הדמיית המעיים ב"בהירות"

אנו מתארים את הפרוטוקול לצביעה פסיבית של CLARITY (PACT) של מעי עכבר כדי לאפשר הדמיה של רקמות תת-אפיתליות, כולל נוירונים, תאים גליה ותאים אנטרואנדוקריניים (EEC) ללא חתך רקמות. הפרוטוקול כולל הטמעת הידרוג'ל של רקמה קבועה בפורמלדהיד, והסרת שומנים לאחר מכן באמצעות חומר ניקוי אניוני כדי "לנקות" את הרקמה.

CLARITY (רקמה תואמת הדמיה קשיחה היברידית של אקרילאמיד שקופה) התפתחה לאחרונה כטכניקה רבת ערך הכוללת הטמעת אקרילאמיד לרקמת דליפידאט (ללא חתך) ולשימור מבנה הרקמה התלת-ממדית לצביעה חיסונית. הטכניקה רלוונטית מאוד בהדמיית סביבת המעיים הדינמית שבה סוגי תאים שונים מתקשרים במהלך הומאוסטזיס ומצבי מחלה. שיטה זו המותאמת למעי העכבר מתוארת כאן, המסייעת לעקוב אחר סוגי תאים כמו אפיתליה, אנטרואנדוקרינית, נוירונים, גליה וההקרנות העצביות לתוך תאי האפיתל או האנטרואנדוקריניים המתווכים חישה מיקרוביאלית או חישת כימותרפיה תזונתית בהתאמה. רקמת המעי (1-1.5 ס"מ) מקובעת ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה ביום הראשון. ביום השני, PFA מושלך, והרקמה נשטפת שלוש פעמים עם PBS. הרקמה מוטמעת בהידרוג'ל כדי לשמור על שלמותה על ידי דגירה בתמיסת הידרוג'ל 4% (אקרילאמיד) ב-PBS (מדולל מ-30% פרוטו-ג'ל) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. ביום השלישי, תמיסת הרקמה-הידרוג'ל מודגרת ב-37  מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר פילמור הידרוג'ל. לאחר מכן שוטפים את הרקמה שלוש פעמים בעדינות עם PBS כדי להסיר עודפי הידרוג'ל. השלב הבא של הסרת שומנים (ניקוי) כולל דגירה של רקמות בנתרן דודציל סולפט (8% SDS ב-PBS) ב-37 מעלות צלזיוס למשך יומיים (ימים 4 ו-5) על שייקר בטמפרטורת החדר (RT). ביום 6, הרקמה המנוקה נשטפת ביסודיות עם PBS כדי להסיר SDS. רקמה יכולה להיות מוכתמת חיסונית על ידי דגירה בנוגדנים ראשוניים (מדולל בסרום חמור רגיל של 0.5% ב-PBS המכיל 0.3% טריטון X-100), לילה ב-4 מעלות צלזיוס, ודגירה לאחר מכן בנוגדנים משניים מתאימים של Alexa Fluor למשך 1.5 שעות ב-RT, וצביעה גרעינית עם DAPI (1: 10000). הרקמה מועברת על מגלשת זכוכית נקייה ומורכבת באמצעות VectaShield להדמיה קונפוקלית.

