Imágenes del intestino con "CLARIDAD"

Describimos el protocolo para la tinción pasiva de CLARITY (PACT) en el intestino de ratón para permitir la visualización de los tejidos subepiteliales, incluidas las neuronas, la glía y las células enteroendocrinas (EEC) sin corte de tejido. El protocolo implica la inclusión de hidrogel en el tejido fijado con formaldehído y la posterior deslipidación utilizando un detergente aniónico para "limpiar" el tejido.

CLARITY (Clear Lipid-traded Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible con Tissue hYdrogel) ha evolucionado recientemente como una técnica valiosa que implica la inclusión de acrilamida para delipidar el tejido (sin seccionar) y para preservar la estructura del tejido 3D para la inmunotinción. La técnica es muy relevante para obtener imágenes del entorno intestinal dinámico donde diferentes tipos de células interactúan durante la homeostasis y los estados de enfermedad. Aquí se describe este método optimizado para el intestino del ratón, que ayuda a rastrear tipos de células como epitelios, enteroendocrinos, neuronas, glía y las proyecciones neuronales en las células epiteliales o enteroendocrinas que median la detección microbiana o la detección de quimioterapia de nutrientes, respectivamente. El tejido intestinal (1-1,5 cm) se fija en paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C durante la noche del día 1. En el día 2, se desecha el PFA y el tejido se lava tres veces con PBS. El tejido está incrustado en hidrogel para preservar su integridad mediante la incubación en una solución de hidrogel al 4% (acrilamida) en PBS (diluida a partir de ProtoGel al 30%) durante la noche a 4 °C. En el día 3, la solución de hidrogel tisular se incuba a 37  °C durante 1 h para permitir la polimerización del hidrogel. A continuación, el pañuelo se lava tres veces suavemente con PBS para eliminar el exceso de hidrogel. El siguiente paso de la deslipidación (aclarado) consiste en la incubación del tejido en dodecil sulfato de sodio (8% SDS en PBS) a 37 °C durante 2 días (días 4 y 5) en un agitador a temperatura ambiente (RT). En el día 6, el tejido aclarado se lava a fondo con PBS para eliminar el SDS. El tejido se puede inmunoteñir mediante incubación en anticuerpos primarios (diluidos en suero de burro normal al 0,5% en PBS que contiene 0,3% de Triton X-100), durante la noche a 4 °C y posterior incubación en anticuerpos secundarios Alexa Fluor apropiados durante 1,5 h a RT, y tinción nuclear con DAPI (1: 10000). El tejido se transfiere a un portaobjetos de vidrio limpio y se monta con VectaShield para la obtención de imágenes confocal.

CLARITY (Clear Lipid-Exchange-Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible con el hYdrogel) ha evolucionado recientemente como una técnica valiosa que implica la inclusión de acrilamida (hidrogel) y la delipidación de tejidos para preservar la estructura tisular 3D para la inmunotinción (sin seccionamiento)^1,2. El tejido incluido en hidrogel es ópticamente transparente y permeable a las macromoléculas, y las proteínas y los ácidos nucleicos se conservan después de la eliminación de los lípidos por detergente. CLARITY fue reconocido como uno de los diez avances notables en 2013 por Science³. Aunque se desarrolló inicialmente para obtener imágenes de tejidos cerebrales ricos en lípidos donde los lípidos afectan la dispersión de la luz y la calidad de la imagen, la técnica se usa actualmente ampliamente para obtener imágenes de otros tejidos como el intestino, el hígado, el riñón y el corazón. La técnica ofrece la capacidad de teñir e obtener imágenes de un tejido al eliminar la necesidad de seccionar, lo que de otro modo podría resultar en una evaluación sesgada de las interacciones célula-célula debido a la distribución irregular de los tipos de células. La técnica también brinda la oportunidad de realizar pilas z confocales y recrear una imagen tridimensional del tejido, lo que puede ayudar a determinar las densidades, la microarquitectura y la interacción célula-célula entre varios tipos de células de manera más realista que a partir de una sección de tejido. Además, la técnica ha sido modificada para permitir la inmunotinción de tejidos densos como el hueso, así como estudios de hibridación in situ. El tejido 3D incrustado en hidrogel ofrece una plataforma atractiva para dilucidar las interacciones entre las células epiteliales, enteroendocrinas, gliales y neuronales, que recientemente se han citado como cruciales para la comprensión de la fisiopatología de enfermedades como la enfermedad de Parkinson, el Alzheimer, los trastornos del espectro autista, etc.

