用 “CLARITY” 对肠道进行成像

我们描述了小鼠肠道被动 CLARITY （PACT） 染色的方案，以便在不进行组织切片的情况下实现上皮下组织的可视化，包括神经元、神经胶质细胞和肠内分泌细胞 （EEC）。该方案包括甲醛固定组织的水凝胶包埋，然后使用阴离子去污剂进行脱脂以“清除”组织。

CLARITY （Clear Lipid-exchange Acrylamide hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel） 最近发展成为一种有价值的技术，涉及丙烯酰胺包埋以去除脂肪组织（无需切片）并保留 3-D 组织结构以进行免疫染色。该技术与动态肠道环境成像高度相关，在稳态和疾病状态下，不同细胞类型相互作用。这里描述了这种针对小鼠肠道优化的方法，它有助于追踪细胞类型，如上皮细胞、肠内分泌细胞、神经元、神经胶质细胞以及分别介导微生物感应或营养化疗感应的上皮细胞或肠内分泌细胞的神经元投射。将肠道组织（1-1.5cm）在第1天在4°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜。在第 2 天，弃去 PFA，用 PBS 洗涤组织三次。通过在 PBS 溶液（从 30% ProtoGel 稀释）中在 4 °C 下孵育过夜，将组织包埋水凝胶以保持其完整性。 第 3 天，将组织-水凝胶溶液在 37 °C 下孵育 1 小时以允许水凝胶聚合。然后用 PBS 轻轻洗涤组织 3 次，以去除多余的水凝胶。脱脂（清除）的后续步骤包括在十二烷基硫酸钠（PBS中的8% SDS）中，在37°C下在室温（RT）下孵育2天（第4天和第5天）。在第 6 天，用 PBS 彻底洗涤澄清的组织以去除 SDS。组织可以通过在一抗中孵育（在含有 0.3% Triton X-100 的 PBS 中的 0.5% 正常驴血清中稀释）、在 4°C 下过夜，然后在适当的二抗 Alexa Fluor 抗体中在 RT 下孵育 1.5 小时，并使用 DAPI （1：10000） 进行细胞核染色。将组织转移到干净的载玻片上，并使用 VectaShield 进行镶嵌以进行共聚焦成像。

CLARITY（透明脂质交换丙烯酰胺杂交刚性成像兼容组织 hYdrogel）最近发展成为一种有价值的技术，涉及丙烯酰胺（水凝胶）包埋和组织脱脂，以保留 3-D 组织结构以进行免疫染色（无需切片）^1,2。水凝胶包埋的组织是光学透明且具有大分子渗透性的，蛋白质和核酸在被去污剂去除脂质后得以保留。CLARITY 被 Science³ 评为 2013 年十大重大突破之一。 虽然该技术最初开发用于对脂质丰富的脑组织进行成像，而脂质会影响光散射和成像质量，但该技术目前广泛用于其他组织（如肠道、肝脏、肾脏和心脏）的成像。该技术无需切片，即可对组织进行染色和成像，否则由于细胞类型的分布不规则，可能会导致对细胞间相互作用的评估出现偏差。该技术还提供了执行共聚焦 z 堆栈和重建组织 3D 图像的机会，这有助于比组织切片更真实地确定各种细胞类型之间的密度、微结构和细胞间相互作用。此外，该技术已经过修改，允许对骨骼等致密组织进行免疫染色，以及进行原位杂交研究。水凝胶包埋的 3D 组织为阐明上皮细胞、肠内分泌细胞、神经胶质细胞和神经元细胞之间的相互作用提供了一个有吸引力的平台，这些相互作用最近被认为对理解帕金森病、阿尔茨海默病、自闭症谱系障碍等疾病的病理生理学至关重要⁴。

所有描述的动物实验均已获得埃默里大学动物使用和护理委员会的批准。在安乐死之前，允许 8-12 周龄的 C57BL/6 小鼠 （雄性和雌性均可使用） 自由获取食物和水。