CLARITY (רקמה תואמת הדמיה קשיחה hYdrogel) התפתחה לאחרונה כטכניקה רבת ערך הכוללת הטמעת אקרילאמיד (הידרוג'ל) והסרת שומנים ברקמות כדי לשמר את מבנה הרקמה התלת-ממדי לצביעה חיסונית (ללא חתך)^1,2. הרקמה המוטמעת בהידרוג'ל שקופה אופטית וחדירה למקרומולקולות, כאשר חלבונים וחומצות גרעין נשמרים לאחר הסרת השומנים על ידי חומר ניקוי. CLARITY הוכרה כאחת מעשר פריצות דרך בולטות בשנת 2013 על ידי Science³. למרות שפותחה בתחילה כדי לדמות רקמות מוח עשירות בשומנים שבהן שומנים משפיעים על פיזור האור ואיכות ההדמיה, הטכניקה נמצאת כיום בשימוש נרחב להדמיית רקמות אחרות כמו מעיים, כבד, כליות ולב. הטכניקה מציעה את היכולת לצבוע ולדמות רקמה על ידי ביטול הצורך בחיתוך, מה שאחרת עלול לגרום להערכה מוטה של אינטראקציות תא-תא עקב התפלגות לא סדירה של סוגי תאים. הטכניקה מספקת גם את ההזדמנות לבצע ערימות z קונפוקליות ולשחזר תמונה תלת מימדית של הרקמה, מה שיכול לעזור לקבוע את הצפיפות, המיקרו-ארכיטקטורה והאינטראקציה בין תאים-תאים בין סוגי תאים שונים בצורה מציאותית יותר מאשר מקטע רקמה. יתר על כן, הטכניקה שונתה כדי לאפשר צביעה חיסונית של רקמות צפופות כמו עצם, כמו גם מחקרי הכלאה באתרם. רקמת התלת מימד המוטמעת בהידרוג'ל מציעה פלטפורמה אטרקטיבית להבהרת האינטראקציות בין תאי אפיתל, אנטרואנדוקרינים, גליה ותאי עצב, שצוטטו לאחרונה כחיוניים להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות כמו מחלת פרקינסון, אלצהיימר, הפרעות בספקטרום האוטיסטי וכו^'.

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת אמורי לשימוש וטיפול בבעלי חיים. עכברי C57BL/6 (ניתן להשתמש גם בזכר וגם בנקבה) בגיל 8-12 שבועות קיבלו גישה חופשית למזון ולמים לפני המתת חסד.

1. הסרת מעי (יום 1)

1. המתת חסד של העכבר בשיטת חנק פחמן דו חמצני, בקצב זרימה של 1.6 מ"ל גז פחמן דו חמצני עד להפסקת הנשימה למשך 2 דקות).
2. הנח את העכבר על לוח ניתוח עם גפיים מוצמדות. עקר את הבטן עם 70% אתנול. בעזרת מלקחיים חותכים את העור במספריים.
3. הרם את הכבד בעדינות וזהה את הקיבה. ואז החזק את הבטן במלקחיים, חתך את הוושט ממש מעל הקיבה. החזק את הבטן בעזרת מלקחיים, גזור בעדינות את המזנטריות ונתק את המעי מחלל הבטן עד פי הטבעת. חותכים את המעי המנותק בפי הטבעת.
4. העבירו את המעי המנותק לתמיסת PBS קרה כקרח בצלחת פטרי. כעת חתכו בעדינות את המזנטריה בין הקטעים האילאליים ויישרו את המעי כך שהחל מהקיבה כל המזנטריות ייחתכו, עד למעי הגס.
5. חותכים 1-1.5 ס"מ מאזור המעי הרצוי לצביעה של CLARITY לצלחת פטרי חדשה המכילה PBS קר כקרח.
6. בעזרת מזרק של 5 מ"ל המחובר לקצה קהה של מחט 20 גרם, שטפו את תכולת הצואה עם PBS קר כקרח.
   הערה: ניתן להשתמש בכל אזור במעיים לצביעה של CLARITY באותה טכניקה. ניתן לחתוך את מקטע המעי לאורך המזנטריה או להשתמש בו בשלמותו עבור השלבים הבאים.

2. קיבוע רקמת המעי (יום 1)

1. תקן את הרקמה בתמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS.
2. העבירו חתיכה של 1-1.5 ס"מ של קטע מעי מעניין לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל מלא ב-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לקיבוע.