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Emory. A los ratones C57BL/6 (se pueden usar tanto machos como hembras) a las 8-12 semanas de edad se les permitió el libre acceso a la comida y al agua antes de la eutanasia.

1. Extirpación del intestino (día 1)

1. Eutanasia del ratón por el método de asfixia con dióxido de carbono, a un caudal de 1,6 mL de gas de dióxido de carbono hasta que se observe el cese de la respiración durante 2 min).
2. Coloque al ratón en decúbito supino sobre un tablero de disección con las extremidades sujetas. Esterilizar el abdomen con etanol al 70%. Con unas pinzas, corte la piel con unas tijeras.
3. Levanta el hígado suavemente e identifica el estómago. Luego, sosteniendo el estómago con fórceps, corte el esófago justo por encima del estómago. Sosteniendo el estómago con fórceps, corte suavemente los mesenterios y separe el intestino de la cavidad abdominal hasta el recto. Corte el intestino desprendido en el recto.
4. Transfiera el intestino desprendido a una solución de PBS helada en una placa de Petri. Ahora corte suavemente el mesenterio entre los segmentos ileales y enderece el intestino de modo que, comenzando desde el estómago, se corten todos los mesenterios, hasta el colon.
5. Corte 1-1,5 cm de la región intestinal deseada para la tinción CLARITY en una nueva placa de Petri que contenga PBS helado.
6. Con una jeringa de 5 ml conectada a un extremo romo de una aguja de 20 G, enjuague el contenido fecal con PBS helado.
   NOTA: Cualquier región del intestino se puede utilizar para la tinción CLARITY utilizando la misma técnica. El segmento intestinal puede cortarse a lo largo del mesenterio o usarse intacto para los pasos subsiguientes.

2. Fijación del tejido intestinal (Día 1)

1. Fije el tejido en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS.
2. Transfiera un trozo de 1-1,5 cm del segmento intestinal de interés a un tubo cónico de 15 ml lleno de PFA al 4% a 4 °C durante la noche para su fijación.

3. Incrustación de hidrogel (Día 2)

1. Transfiera el segmento intestinal de la solución de PFA al 4% con pinzas a un nuevo tubo cónico de 15 mL con solución de PBS y lave tres veces (5 min cada una, en un agitador a 150-200 rpm) para eliminar cualquier PFA residual.
2. Preparación de hidrogel al 4%
   1. Utilice la solución de gel al 30% (ProtoGel) para preparar el hidrogel. Para preparar una solución de hidrogel al 4%, diluya la solución madre al 30% y se diluye en PBS. Para preparar 12 mL de hidrogel al 4%, tome 1,6 mL de solución de gel al 30% y agregue 10,4 mL de PBS.
3. Transfiera el tejido fijado del paso 3.1. a la solución de hidrogel al 4% en PBS en un tubo cónico de 15 ml e incubado a 4 °C durante la noche.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente que el tejido se lave sin PFA utilizando PBS después de la incubación durante la noche. El tejido almacenado durante más tiempo en PFA no da buenos resultados con los pasos posteriores y la tinción. El tejido fijado después de los lavados con PBS puede almacenarse a 4 °C durante una semana.

