한 매력적인 플랫폼을 제공합니다⁴.

설명된 모든 동물 실험은 동물의 사용 및 관리에 관한 에모리 대학 위원회의 승인을 받았습니다. 생후 8-12주령의 C57BL/6 마우스(수컷과 암컷 모두 사용 가능)는 안락사 전에 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 허용되었습니다.

1. 장 제거 (1일차)

1. 이산화탄소 질식 방법으로 마우스를 1.6mL의 이산화탄소 가스의 유속으로 2분 동안 호흡이 멈출 때까지 안락사시킵니다.
2. 팔다리가 고정된 해부 보드에 마우스를 누운 상태로 놓습니다. 70% 에탄올로 복부를 살균하십시오. 집게를 사용하여 가위로 피부를 자릅니다.
3. 간을 부드럽게 들어 올리고 위를 확인합니다. 그런 다음 집게로 위를 잡고 위 바로 위의 식도를 잘라냅니다. 집게로 위를 잡고 장간막을 부드럽게 잘라내고 복강에서 직장까지 장을 분리합니다. 직장에서 분리된 장을 잘라냅니다.
4. 분리된 장을 페트리 접시에 담긴 얼음처럼 차가운 PBS 용액으로 옮깁니다. 이제 회장 분절 사이의 장간막을 부드럽게 잘라내고 장을 곧게 펴서 위부터 결장까지 모든 장간막이 잘려나가도록 합니다.
5. CLARITY 염색을 위해 원하는 장 부위의 1-1.5cm를 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 새 페트리 접시로 자릅니다.
6. 20G 바늘의 뭉툭한 끝 부분에 부착된 5mL 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 PBS로 배설물 내용물을 씻어냅니다.
   참고: 장의 모든 부위를 동일한 기술을 사용하여 CLARITY 염색에 사용할 수 있습니다. 장 분절은 장간막을 따라 절단하여 열거나 후속 단계를 위해 그대로 사용할 수 있습니다.

2. 장 조직의 고정 (1일차)

1. PBS의 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액에 조직을 고정합니다.
2. 1-1.5cm의 관심 장 분절 조각을 4°C에서 4% PFA로 채워진 15mL 원뿔형 튜브에 밤새 옮겨 고정합니다.

3. 하이드로겔 임베딩(2일차)

1. 집게가 있는 4% PFA 용액의 장 분절을 PBS 용액이 있는 새 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세 번(150-200rpm의 셰이커에서 각각 5분) 세척하여 잔류 PFA를 제거합니다.
2. 4% 하이드로겔의 제조
   1. 30 % 겔 용액 (ProtoGel)을 사용하여 하이드로 겔을 준비하십시오. 4% 하이드로겔 용액을 제조하기 위해 30% 원액을 PBS에 희석하여 희석합니다. 12mL의 4% 하이드로겔을 준비하려면 1.6mL의 30% 겔 용액을 취하고 10.4mL의 PBS를 추가합니다.
3. 3.1단계에서 고정 조직을 옮깁니다. 15ml 원뿔형 튜브에 PBS의 4% 하이드로겔 용액을 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   참고: 하룻밤 배양 후 PBS를 사용하여 조직을 PFA 없이 세척하는 것이 좋습니다. PFA에 더 오래 보관된 조직은 후속 단계 및 염색에서 좋은 결과를 제공하지 않습니다. PBS 세척 후 고정 조직은 일주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

4. 하이드로겔 중합 및 탈지분(투명화) 단계(3일차)