1. 切除肠道（第 1 天）

1. 通过二氧化碳窒息法对小鼠实施安乐死，以 1.6 mL 二氧化碳气体的流速，直到观察到呼吸停止 2 分钟）。
2. 将鼠标仰卧在解剖板上，四肢固定。用 70% 乙醇对腹部消毒。用镊子，用剪刀切开皮肤。
3. 轻轻提起肝脏并确定胃部。然后用镊子托住胃，切掉胃上方的食道。用镊子托住胃，轻轻剪掉肠系膜，将肠道从腹腔分离到直肠。切断直肠处分离的肠道。
4. 将分离的肠道转移到培养皿中冰冷的 PBS 溶液中。现在轻轻剪掉回肠段之间的肠系膜，拉直肠道，以便从胃开始剪掉所有肠系膜，直到结肠。
5. 将所需的肠道区域切下 1-1.5 cm 进行 CLARITY 染色，放入含有冰冷 PBS 的新培养皿中。
6. 使用连接到 20 G 针头钝端的 5 mL 注射器，用冰冷的 PBS 冲洗粪便内容物。
   注意：使用相同的技术，肠道的任何区域都可用于 CLARITY 染色。肠段可以沿着肠系膜切开或完整地用于后续步骤。

2. 固定肠道组织（第 1 天）

1. 将组织固定在 PBS 中的 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液中。
2. 将 1-1.5 cm 感兴趣的肠段转移到装有 4% PFA 的 15 mL 锥形管中，在 4 °C 下过夜进行固定。

3. 水凝胶包埋（第 2 天）

1. 用镊子将肠段从 4% PFA 溶液转移到装有 PBS 溶液的新 15 mL 锥形管中，并洗涤 3 次（每次 5 分钟，在摇床上以 150-200 rpm 的速度洗涤）以去除任何残留的 PFA。
2. 4% 水凝胶的制备
   1. 使用 30% 凝胶溶液 （ProtoGel） 制备水凝胶。为了制备 4% 水凝胶溶液，将 30% 储备溶液稀释在 PBS 中稀释。要制备 12 mL 的 4% 水凝胶，取 1.6 mL 的 30% 凝胶溶液并加入 10.4 mL 的 PBS。
3. 从步骤 3.1 转移固定组织。至 PBS 中的 4% 水凝胶溶液，在 15 ml 锥形管中，并在 4 °C 下孵育过夜。
   注：强烈建议在孵育过夜后使用 PBS 洗涤组织，去除 PFA。组织在 PFA 中储存时间较长，后续步骤和染色不会产生良好的结果。PBS 洗涤后的固定组织可在 4 °C 下储存一周。

4. 水凝胶聚合和脱脂（透明化）步骤（第 3 天）

1. 从4°C中取出含有水凝胶溶液中组织的锥形管。 转移至 37 °C 水浴中并孵育 1 小时。此步骤允许水凝胶聚合。
2. 1 小时后，取出含有水浴水凝胶包埋组织的锥形管，倒出丙烯酰胺溶液。现在在室温下用单个 PBS 洗涤液轻轻冲洗组织，以去除多余的水凝胶。
3. 脱脂步骤
   1. 通过在 PBS 中的十二烷基硫酸钠 （8% SDS） 中孵育组织来去除脂肪。将步骤 4.2 中的水凝胶包埋组织转移到 50 mL 锥形管中的 8% SDS 溶液中。确保组织完全浸入 SDS 溶液中，并且试管已加盖。
   2. 将装有SDS组织的50毫升加盖管转移到37°C的振荡器（200转/分钟）上，在室温下放置2天（第4天和第5天）以进行脱脂。
      注：确保在 50 mL 锥形管中填充 SDS 溶液至少 20-25 mL，以补偿孵育 2 天内在 37 °C 下可能发生的任何蒸发。
4. 在第4天和第5天，将组织在SDS中于37°C摇床（200转/分钟）下室温孵育。