4. Paso de polimerización y deslipidación (aclarado) de hidrogel (Día 3)

1. Retire el tubo cónico que contiene el tejido en solución de hidrogel a 4 °C. Pasar a un baño de agua a 37 °C e incubar durante 1 h. Este paso permite la polimerización en hidrogel.
2. Después de 1 h, saque el tubo cónico que contiene el tejido incrustado en hidrogel del baño de agua y vierta la solución de acrilamida. Ahora enjuague suavemente el pañuelo con un solo lavado de PBS a temperatura ambiente para eliminar el exceso de hidrogel.
3. Paso de delipidación
   1. Deslipidar incubando el tejido en dodecil sulfato de sodio (8% SDS) en PBS. Transfiera el tejido incluido en hidrogel del paso 4.2 a una solución SDS al 8% en un tubo cónico de 50 mL. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido en la solución SDS y que el tubo esté tapado.
   2. Transfiera el tubo tapado de 50 mL que contiene el tejido en SDS a un agitador a 37 °C (200 rpm) a temperatura ambiente durante 2 días (días 4 y 5) para permitir la delipidación.
      NOTA: Asegúrese de que la solución SDS esté llena hasta al menos 20-25 mL en el tubo cónico de 50 mL, para compensar cualquier evaporación que pueda ocurrir a 37 °C durante los 2 días de incubación.
4. En los días 4 y 5, incubar el tejido en SDS a 37 °C agitador (200 rpm) a temperatura ambiente.

5. Lavar el detergente del pañuelo aclarado (Día 6)

1. Tome el pañuelo de la solución SDS. El tejido aparecerá "claro" o transparente.
2. Transfiera el tejido a un nuevo tubo cómico de 50 mL con solución de PBS y lave durante el día en un agitador (150-200 rpm) a temperatura ambiente con varios cambios de PBS, para asegurarse de que se eliminan todos los rastros de SDS. Al menos 10 cambios de solución de PBS asegurarán que el tejido esté libre de la SDS, y una buena regla general es verificar si el lavado final de PBS no tiene rastros de espuma / espuma de la SDS. Este es un paso crítico, ya que la SDS puede interferir con los pasos de tinción posteriores.
   NOTA: Al final del día, el tejido aclarado después de varios lavados en PBS ahora está listo para la inmunotinción o tal vez se almacena a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
3. El almacenamiento de los tejidos intestinales aclarados durante más de un mes en una solución de PBS afectará a la integridad del tejido y a la calidad de la tinción. Use el tejido intestinal aclarado inmediatamente o dentro de 1-2 semanas después de la limpieza para obtener mejores resultados.

6. Tinción inmunofluorescente para neuronas, glía y células enteroendocrinas

1. Transfiera el tejido aclarado a un tubo de 1,5 o 2 mL e incube en un volumen de 500 μL de los respectivos anticuerpos primarios diluidos en suero de burro normal al 0,5% en PBS que contenga Triton X-100 al 0,3% durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos (Ab) utilizados: Tuj1 o β-3-tubulina (marcador panneuronal, 1:1000), proteína ácido fibrilar glial (GFAP, 1:500), cromogranina A (1:250).
2. Después de la incubación durante la noche, someta el tejido a 3 lavados de PBS (5 minutos cada uno con 1-1,5 mL de PBS) para eliminar el Ab primario no unido.
3. Transfiera el tejido a un nuevo tubo y, posteriormente, incube con 500 μL de Alexa Fluor Ab (AF) secundario adecuado durante 1,5 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los AB secundarios utilizados son AF 488 para Tuj1 (1:1000), AF-555 para GFAP (1:500) y AF 555 (1:250) para Chromogranin A.
4. Después de la incubación, lave el tejido tres veces con PBS como en el paso 6.2.
5. Para teñir los núcleos, incubar el tejido en DAPI (dilución 1:10000 o 0,2 μL en PBS 2 mL) durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Por último, transfiera el tejido teñido a un portaobjetos de vidrio limpio, añada un cubreobjetos encima del pañuelo y móntelo con 100 μL de VectaShield para obtener imágenes confocal.
7. Coloque los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente en un soporte para portaobjetos durante 30 minutos para su secado, después de lo cual se pueden visualizar o almacenar a -20 °C. La pared de la tripa del ratón es bastante delgada y una vez abierta a lo largo del mesenterio, se puede montar en portaobjetos de vidrio directamente con cubreobjetos. Si se trabaja con tejidos más grandes como bazo, riñones, se pueden usar portaobjetos de cámara (cavidad) o espaciadores. Para tejidos más grandes, por ejemplo, se puede usar un portaobjetos de cavidad para el montaje.
   NOTA: Debe tenerse en cuenta que si el segmento intestinal no se abrió en el paso inicial (consulte la nota en el paso 1), es aconsejable abrir el tubo intestinal con microtijeras que facilitarán los pasos que implican el montaje.