1. 하이드로겔 용액에 조직을 담고 있는 원뿔형 튜브를 4°C에서 꺼냅니다. 37°C 수조로 옮기고 1시간 동안 배양합니다. 이 단계는 하이드로겔 중합을 허용합니다.
2. 1시간 후, 수조의 하이드로겔 내장 조직이 들어 있는 원뿔형 튜브를 꺼내고 아크릴아미드 용액을 붓습니다. 이제 실온에서 PBS 1회 세척으로 조직을 부드럽게 헹구어 과도한 하이드로겔을 제거합니다.
3. 탈lipidation 단계
   1. PBS에서 sodium dodecyl sulfate (8% SDS)에서 조직을 배양하여 탈지판류. 하이드로겔 내장 조직을 4.2단계에서 50mL 코니컬 튜브에 8% SDS 용액으로 옮깁니다. 조직이 SDS 용액에 완전히 잠겨 있고 튜브가 덮여 있는지 확인하십시오.
   2. SDS의 조직을 포함하는 뚜껑이 있는 50mL 튜브를 실온에서 37°C 쉐이커(200rpm)에 2일(4일 및 5일) 동안 옮겨 탈lipidation을 허용합니다.
      알림: 배양 2일 동안 37°C에서 발생할 수 있는 증발을 보상하기 위해 50mL 원추형 튜브에 SDS 용액이 최소 25-2mL까지 채워져 있는지 확인하십시오.
4. 4일차와 5일차에는 실온에서 37°C 쉐이커(200rpm)로 SDS에서 조직을 배양합니다.

5. 청소된 티슈에서 세제를 씻어냅니다(6일차)

1. SDS 용액에서 조직을 가져옵니다. 조직이 '투명'하거나 투명하게 나타납니다.
2. 조직을 PBS 용액이 든 새로운 50mL 코미컬 튜브로 옮기고 PBS를 여러 번 변경하여 실온에서 셰이커(150-200rpm)로 하루 동안 세척하여 SDS의 모든 흔적이 제거되도록 합니다. PBS 용액을 10회 이상 변경하면 조직이 SDS에서 벗어날 수 있으며, 최종 PBS 세척 시 SDS의 거품/거품 흔적이 없는지 확인하는 것이 좋습니다. SDS가 후속 염색 단계를 방해할 수 있으므로 이는 중요한 단계입니다.
   참고: 하루가 끝나면 PBS에서 여러 번 세척한 후 세척된 조직은 이제 면역 염색 준비가 되었거나 최대 3주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
3. 투명해진 장 조직을 PBS 용액에 한 달 이상 보관하면 조직의 무결성과 염색 품질에 영향을 미칩니다. 최상의 결과를 위해 세척된 장 조직을 즉시 또는 세척 후 1-2주 이내에 사용하십시오.

6. 신경세포, 신경교세포와 장내분비세포를 위한 면역형광성 염색

1. 세척된 조직을 1.5 또는 2 mL 튜브로 옮기고 0.3% Triton X-100)을 함유한 PBS의 0.5% 일반 당나귀 혈청에 희석된 각 1차 항체 500 μL 부피에서 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 사용된 항체(Ab): Tuj1 또는 β-3-tubulin(Pan neuronal marker, 1:1000), Glial Fibrillary Acid Protein(GFAP, 1:500), Chromogranin A(1:250).
2. 하룻밤 배양 후, 조직을 3회 PBS 세척(1-1.5mL의 PBS를 사용하여 각각 5분)하여 결합되지 않은 원발성 Ab를 제거합니다.
3. 조직을 새 튜브로 옮긴 후 어두운 곳의 실온에서 1.5시간 동안 500μL의 적절한 2차 Alexa Fluor Ab(AF)로 배양합니다. 사용되는 2차 Ab는 Tuj1 (1:1000)에 대한 AF 488, GFAP (1:500)에 대한 AF-555 및 Chromogranin A에 대한 AF 555 (1:250)입니다.
4. 배양 후 6.2 단계와 같이 PBS로 조직을 세 번 씻습니다.
5. 핵을 염색하기 위해 실온에서 5분 동안 DAPI(1: 10000 희석 또는 2mL PBS에서 0.2μL)로 조직을 배양합니다.
6. 마지막으로, 염색된 조직을 깨끗한 유리 슬라이드로 옮기고, 조직 위에 커버슬립을 추가하고, 컨포칼 이미징을 위해 100μL의 VectaShield를 사용하여 장착합니다.
7. 건조를 위해 30분 동안 슬라이드 홀더에 실온의 어두운 곳에 슬라이드를 놓은 후 -20°C에서 이미지를 촬영하거나 보관할 수 있습니다. 쥐의 장 벽은 상당히 얇으며 장간막을 따라 열리면 커버슬립을 사용하여 유리 슬라이드에 직접 장착할 수 있습니다. 비장, 신장, 챔버(캐비티) 슬라이드 또는 스페이서와 같은 더 큰 조직으로 작업하는 경우 사용할 수 있습니다. 이와 같은 더 큰 조직의 경우 캐비티 슬라이드를 장착에 사용할 수 있습니다.
   알림: 시작 단계에서 장 분절을 절단하지 않은 경우(1단계의 참고 참조) 장착과 관련된 단계를 용이하게 하기 위해 마이크로 가위로 장 튜브를 절단하는 것이 좋습니다.