5. 从清除的组织中洗掉洗涤剂（第 6 天）

1. 从 SDS 溶液中取出组织。组织会显得“透明”或透明。
2. 将组织转移到装有 PBS 溶液的新 50 mL 滑稽管中，并在室温下在摇床 （150-200 rpm） 上洗涤一天，并更换 PBS，以确保去除所有痕量的 SDS。至少更换 10 次 PBS 溶液将确保组织没有从 SDS 中脱落，一个好的经验法则是检查最终的 PBS 洗涤液是否没有来自 SDS 的泡沫/泡沫痕迹。 这是一个关键步骤，因为 SDS 会干扰后续的染色步骤。
   注：在一天结束时，在 PBS 中洗涤几次后清除的组织现在可以进行免疫染色，或者可以在 4 °C 下储存长达 3 周。
3. 将清除的肠道组织在 PBS 溶液中储存一个月以上会影响组织的完整性和染色质量。立即或在清除后 1-2 周内使用清除的肠道组织以获得最佳效果。

6. 神经元、神经胶质细胞和肠内分泌细胞的免疫荧光染色

1. 将澄清的组织转移到 1.5 或 2 mL 试管中，并在 500 μL 体积的相应一抗中稀释在含有 0.3% Triton X-100 的 PBS 中稀释的 0.5% 正常驴血清中）在 4 °C 下孵育过夜。 使用的抗体 （Ab）：Tuj1 或 β-3-微管蛋白（泛神经元标志物，1：1000）、神经胶质纤维酸蛋白（GFAP，1：500）、嗜铬粒蛋白 A （1：250）。
2. 孵育过夜后，将组织进行 3 次 PBS 洗涤（每次使用 1-1.5 mL PBS 洗涤 5 分钟），以去除未结合的初级抗体。
3. 将组织转移到新试管中，然后在室温下避光与 500 μL 适当的次级 Alexa Fluor Ab （AF） 孵育 1.5 小时。使用的二级抗体是 Tuj1 的 AF 488 （1： 1000）、GFAP 的 AF-555 （1： 500） 和嗜色粒蛋白 A 的 AF 555 （1： 250）。
4. 孵育后，如步骤 6.2 所示，用 PBS 洗涤组织 3 次。
5. 为了对细胞核进行染色，将组织在 DAPI（1：10000 稀释或 0.2 μL 的 2 mL PBS 溶液）中在室温下孵育 5 分钟。
6. 最后，将染色的组织转移到干净的载玻片上，在组织顶部添加盖玻片，并使用 100 μL VectaShield 进行共聚焦成像。
7. 将载玻片在室温下避光置于载玻片架中干燥 30 分钟，然后可以成像或储存在 -20 °C。 小鼠肠壁相当薄，一旦沿肠系膜打开，就可以用盖玻片直接安装在载玻片上。如果处理较大的组织，如脾脏、肾脏，可以使用腔（腔）载玻片或垫片。对于较大的组织，例如，可以使用腔载玻片进行安装。
   注意：需要注意的是，如果在开始步骤中没有切开肠段（参见步骤 1 中的注释），建议用微型剪刀切开肠管，这将有助于涉及安装的步骤。

7. 共聚焦成像

注意：透明化、染色和封片的组织可以立即成像，也可以储存在 -20°C 的载玻片盒中。

1. 使用共聚焦显微镜（例如，Olympus FV1000）进行成像。
2. 在 50 μm 厚度的肠道组织中进行 z 堆栈，以可视化从肠道腔到浆膜层的区域。
3. 将 z 堆栈图像存储为图像文件，.avi电影文件或在软件的帮助下转换为 3D 图像⁵.