7. Imágenes confocales

NOTA: El tejido aclarado, teñido y montado se puede obtener inmediatamente o se puede almacenar en cajas de portaobjetos a -20 °C.

1. Imagen con un microscopio confocal (por ejemplo, Olympus FV1000).
2. Tome pilas z a lo largo de 50 μm de espesor del tejido intestinal para visualizar las regiones desde la luz intestinal hacia la capa serosa.
3. Almacene las imágenes de la pila z como archivos de imagen, .avi archivos de película o conviértalos en imágenes 3D con la ayuda del software⁵.

Las imágenes del tejido intestinal de ratón aclarado con CLARITY se representan en la Figura 1. Una finalización exitosa del protocolo produce imágenes nítidas y de alta calidad en las que todos los detalles celulares se pueden visualizar con claridad. La tinción DAPI para núcleos es un muy buen índice para evaluar la calidad del protocolo CLARITY y la inmunotinción posterior, ya que puede representar la integridad del tejido. Además, la forma de la célula también proporciona una pista sobre el éxito del protocolo, especialmente en el caso de las células neuronales, gliales y enteroendocrinas con una morfología celular distinta. Una célula distorsionada con tinción escasa/aberrante muestra que la preparación del tejido se ha visto comprometida.

En la Figura 1A se muestra el íleon de ratón teñido con el marcador panneuronal Tuj1 (β-3-tubulina, rojo) y co-teñido con el marcador glial Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP, verde). En la Figura 1B se muestra una imagen 3D de un colon de ratón teñido con el marcador neuronal Tuj1 (rojo) generado a partir de la pila z utilizando el software de imágenes. La tinción de las células enteroendocrinas que producen cromogranina A en el colon de ratón se muestra en la Figura 1C. En todas las imágenes, el azul representa la mancha nuclear con DAPI. La Figura 1A y la Figura 1B se han capturado con un aumento de 40x y la Figura 1C con un aumento de 60x. La co-tinción, como se representa en la Figura 1A , se puede utilizar para evaluar la colocalización de varios marcadores de interés, como receptores en tipos específicos de células, células inmunitarias, etc., o la colocalización nuclear con DAPI. Las imágenes 3D se pueden utilizar para comparar las densidades celulares (por ejemplo, la densidad neuronal mientérica) entre dos condiciones experimentales o una cepa de ratón salvaje y knockout, etc. La densidad de las proyecciones neuronales también se puede evaluar en imágenes 3D. Los cambios en las poblaciones de células enteroendocrinas con receptores de interés en condiciones normales y fisiopatológicas se pueden evaluar mediante tinción para varios marcadores como la cromogranina, como se muestra en la Figura 1C. Además, los cambios en la intensidad y/o localización de varias proteínas de unión estrecha que mantienen la integridad de la barrera epitelial se pueden evaluar mediante la tinción CLARITY en condiciones normales o inflamatorias. Los tejidos esplénicos aclarados pueden teñirse para tipos específicos de células inmunitarias en función de los intereses de investigación que involucran modelos de ratones inflamatorios.