3. הטמעת הידרוג'ל (יום 2)

1. העבירו את מקטע המעי מתמיסת PFA 4% עם מלקחיים לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל עם תמיסת PBS ושטפו שלוש פעמים (5 דקות כל אחת, על שייקר במהירות 150-200 סל"ד) כדי להסיר שאריות PFA.
2. הכנת הידרוג'ל 4%
   1. השתמש בתמיסת ג'ל 30% (ProtoGel) להכנת ההידרוג'ל. להכנת תמיסת הידרוג'ל 4%, יש לדלל את תמיסת המלאי של 30% מדוללת ב- PBS. להכנת 12 מ"ל של 4% הידרוג'ל, קחו 1.6 מ"ל של תמיסת ג'ל 30% והוסיפו 10.4 מ"ל PBS.
3. העבר את הרקמה הקבועה משלב 3.1. לתמיסת הידרוג'ל 4% ב-PBS בשפופרת חרוטית של 15 מ"ל ומודגרת ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: מומלץ מאוד לשטוף את הרקמה ללא PFA באמצעות PBS לאחר דגירה של לילה. רקמה המאוחסנת זמן רב יותר ב-PFA אינה נותנת תוצאות טובות עם השלבים והצביעה הבאים. ניתן לאחסן את הטישו הקבוע לאחר שטיפת PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע.

4. שלב פילמור הידרוג'ל והסרת שומנים (ניקוי) (יום 3)

1. הוצא את הצינור החרוטי המכיל את הרקמה בתמיסת הידרוג'ל מ-4 מעלות צלזיוס. מעבירים לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים למשך שעה. שלב זה מאפשר פילמור הידרוג'ל.
2. לאחר שעה, הוציאו את הצינור החרוטי המכיל את הרקמה המוטמעת בהידרוג'ל של אמבט המים, ושפכו את תמיסת האקרילאמיד. כעת שטפו בעדינות את הטישו עם שטיפת PBS אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר את עודפי ההידרוג'ל.
3. שלב הפחתת שומנים
   1. דליפידאט על ידי דגירה של הרקמה בנתרן דודציל סולפט (8% SDS) ב-PBS. העבירו את הרקמה המוטמעת בהידרוג'ל משלב 4.2 לתמיסת SDS של 8% בצינור חרוטי של 50 מ"ל. ודא שהרקמה שקועה לחלוטין בתמיסת SDS, ושהצינור מכוסה.
   2. העבירו את הצינור המכוסה בנפח 50 מ"ל המכיל את הרקמה ב-SDS על שייקר של 37 מעלות צלזיוס (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך יומיים (ימים 4 ו-5) כדי לאפשר הסרת שומן.
      הערה: ודא שתמיסת SDS ממולאת עד לפחות 20-25 מ"ל בצינור החרוטי של 50 מ"ל, כדי לפצות על כל אידוי שעלול להתרחש ב-37 מעלות צלזיוס במהלך 2 ימי הדגירה.
4. בימים 4 ו-5, יש לדגור את הרקמה ב-SDS בשייקר של 37 מעלות צלזיוס (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר.

5. שטיפת חומר הניקוי מהטישו הנקי (יום 6)

1. קח את הרקמה מתמיסת SDS. הרקמה תיראה 'שקופה' או שקופה.
2. העבירו את הטישו לצינור קומיקס חדש של 50 מ"ל עם תמיסת PBS ושטפו במהלך היום על שייקר (150-200 סל"ד) בטמפרטורת החדר עם מספר שינויים של PBS, כדי להבטיח שכל עקבות ה-SDS יוסרו. לפחות 10 שינויים בתמיסת PBS יבטיחו שהרקמה תהיה נקייה מה-SDS, וכלל אצבע טוב הוא לבדוק אם בשטיפת ה-PBS הסופית אין עקבות של קצף/קצף מה-SDS. זהו שלב קריטי מכיוון ש-SDS יכול להפריע לשלבי הצביעה הבאים.
   הערה: בסופו של יום, הרקמה שנוקה לאחר מספר שטיפות ב-PBS מוכנה כעת לצביעה חיסונית או אולי מאוחסנת ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
3. אחסון רקמות מעיים נקיות במשך יותר מחודש בתמיסת PBS ישפיע על שלמות הרקמה ואיכות הצביעה. השתמש ברקמת המעי שנוקה באופן מיידי או תוך 1-2 שבועות מרגע הניקוי לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