7. 컨포칼 이미징

참고: 투명하고 염색 및 장착된 조직은 즉시 이미징하거나 -20°C의 슬라이드 상자에 보관할 수 있습니다.

1. 컨포칼 현미경(예: Olympus FV1000)을 사용한 이미지.
2. 50μm 두께의 장 조직을 가로지르는 z-스택을 사용하여 장 내강에서 장액층까지의 영역을 시각화합니다.
3. z 스택 이미지를 이미지 파일로 저장하거나 .avi 동영상 파일로 저장하거나 소프트웨어의 도움으로 3D 이미지로 변환⁵.

CLARITY가 제거된 쥐의 장 조직의 이미지는 그림 1에 나와 있습니다. 프로토콜이 성공적으로 완료되면 모든 세포 세부 사항을 명확하게 시각화할 수 있는 고품질의 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 핵에 대한 DAPI 염색은 조직 무결성을 나타낼 수 있으므로 CLARITY 프로토콜과 후속 면역 염색의 품질을 평가하기 위한 매우 좋은 지표입니다. 또한, 세포 모양은 특히 뚜렷한 세포 형태를 가진 신경세포, 신경교세포(glial) 및 장내분비세포(enteroendocrine cell)의 경우 프로토콜이 어떻게 성공적이었는지에 대한 단서를 제공합니다. 부족한/비정상적인 염색으로 뒤틀린 세포는 조직 준비가 손상되었음을 나타냅니다.

범 신경 세포 마커 Tuj1 (β-3-tubulin, red)로 염색되고 glial marker Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP, 녹색)과 함께 염색된 마우스 회장은 그림 1A에 나와 있습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 z-스택에서 생성된 뉴런 마커 Tuj1(빨간색)으로 염색된 마우스 결장의 3D 이미지가 그림 1B에 나와 있습니다. 마우스 결장에서 Chromogranin A를 생성하는 장 내분비 세포의 염색은 그림 1C에 나와 있습니다. 모든 이미지에서 파란색은 DAPI로 인한 핵 염색을 나타냅니다. 그림 1A 와 그림 1B 는 40배 배율로, 그림 1C 는 60배 배율로 캡처되었습니다. 그림 1A 에 나타난 바와 같은 동시 염색은 특정 세포 유형, 면역 세포 등의 수용체 또는 DAPI와의 핵 공동 국소화와 같은 다양한 관심 마커의 공동 국소화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 3D 이미지를 사용하여 두 실험 조건 또는 야생형 및 녹아웃 마우스 균주 간의 세포 밀도(예: myenteric neuronal density)를 비교할 수 있습니다. 뉴런 투영의 밀도는 3D 이미지에서도 평가할 수 있습니다. 정상 및 병태생리학적 조건에서 관심 수용체를 가진 장내분비세포 집단의 변화는 그림 1C와 같이 Chromogranin과 같은 다양한 마커에 대해 염색하여 평가할 수 있습니다. 또한 상피 장벽 무결성을 유지하는 다양한 밀접 접합 단백질의 강도 변화 및/또는 국소화는 정상 또는 염증성 조건에서 CLARITY 염색을 통해 평가할 수 있습니다. 투명화된 비장 조직은 염증성 마우스 모델과 관련된 연구 관심사에 따라 특정 면역 세포 유형에 대해 염색될 수 있습니다.