Por lo tanto, sin los lentos pasos de seccionamiento y los procesos de recuperación de antígenos, el tejido se puede visualizar con mucha mayor calidad y detalles en todo su grosor a través de pilas z, y puede proporcionar los detalles en 3D. La técnica también tiene la ventaja de que también se puede utilizar para teñir tejidos de animales con solución salina.

Figura 1: Inmunotinción representativa de los tejidos intestinales aclarados. Imágenes confocales (enface) de (A) íleon de ratón aclarado teñido con marcador neuronal Tuj1 (β-3-tubulina) y marcador glial proteína de ácido fibrilar glial (GFAP), con tinción nuclear DAPI y (B) imagen 3D generada a partir de pilas z de colon de ratón teñido con Tuj1 (C) colon de ratón aclarado teñido con cromogranina A y DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El método CLARITY es muy útil para teñir el intestino del ratón con el fin de visualizar varios tipos de células, incluidos los epitelios, las neuronas y las células gliales en 3D, especialmente la red de proyecciones neuronales que se extienden a través de la pared intestinal hasta el lumen⁵ y su inervación a las células gliales y EEC. El método aquí presentado fue modificado de acuerdo con el estudio original de Yang et al. 2014¹.

Los pasos críticos del protocolo incluyen el enjuague inmediato del fijador después de la fijación nocturna del tejido intestinal, la posterior inclusión del hidrogel y la delipidación. Los lavados de PBS después de la deslipidación son cruciales para eliminar el detergente residual utilizado en la etapa de deslipidación.

La tinción CLARITY es superior en el sentido de que permite obtener imágenes de tejidos que conservan la estructura del tejido, las proteínas y los ácidos nucleicos, sin seccionamientos, proporciona imágenes de excelente calidad incluso en tejidos perfundidos y una evaluación en 3D de la microarquitectura de los tejidos y las interacciones celulares como neurona-glía, EEC-glía, etc. También se observa que los portaobjetos teñidos con CLARITY conservan una buena fluorescencia incluso después de su almacenamiento a -20 °C y, por lo tanto, se pueden obtener imágenes más adelante si es necesario.

Además, varias modificaciones de la técnica CLARITY la han hecho apta para estudios de hibridación in situ. Por ejemplo, la modificación del proceso mediante la fijación basada en carbodiimida puede ayudar a preservar la integridad de los ácidos nucleicos (ARN) y la posterior cuantificación⁶. En 2012 se desarrolló específicamente un nuevo método llamado imagen 3D de órganos aclarados con disolvente (3DISCO) para limpiar el cerebro y los tejidos de la médula espinal de ratón, y todo el cuerpo de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta). 3DISCO implica la fijación de para formaldehído de los tejidos, seguida de pasos de deshidratación en serie utilizando 50-100% de tetrahidrofurano en agua, seguido de la extracción de lípidos con diclorometano y la inmersión final en éter de dibencilo para la coincidencia del índice de refracción. El protocolo 3DISCO es el más adecuado para tejidos fijos con fluoróforos fuertes como la proteína fluorescente verde en modelos transgénicos. Se han perfeccionado varias modificaciones del protocolo 3DISCO, como iDISCO (imágenes habilitadas para el inmunoetiquetado de órganos aclarados con disolvente) y uDISCO (etiquetado definitivo de órganos aclarados con disolvente) para permitir la inmunotinción antes del aclaramiento (iDISCO) y preservar la fluorescencia (uDISCO). CUBIC es otro método de limpieza desarrollado en 2014 en el que, además de los lípidos, también se eliminan de los tejidos cromóforos absorbentes de luz a base de hierro. Una comparación de varios tejidos y el proceso de limpieza recomendado se detalla en una elegante revisión de Muntifering et al. (2018)⁷.