6. צביעה אימונו-פלואורסצנטית לנוירונים, גליה ותאי אנטרואנדוקרינית

1. העבירו את הרקמה שפונה לצינור של 1.5 או 2 מ"ל ודגרו בנפח של 500 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים מדוללים בסרום חמור רגיל של 0.5% ב-PBS המכיל 0.3% טריטון X-100) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. הנוגדנים (Ab) בהם נעשה שימוש: Tuj1 או β-3-tubulin (סמן עצבי פאן, 1: 1000), חלבון חומצה סיבית גליאלית (GFAP, 1: 500), כרומוגרנין A (1: 250).
2. לאחר הדגירה של הלילה, הכניסו את הרקמה ל-3 שטיפות PBS (5 דקות כל אחת באמצעות 1-1.5 מ"ל PBS) כדי להסיר את ה-Ab הראשוני הלא קשור.
3. העבירו את הרקמה לצינור חדש, ולאחר מכן דגרו עם 500 מיקרוליטר של Alexa Fluor Ab (AF) משני מתאים למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. ה-Ab המשני המשמש הוא AF 488 עבור Tuj1 (1:1000), AF-555 עבור GFAP (1:500) ו-AF 555 (1:250) עבור כרומוגרנין A.
4. לאחר הדגירה יש לשטוף את הטישו שלוש פעמים עם PBS כמו בשלב 6.2.
5. לצורך צביעת הגרעינים, דגרו את הרקמה ב-DAPI (1: 10000 דילול או 0.2 מיקרוליטר ב-2 מ"ל PBS) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
6. לבסוף, העבירו את הרקמה המוכתמת על מגלשת זכוכית נקייה, הוסיפו כיסוי על גבי הרקמה והרכיבו באמצעות 100 מיקרוליטר של VectaShield להדמיה קונפוקלית.
7. הנח את השקופיות בחושך בטמפרטורת החדר במחזיק שקופיות למשך 30 דקות לייבוש, ולאחר מכן ניתן לצלם אותן או לאחסן אותן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. קיר המעיים של העכבר דק למדי וברגע שנפתח לאורך המזנטריה, ניתן להרכיב אותו על שקופיות זכוכית ישירות עם כיסוי. אם עובדים עם רקמות גדולות יותר כמו טחול, כליות, מגלשות תא (חלל) או מרווחים. עבור רקמות גדולות יותר כמו, ניתן להשתמש במגלשת חלל להרכבה.
   הערה: יש לציין שאם קטע המעי לא נחתך בשלב ההתחלתי (עיין בהערה בשלב 1), רצוי לחתוך את צינור המעי עם מספריים מיקרו שיקלו על השלבים הכרוכים בהרכבה.

7. הדמיה קונפוקלית

הערה: ניתן לדמות את הרקמה הנקייה, המוכתמת והמותקנת באופן מיידי או לאחסן אותה בקופסאות שקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

1. תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (למשל, אולימפוס FV1000).
2. קח ערימות z בעובי של 50 מיקרומטר של רקמת המעי כדי לדמיין את האזורים מלומן המעי לכיוון שכבת הסרוסל.
3. אחסן את תמונות ערימת z כקבצי תמונה, קבצי סרטים .avi או המרה לתמונה תלת מימדית בעזרת התוכנה⁵.