来自 CLARITY 清除的小鼠肠道组织的图像如图 1 所示。成功完成该方案可产生高质量、清晰的图像，其中所有细胞细节都可以清晰地可视化。细胞核的 DAPI 染色是评估 CLARITY 方案和后续免疫染色质量的非常好的指标，因为它可以描述组织的完整性。此外，细胞形状还提供了有关该方案如何成功的线索，尤其是在具有不同细胞形态的神经元、神经胶质细胞和肠内分泌细胞的情况下。细胞扭曲且染色稀少/异常表明组织制备已受到影响。

用泛神经元标志物 Tuj1（β-3-微管蛋白，红色）染色并与神经胶质标志物神经胶质纤维酸蛋白（GFAP，绿色）共染色的小鼠回肠如图 1A 所示。使用成像软件从 z 堆栈生成的神经元标记物 Tuj1（红色）染色的小鼠结肠的 3D 图像如图 1B 所示。小鼠结肠中产生嗜铬粒蛋白 A 的肠内分泌细胞的染色如图 1C 所示。在所有图像中，蓝色代表 DAPI 的细胞核染色。 图 1A 和 图 1B 是以 40 倍放大倍率拍摄的， 图 1C 是以 60 倍放大倍率拍摄的。 如图 1A 所示的共染色可用于评估各种感兴趣标记物的共定位，例如特定细胞类型、免疫细胞等上的受体或与 DAPI 的核共定位。3D 图像可用于比较两种实验条件或野生型和敲除小鼠品系等之间的细胞密度（例如肌间神经元密度）。神经元投射的密度也可以在 3D 图像中评估。在正常和病理生理条件下，可以通过对各种标志物（如嗜铬粒蛋白）进行染色来评估具有感兴趣受体的肠内分泌细胞群的变化，如图 1C 所示。此外，在正常或炎症条件下，可以通过 CLARITY 染色评估维持上皮屏障完整性的各种紧密连接蛋白的强度和/或定位的变化。根据涉及炎症小鼠模型的研究兴趣，可能会对清除的脾组织进行特定免疫细胞类型的染色。

因此，无需耗时的切片步骤和抗原修复过程，就可以通过 z 堆栈在其整个厚度上以更高的质量和细节可视化组织，并且可以提供 3D 细节。该技术还有一个优点，即它还可以用于对盐水灌注动物的组织进行染色。

图 1：透明化肠道组织的代表性免疫染色。（A） 用神经元标志物 Tuj1（β-3-微管蛋白）和神经胶质标志物胶质纤维酸蛋白 （GFAP） 染色的透明小鼠回肠，核染色 DAPI 和 （B） 从 Tuj1 染色的小鼠结肠的 z 堆栈生成的 3D 图像 （C） 用嗜铬粒蛋白 A 和 DAPI 染色的透明小鼠结肠。请单击此处查看此图的较大版本。

CLARITY 方法对于小鼠肠道染色非常有用，以 3D 形式可视化各种细胞类型，包括上皮细胞、神经元和神经胶质细胞，尤其是穿过肠壁延伸到管腔⁵ 的神经元投射网络及其对神经胶质细胞和 EEC 细胞的神经支配。这里介绍的方法是根据 Yang 等人 2014 1 年的原始研究进行了^修改。

该方案中的关键步骤包括在肠道组织固定过夜后立即冲洗固定剂，随后进行水凝胶包埋和脱脂。脱脂后的 PBS 洗涤对于去除脱脂步骤中使用的残留去污剂至关重要。

CLARITY 染色的优点是它允许组织成像保留组织结构、蛋白质和核酸，无需切片，即使在灌注组织中也能提供出色的图像质量，以及组织微结构和细胞相互作用（如神经元-胶质细胞、EEC-神经胶质细胞等）的 3D 评估。还观察到，即使在 -20 °C 下储存后，CLARITY 染色的玻片仍能保持良好的荧光，因此可以在需要时稍后成像。