따라서 시간이 많이 걸리는 절편 단계와 항원 회수 프로세스 없이 z 스택을 통해 전체 두께에 걸쳐 조직을 훨씬 더 높은 품질과 디테일로 시각화할 수 있으며 3D로 세부 정보를 제공할 수 있습니다. 이 기술은 또한 식염수가 관류된 동물의 조직을 염색하는 데에도 사용할 수 있다는 장점이 있습니다.

그림 1: 투명화된 장 조직의 대표적인 면역 염색. 핵 염색 DAPI가 있는 ( A) 신경 마커 Tuj1(β-3-tubulin) 및 신경교세포 마커 Glial Fibrillary Acid Protein(GFAP)으로 염색된 투명화된 마우스 회장의 컨포칼 이미지(enface) 및 (B) Tuj1로 염색된 마우스 결장의 z 스택에서 생성된 3D 이미지 (C) Chromogranin A 및 DAPI로 염색된 투명 마우스 결장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

CLARITY 방법은 상피, 뉴런 및 신경교세포를 포함한 다양한 세포 유형, 특히 장 벽을 가로질러 내강⁵ 및 신경교세포 및 뇌파세포에 이르는 신경 분포를 3D로 시각화하기 위해 마우스 장을 염색하는 데 매우 유용합니다. 여기에 제시된 방법은 Yang et al., 2014,¹.

프로토콜의 중요한 단계에는 하룻밤 동안 장 조직을 고정한 후 고정제를 즉시 헹구고, 후속 하이드로겔 포매 및 탈지질이 포함됩니다. 탈lipidation 후 PBS 세척은 탈lipidation 단계에서 사용되는 잔류 세제를 제거하는 데 중요합니다.

CLARITY 염색은 절편 없이 조직 구조, 단백질 및 핵산을 보존하는 조직 이미징이 가능하고, 관류 조직에서도 우수한 품질의 이미지를 제공하며, 조직 미세 구조 및 뉴런-아교세포, EEC-아교세포 등과 같은 세포 상호 작용에 대한 3D 평가가 가능하다는 점에서 우수합니다. 또한 CLARITY 염색 슬라이드는 -20°C에서 보관한 후에도 우수한 형광을 유지하므로 필요한 경우 나중에 이미지화할 수 있는 것으로 관찰됩니다.

또한 CLARITY 기술을 몇 가지 수정하여 현장 혼성화 연구에 적합하게 만들었습니다. 예를 들어, 카르보디이미드 기반 고정을 사용하여 공정을 수정하면 핵산(RNA)의 무결성을 보존하고 후속 정량화를 수행하는 데 도움이 될 수 있습니다⁶. 2012년에는 쥐의 뇌와 척수 조직, 그리고 초파리(Drosophila melanogaster , 초파리)의 전신을 투명화하기 위해 3D 이미징 of solvent-cleared organs(3DISCO)라는 새로운 방법이 개발되었습니다. 3DISCO는 조직의 파라 포름알데히드 고정, 물 속의 테트라하이드로푸란을 50-100% 사용하여 연속 탈수 단계, 디클로로메탄으로 지질을 추출한 후 마지막으로 굴절률 정합을 위해 디벤질 에테르에 담그는 작업을 포함합니다. 3DISCO 프로토콜은 형질전환 모델에서 녹색 형광 단백질과 같은 강력한 형광단이 있는 고정 조직에 가장 적합합니다. iDISCO(immunolabeling-enabled imaging of solvent-approved organs) 및 uDISCO(ultimate labelling of solvent-cleaned organs)와 같은 3DISCO 프로토콜의 여러 수정 사항이 투명화 전 면역 염색(iDISCO)과 형광 보존(uDISCO)을 허용하도록 완벽해졌습니다. CUBIC은 2014년에 개발된 또 다른 투명화 방법으로, 지질 외에도 철 기반 광흡수 발색단도 조직에서 제거됩니다. 다양한 조직과 권장되는 세척 과정에 대한 비교는 Muntifering et al. (2018)⁷의 우아한 리뷰에 자세히 설명되어 있습니다.