התמונות מרקמת המעיים של העכבר שאושרה על ידי CLARITY מיוצגות באיור 1. השלמה מוצלחת של הפרוטוקול מניבה תמונות חדות באיכות גבוהה שבהן ניתן להמחיש את כל הפרטים הסלולריים בבירור. צביעת DAPI לגרעינים היא אינדקס טוב מאוד להערכת איכות פרוטוקול CLARITY והצביעה החיסונית שלאחר מכן מכיוון שהיא יכולה לתאר את שלמות הרקמה. יתר על כן, צורת התא מספקת גם רמז כיצד הפרוטוקול הצליח במיוחד במקרה של תאים עצביים, גליאליים ואנטרואנדוקריניים עם מורפולוגיה תאית מובהקת. תא מעוות עם צביעה דלה/חריגה מראה שהכנת הרקמה נפגעה.

אילאום העכבר צבוע בסמן פאן נוירונלי Tuj1 (β-3-טובולין, אדום) וצבוע במשותף עם סמן גליה חלבון חומצה סיבית גליאלית (GFAP, ירוק) מוצג באיור 1A. תמונה תלת-ממדית של מעי גס של עכבר מוכתם בסמן עצבי Tuj1 (אדום) שנוצר מערימת ה-z באמצעות תוכנת ההדמיה מוצגת באיור 1B. הצביעה של תאים אנטרואנדוקריניים המייצרים כרומוגרנין A במעי הגס של העכבר מוצגת באיור 1C. בכל התמונות, כחול מייצג את הכתם הגרעיני עם DAPI. איור 1A ואיור 1B נלכדו בהגדלה של פי 40 ואיור 1C בהגדלה של פי 60. ניתן להשתמש בצביעה משותפת כפי שהיא מיוצגת באיור 1A כדי להעריך לוקליזציה משותפת של סמנים מעניינים שונים כמו קולטנים על סוגי תאים ספציפיים, תאים חיסוניים וכו' או לוקליזציה גרעינית עם DAPI. ניתן להשתמש בתמונות תלת מימד כדי להשוות צפיפות תאים (למשל צפיפות עצבית מיאנטרית) בין שני תנאי ניסוי או זן עכבר מסוג פרא ונוקאאוט וכו'. ניתן להעריך את צפיפות ההקרנות העצביות גם בתמונות תלת מימד. ניתן להעריך שינויים באוכלוסיות תאים אנטרואנדוקריניים עם קולטנים מעניינים בתנאים נורמליים ופתופיזיולוגיים על ידי צביעה עבור סמנים שונים כמו כרומוגרנין כפי שמוצג באיור 1C. בנוסף, ניתן להעריך שינויים בעוצמה ו/או בלוקליזציה של חלבוני צומת הדוקים שונים השומרים על שלמות מחסום האפיתל באמצעות צביעת CLARITY בתנאים רגילים או דלקתיים. רקמות טחול נקיות עשויות להיות מוכתמות עבור סוגי תאים חיסוניים ספציפיים בהתבסס על תחומי המחקר הכוללים מודלים דלקתיים של עכברים.

לפיכך, ללא שלבי החיתוך הגוזלים זמן, ותהליכי אחזור אנטיגן, ניתן לדמיין את הרקמה באיכות ובפרטים גבוהים בהרבה על פני כל עוביה באמצעות ערימות z, ויכולה לספק את הפרטים בתלת מימד. לטכניקה יש גם יתרון בכך שהיא יכולה לשמש גם לצביעת רקמות מבעלי חיים מלוחים.

איור 1: צביעה חיסונית מייצגת של רקמות מעיים נקיות. תמונות קונפוקליות (פנים) של (A) אילאום עכבר מנוקה מוכתם בסמן עצבי Tuj1 (β-3-tubulin) וסמן גליה חלבון חומצה סיבית גליאלית (GFAP), עם DAPI כתם גרעיני ו- (B) תמונה תלת מימדית שנוצרה מערימות z של מעי גס עכבר מוכתם ב-Tuj1 (C) מעי גס עכבר נקי מוכתם בכרומוגרנין A ו-DAPI. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