此外，CLARITY 技术的多项修改使其适用于原位杂交研究。例如，使用基于碳二亚胺的固定修饰过程有助于保持核酸 （RNA） 的完整性和随后的定量⁶。2012 年专门开发了一种称为溶剂清除器官 3D 成像 （3DISCO） 的新方法，用于清除小鼠大脑和脊髓组织，以及黑 腹果蝇 （果蝇）的整个身体。3DISCO 包括对组织进行对甲醛的对位固定，然后使用 50-100% 的四氢呋喃水溶液进行连续脱水步骤，然后用二氯甲烷进行脂质提取，最后浸入二苄醚中进行折射率匹配。3DISCO 方案最适合转基因模型中具有强荧光团（如绿色荧光蛋白）的固定组织。3DISCO 方案的几项修改，如 iDISCO（溶剂清除器官的免疫标记成像）和 uDISCO（溶剂清除器官的最终标记）已经完善，允许在清除前进行免疫染色 （iDISCO） 并保留荧光 （uDISCO）。CUBIC 是 2014 年开发的另一种透明化方法，其中除了脂质外，还从组织中去除了铁基吸收光的发色团。Muntifering 等人 （2018^{） 7} 的一篇优雅的评论中详细介绍了各种组织的比较和推荐的透明化过程。

CLARITY 也是在正常和病理条件下测量和比较细胞密度（神经元、免疫细胞等）的出色工具。例如，以免疫细胞浸润到肠道组织和神经节为特征的宿主-病原体相互作用或炎症可以通过 CLARITY 染色进行量化，并且优于从组织切片获得的图像中列举细胞数量⁸。同样，可以通过 CLARITY 染色量化粘膜下和肌肠神经丛中的神经元和神经胶质细胞密度，因为我们没有特异性标志物来区分粘膜下和肌肠神经胶质细胞群⁵。

限制涉及脱脂或清除组织所需的相对较长的时间，肠道组织需要 5 天。除了神经元、神经胶质细胞和 EEC 之外，透明化的组织还可以对肠道中的各种免疫细胞类型以及肝脏、脾脏和肾脏等其他组织进行染色。脱脂步骤必须相应地修改以清除这些组织，因为肝脏等较大的组织需要更多的脱脂时间才能清除（3-5 天）。

CLARITY 染色是一种有价值的肠道环境成像工具，重点关注上皮细胞、肠内分泌细胞、神经元、神经胶质细胞和免疫细胞，测量细胞密度（神经元、免疫或神经胶质细胞密度）和稳态和病理条件下的细胞间相互作用。由于免疫神经元、免疫神经胶质细胞、神经元神经胶质细胞和神经胶质细胞 EEC 之间的相互作用与帕金森病、阿尔茨海默病和自闭症谱系障碍⁴ 等脑肠疾病的病理生理学高度相关，因此 CLARITY 将是对动态肠道环境进行成像并将肠道特征与进展的脑病理学相关联的绝佳工具。此外，特定细胞类型的 CLARITY 染色也可用作疾病病理学的标志物或指标。例如，突触核蛋白等异常蛋白质在肠道中的积累和肠道运动的变化可能与大脑病理学的发展和认知行为的变化有关。

因此，CLARITY 在完整组织中以 3D 形式提供了无限的成像可能性，而不会在细胞类型分布不均匀的情况下因组织切片而导致的解释偏差。此外，利用有机溶剂发展起来的组织透明化方法的许多变体，如溶剂透明化器官的三维成像 （3DISCO） ^9,10。此外，CLARITY 方法已被广泛修改，以结合基于碳二亚胺的化学，以稳定地将 RNA 保留在澄清的组织中，从而增强组织完整性和 RNA 稳定性，从而为透明化组织中的原位杂交提供更多可能性，这可用于分析与不同疾病病理相关的 microRNA⁶。该方法还可以适当地适用于其他小鼠组织（如脑¹、骨骼肌¹¹、卵巢¹²）和其他研究兴趣组织（如人类活检组织¹³、斑马鱼⁸ 和果蝇）的染色，这些组织也是除小鼠模型外的关键研究模型。

作者没有什么可披露的。

作者感谢美国胃肠病学协会 （AGA） AGA-罗马功能性胃肠道运动障碍试点研究奖（BC）、美国国立卫生研究院拨款 AI64462 （ASN） 和埃默里大学综合细胞成像显微镜核心的支持。