CLARITY는 또한 정상 및 병리학적 조건에서 세포 밀도(뉴런, 면역 세포 등)를 측정하고 비교할 수 있는 훌륭한 도구입니다. 예를 들어, 면역 세포가 장 조직과 신경절로 침투하는 것을 특징으로 하는 숙주-병원체 상호 작용 또는 염증은 CLARITY 염색으로 정량화할 수 있으며 조직 절편에서 얻은 이미지에서 세포 수를 열거하는 것보다 우수합니다⁸. 마찬가지로, 점막하 및 근육신경총의 신경세포와 신경교세포의 밀도를 정량화하는 것은 점막하 뉴런 또는 신경교세포군을 구별할 수 있는 특정 마커가 없기 때문에 CLARITY 염색을 통해 가능합니다⁵.

이러한 한계는 조직을 탈립화하거나 제거하는 데 필요한 비교적 긴 시간을 포함하며, 장 조직에 5일이 필요합니다. 뉴런, 신경교세포(glia 및 EEC) 외에도 제거된 조직은 장의 다양한 면역 세포 유형과 간, 비장 및 신장과 같은 다른 조직에 대해 염색할 수 있습니다. 간과 같은 큰 조직은 제거하는 데 더 많은 탈lipidation 시간(3-5일)이 필요하기 때문에 이러한 조직을 제거하기 위해 delipidation 단계를 적절하게 수정해야 합니다.

CLARITY 염색은 상피, 장 내분비, 신경 세포, 신경교세포 및 면역 세포에 초점을 맞추고 항상성 및 병리학적 조건에서 세포 밀도(신경세포, 면역 또는 신경교세포 밀도)와 세포 간 상호 작용을 측정하여 장 환경을 이미지화하는 데 유용한 도구입니다. 파킨슨병, 알츠하이머병, 자폐스펙트럼장애4와 같은 뇌-장 질환의 병태생리학에 면역-신경세포, 면역-아교세포, 신경교세포-아교세포(glia-gellia and glia-EEC) 간의 상호작용이 밀접하게 관련되어 있기^때문에, CLARITY는 역동적인 장 환경을 이미지화하고 장내 특성을 진행중인 뇌 병리학과 연관시킬 수 있는 훌륭한 도구가 될 것입니다. 또한 특정 세포 유형에 대한 CLARITY 염색은 질병 병리학의 마커 또는 지표로 사용될 수도 있습니다. 예를 들어, 장에 시누클레인과 같은 비정상적인 단백질이 축적되고 장 운동성의 변화는 뇌 병리학의 발달 및 인지 행동의 변화와 관련이 있을 수 있습니다.

따라서 CLARITY는 세포 유형의 불균일한 분포와 관련하여 조직 절편으로 인해 발생할 수 있는 해석의 편향 없이 온전한 조직에서 3D로 무제한의 이미징 가능성을 제공합니다. 또한, 용매 투명화 장기의 3차원 이미징(3DISCO)과 같은 조직 투명화 방법의 다양한 변형은 유기 용매를 사용하여 발전해 왔습니다 ^9,10. 더 나아가 CLARITY 방법은 조직 무결성과 RNA 안정성을 향상시켜 투명화된 조직에서 제자리 혼성화에 대한 더 많은 가능성을 제공하기 위해 카르보디이미드 기반 화학을 통합하도록 광범위하게 수정되었으며, 이는 다양한 질병 병리학과 관련된 microRNA 분석에 활용될 수 있습니다⁶. 이 방법은 또한 뇌¹, 골격근¹¹, 난소¹²와 같은 다른 마우스 조직 및 인간 생검 조직¹³, 얼룩말 물고기⁸ 및 초파리와 같은 기타 연구 관심 조직을 염색하는 데 적합하게 적용될 수 있으며, 이는 쥐 모델 외에도 주요 연구 모델이기도 합니다.

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저자는 미국 소화기학회(American Gastroenterology Association, AGA), AGA-Rome Functional GI motility Disorders Pilot Research Award(BC), 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 AI64462(ASN) 및 Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core의 지원에 감사를 표합니다.