CLARITY también es una excelente herramienta para medir y comparar densidades celulares (neuronas, células inmunitarias, etc.) en condiciones normales y patológicas. Por ejemplo, las interacciones huésped-patógeno o la inflamación caracterizada por la infiltración de células inmunitarias en los tejidos intestinales y los ganglios se pueden cuantificar mediante la tinción CLARITY y es superior a la enumeración del número de células a partir de imágenes obtenidas de secciones de tejido⁸. Del mismo modo, la cuantificación de las densidades de células neuronales y gliales en plexos submucosos y mientéricos es posible mediante la tinción CLARITY, ya que no disponemos de marcadores específicos para diferenciar^{entre poblaciones} neuronales o gliales submucosas frente a mielentéricas 5.

Las limitaciones implican un tiempo comparativamente más largo que se requiere para delipidar o limpiar el tejido, lo que requiere 5 días para el tejido intestinal. Además de las neuronas, la glía y la EEC, el tejido aclarado también puede teñirse para varios tipos de células inmunitarias en el intestino y otros tejidos como el hígado, el bazo y el riñón. El paso de delipidación tendría que modificarse en consecuencia para eliminar estos tejidos, ya que los tejidos más grandes como el hígado necesitarían más tiempo de delipidación para eliminarse (3-5 días).

La tinción CLARITY es una herramienta valiosa para obtener imágenes del entorno intestinal centrándose en las células epiteliales, enteroendocrinas, neuronales, gliales e inmunitarias, midiendo las densidades celulares (neuronales, inmunitarias o gliales) y la interacción célula-célula en condiciones homeostasis y patológicas. Dado que las interacciones entre la neurona inmunitaria, la glía inmunitaria, la glía neurona y la glía-EEC han estado muy implicadas en la fisiopatología de los trastornos cerebro-intestino como la enfermedad de Parkinson, el Alzheimer y los trastornos del espectro autista⁴, CLARITY sería una excelente herramienta para obtener imágenes del entorno intestinal dinámico y correlacionar las características intestinales con la patología cerebral en progreso. Además, la tinción de CLARITY para tipos específicos de células también podría utilizarse como marcador o índice de patología de la enfermedad. Por ejemplo, la acumulación de proteínas aberrantes como la sinucleína en el intestino y los cambios en la motilidad intestinal pueden estar relacionados con el desarrollo de patologías cerebrales y cambios en el comportamiento cognitivo.

Por lo tanto, CLARITY ofrece posibilidades ilimitadas de obtención de imágenes en tejido intacto en 3D sin el sesgo de interpretación que puede resultar de la sección de tejido en el contexto de una distribución desigual de los tipos de células. Además, numerosas variaciones del método de limpieza de tejidos, como la obtención de imágenes tridimensionales de órganos aclarados con disolventes (3DISCO), han evolucionado utilizando disolventes orgánicos ^9,10. El método CLARITY se ha modificado ampliamente para incorporar la química basada en carbodiimida para retener de manera estable los ARN en el tejido clarificado con el fin de mejorar la integridad del tejido y la estabilidad del ARN para ofrecer más posibilidades de hibridación in situ en el tejido aclarado, lo que podría explotarse en el análisis de microARN relevantes para diferentes patologías de enfermedades⁶. El método también se puede adaptar adecuadamente para teñir otros tejidos de ratón como el cerebro¹, el músculo esquelético¹¹, los ovarios¹² y otros tejidos de interés para la investigación como el tejido de biopsia humana¹³, el pez cebra⁸ y Drosophila, que también son modelos de investigación clave además del modelo murino.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores desean agradecer el apoyo de la Asociación Americana de Gastroenterología (AGA), el Premio Piloto de Investigación de Trastornos de la Motilidad Gastrointestinal Funcional de AGA-Roma (a la Columbia Británica), la subvención de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. AI64462 (ASN) y el Centro de Microscopía de Imagen Celular Integrada de la Universidad de Emory.