שיטת CLARITY שימושית מאוד לצביעה של מעי עכבר כדי להמחיש סוגי תאים שונים כולל אפיתליה, נוירונים ותאי גליה בתלת מימד, במיוחד רשת ההקרנות העצביות המשתרעות על פני דופן המעי עד לומן⁵ והעצבוב שלהם לתאי גליה ו-EEC. השיטה המוצגת כאן שונתה בהתאם למחקר המקורי של Yang et al. 2014¹.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים שטיפה מיידית של הקיבוע לאחר קיבוע לילה של רקמת המעי, הטמעת הידרוג'ל לאחר מכן והסרת שומן. שטיפות ה-PBS לאחר הסרת השומנים חיוניות להסרת חומר הניקוי הנותר המשמש בשלב הסרת השומן.

צביעת ה-CLARITY עדיפה בכך שהיא מאפשרת הדמיית רקמות המשמרת את מבנה הרקמה, החלבונים וחומצות הגרעין, ללא חתך, מספקת תמונות באיכות מעולה גם ברקמות מוחדרות, והערכה תלת מימדית של ארכיטקטורת מיקרו רקמות ואינטראקציות תאיות כמו נוירו-גליה, EEC-glia וכו'. כמו כן, נצפה כי שקופיות מוכתמות CLARITY שומרות על פלואורסצנטיות טובה גם לאחר אחסון ב-20 מעלות צלזיוס, ולכן ניתן לצלם אותן מאוחר יותר במידת הצורך.

יתר על כן, מספר שינויים בטכניקת CLARITY אפשרו לה להתאים למחקרי הכלאה באתר. לדוגמה, שינוי התהליך באמצעות קיבוע מבוסס קרבודימיד יכול לסייע בשימור שלמות חומצות הגרעין (RNA) וכימות לאחר מכן⁶. שיטה חדשה הנקראת הדמיה תלת-ממדית של איברים מנוקים ממסים (3DISCO) פותחה במיוחד בשנת 2012 לניקוי רקמות מוח וחוט שדרה של עכברים, וכל הגוף של Drosophila melanogaster (זבוב הפירות). 3DISCO כולל קיבוע פרה-פורמלדהיד של רקמות, ואחריו שלבי התייבשות סדרתיים תוך שימוש ב-50-100% של טטרהידרופוראן במים, ואחריו מיצוי שומנים עם דיכלורומתאן, וטבילה סופית באתר דיבנזיל להתאמת מקדם שבירה. פרוטוקול 3DISCO מתאים ביותר לרקמות קבועות עם פלואורופורים חזקים כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק במודלים טרנסגניים. מספר שינויים בפרוטוקול 3DISCO כמו iDISCO (הדמיה המאפשרת תיוג חיסוני של איברים שעברו פינוי ממסים) ו-uDISCO (תיוג אולטימטיבי של איברים שעברו פינוי ממסים) שוכללו כדי לאפשר צביעה חיסונית לפני ניקוי (iDISCO) ולשימור הקרינה (uDISCO). CUBIC היא שיטת ניקוי נוספת שפותחה בשנת 2014 שבה בנוסף לשומנים, כרומופורים סופגי אור על בסיס ברזל מוסרים גם מרקמות. השוואה בין רקמות שונות ותהליך הפינוי המומלץ מפורטת בסקירה אלגנטית של Muntifering et al. (2018)⁷.

CLARITY הוא גם כלי מצוין למדידה והשוואה של צפיפות תאים (נוירונים, תאים חיסוניים וכו') בתנאים נורמליים ופתולוגיים. לדוגמה, ניתן לכמת אינטראקציות מארח-פתוגן או דלקת המאופיינת בחדירת תאים חיסוניים לרקמות המעיים ולגנגליונים על ידי צביעת CLARITY והיא עדיפה על ספירת מספרי תאים מתמונות המתקבלות מקטעי רקמה⁸. באופן דומה, כימות צפיפות תאי עצב וגליה במקלעת תת-רירית ומיאנטרית אפשרי על ידי צביעת CLARITY מכיוון שאין לנו סמנים ספציפיים להבדיל בין אוכלוסיות תת-ריריות לעומת אוכלוסיות עצביות או גליה מיאנטריות⁵.

המגבלות כרוכות בזמן ארוך יחסית הנדרש לניקוי או ניקוי הרקמה, הדורש 5 ימים לרקמת המעי. בנוסף לנוירונים, גליה ו-EEC, רקמות מנוקות יכולות גם להיות מוכתמות עבור סוגים שונים של תאים חיסוניים במעי, ורקמות אחרות כמו כבד, טחול וכליות. שלב הסרת השומנים יצטרך להשתנות בהתאם כדי לנקות את הרקמות הללו, מכיוון שרקמות גדולות יותר כמו כבד יזדקקו לזמן ניקוי רב יותר (3-5 ימים).

צביעת CLARITY היא כלי רב ערך להדמיית סביבת המעיים תוך התמקדות בתאי אפיתל, אנטרואנדוקריניים, עצביים, גליה וחיסוניים, מדידת צפיפות תאים (צפיפות תאי עצב, חיסון או גליה) ואינטראקציה בין תאים בתנאים הומאוסטזיס ופתולוגיים. מכיוון שהאינטראקציות בין נוירון חיסוני, גליה חיסונית, נוירונית-גליה וגליה-EEC היו מעורבות מאוד בפתופיזיולוגיה של הפרעות מוח-מעיים כמו מחלת פרקינסון, אלצהיימר והפרעות על הספקטרום האוטיסטי⁴, CLARITY יהיה כלי מצוין לדמות את סביבת המעיים הדינמית ולתאם את מאפייני המעיים להתקדמות הפתולוגיה המוחית. בנוסף, צביעת CLARITY עבור סוגי תאים ספציפיים יכולה לשמש גם כסמן או אינדקס לפתולוגיה של מחלה. לדוגמה, הצטברות של חלבונים חריגים כמו סינוקלאין במעיים ושינויים בתנועתיות המעיים עשויים להיות בקורלציה להתפתחות פתולוגיה מוחית ולשינויים בהתנהגות קוגניטיבית.

לפיכך, CLARITY מציעה אפשרויות הדמיה בלתי מוגבלות ברקמה שלמה בתלת מימד ללא הטיית הפרשנות שעלולה לנבוע מחתך רקמות בהקשר של התפלגות לא אחידה של סוגי תאים. יתר על כן, וריאציות רבות של שיטת פינוי רקמות כמו הדמיה תלת מימדית של איברים שפונו ממסים (3DISCO) התפתחו תוך שימוש בממיסים אורגניים ^9,10. יתר על כן, שיטת CLARITY שונתה באופן נרחב כדי לשלב כימיה מבוססת קרבודימיד כדי לשמור ביציבות RNA ברקמה מובהרת כדי לשפר את שלמות הרקמה ויציבות ה-RNA כדי להציע אפשרויות נוספות להכלאה באתרה ברקמה המנוקה, שניתן לנצל בניתוח מיקרו-RNA הרלוונטיים לפתולוגיות שונות של מחלות⁶. ניתן להתאים את השיטה גם לצביעה של רקמות עכבר אחרות כמו מוח¹, שריר שלד¹¹, שחלות¹², ורקמות אחרות בעלות עניין מחקרי כמו רקמת ביופסיה אנושית¹³, דג זברה⁸ ודרוזופילה, שגם הם מודלים מחקריים מרכזיים בנוסף למודל העכברים.

למחברים אין מה לחשוף.

המחברים מבקשים להכיר בתמיכה של האגודה האמריקאית לגסטרואנטרולוגיה (AGA) פרס מחקר פיילוט להפרעות תנועתיות תפקודיות במערכת העיכול של AGA-Rome (ל-BC), AI64462 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (ASN) וליבת המיקרוסקופיה המשולבת להדמיה תאית של אוניברסיטת אמורי.