Imagerie de l’intestin avec « CLARITY »

Nous décrivons le protocole de coloration passive CLARITY (PACT) de l’intestin de souris pour permettre la visualisation des tissus sous-épithéliaux, y compris les neurones, les cellules gliales et les cellules entéroendocrines (EEC) sans sectionnement tissulaire. Le protocole implique l’incorporation d’hydrogel dans les tissus fixés au formaldéhyde, puis la délipidation à l’aide d’un détergent anionique pour « nettoyer » les tissus.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) a récemment évolué comme une technique précieuse impliquant l’intégration d’acrylamide pour délipider le tissu (sans section) et pour préserver la structure tissulaire 3D pour l’immunomarquage. La technique est très pertinente pour l’imagerie de l’environnement intestinal dynamique où différents types de cellules interagissent pendant l’homéostasie et les états pathologiques. Cette méthode optimisée pour l’intestin de souris est décrite ici, qui permet de tracer des types de cellules comme les épithéliums, les entéroendocrines, les neurones, la glie et les projections neuronales dans les cellules épithéliales ou entéroendocrines qui médient respectivement la détection microbienne ou la détection de chimiothérapie des nutriments. Le tissu intestinal (1-1,5 cm) est fixé dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 °C pendant la nuit du 1er jour. Le jour 2, le PFA est jeté et le tissu est lavé trois fois avec du PBS. Le tissu est enrobé d’hydrogel pour préserver son intégrité par incubation dans une solution d’hydrogel à 4 % (acrylamide) dans du PBS (dilué à partir de 30 % de ProtoGel) pendant une nuit à 4 °C. Le jour 3, la solution tissulaire-hydrogel est incubée à 37 °C pendant 1 h pour permettre la polymérisation de l’hydrogel. Le tissu est ensuite lavé trois fois doucement avec du PBS pour éliminer l’excès d’hydrogel. L’étape suivante de la délipidation (éclaircissement) implique l’incubation tissulaire dans du dodécylsulfate de sodium (8 % de SDS dans le PBS) à 37 °C pendant 2 jours (jours 4 et 5) sur un agitateur à température ambiante (RT). Le 6e jour, le tissu éliminé est soigneusement lavé avec du PBS pour éliminer le SDS. Les tissus peuvent être immunomarqués par incubation dans des anticorps primaires (dilués dans du sérum d’âne normal à 0,5 % dans du PBS contenant 0,3 % de Triton X-100), pendant une nuit à 4 °C, puis par incubation dans des anticorps secondaires Alexa Fluor appropriés pendant 1,5 h à RT, et par coloration nucléaire avec DAPI (1:10000). Le tissu est transféré sur une lame de verre propre et monté à l’aide de VectaShield pour l’imagerie confocale.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) a récemment évolué comme une technique précieuse impliquant l’enrobage d’acrylamide (hydrogel) et la délipidation tissulaire pour préserver la structure tissulaire 3D pour l’immunomarquage (sans section^)1,2. Le tissu intégré à l’hydrogel est optiquement transparent et perméable aux macromolécules, les protéines et les acides nucléiques étant préservés après l’élimination des lipides par détergent. CLARITY a été reconnu comme l’une des dix percées notables en 2013 par Science³. Bien qu’elle ait été développée à l’origine pour imager les tissus cérébraux riches en lipides où les lipides affectent la diffusion de la lumière et la qualité de l’imagerie, la technique est actuellement largement utilisée pour l’imagerie d’autres tissus comme l’intestin, le foie, les reins et le cœur. La technique offre la possibilité de colorer et d’imager un tissu en éliminant le besoin de sectionnement, ce qui pourrait autrement entraîner une évaluation biaisée des interactions cellule-cellule en raison de la distribution irrégulière des types de cellules. La technique offre également la possibilité d’effectuer des empilements z confocaux et de recréer une image tridimensionnelle du tissu, ce qui peut aider à déterminer les densités, la microarchitecture et l’interaction cellule-cellule entre divers types de cellules de manière plus réaliste qu’à partir d’une coupe de tissu. De plus, la technique a été modifiée pour permettre l’immunomarquage de tissus denses comme l’os, ainsi que des études d’hybridation in situ. Le tissu 3D intégré à l’hydrogel offre une plate-forme attrayante pour élucider les interactions entre les cellules épithéliales, entéroendocrines, gliales et neuronales, qui ont récemment été citées comme cruciales pour la compréhension de la physiopathologie de maladies telles que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, les troubles du spectre autistique,^{etc. 4}.

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité de l’Université Emory sur l’utilisation et le soin des animaux. Les souris C57BL/6 (mâles et femelles peuvent être utilisées) à l’âge de 8 à 12 semaines ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau avant l’euthanasie.

1. Ablation de l’intestin (jour 1)

1. Euthanasier la souris par asphyxie au dioxyde de carbone, à un débit de 1,6 mL de dioxyde de carbone gazeux jusqu’à ce que l’arrêt de la respiration soit observé pendant 2 minutes.
2. Placez la souris en décubitus dorsal sur une planche de dissection avec les membres épinglés. Stérilisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide d’une pince, ouvrez la peau avec des ciseaux.
3. Soulevez doucement le foie et identifiez l’estomac. Ensuite, en tenant l’estomac avec des pinces, coupez l’œsophage juste au-dessus de l’estomac. En tenant l’estomac avec des pinces, coupez doucement les mésentères et détachez l’intestin de la cavité abdominale jusqu’au rectum. Coupez l’intestin détaché au niveau du rectum.
4. Transférez l’intestin détaché dans une solution de PBS glacée dans une boîte de Pétri. Maintenant, coupez doucement le mésentère entre les segments iléaux et redressez l’intestin de sorte qu’en commençant par l’estomac, tous les mésentères soient coupés, jusqu’au côlon.
5. Coupez 1 à 1,5 cm de la région intestinale souhaitée pour la coloration CLARITY dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du PBS glacé.
6. À l’aide d’une seringue de 5 mL fixée à l’extrémité émoussée d’une aiguille de 20 G, rincer le contenu fécal avec du PBS glacé.
   REMARQUE : N’importe quelle région de l’intestin peut être utilisée pour la coloration CLARITY en utilisant la même technique. Le segment intestinal peut être ouvert le long du mésentère ou utilisé intact pour les étapes suivantes.

2. Fixation du tissu intestinal (Jour 1)

1. Fixez le tissu dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS.
2. Transférez un morceau de 1 à 1,5 cm du segment intestinal d’intérêt dans un tube conique de 15 mL rempli de PFA à 4 % à 4 °C pendant la nuit pour la fixation.

3. Enrobage d’hydrogel (Jour 2)

1. Transférez le segment intestinal d’une solution de PFA à 4 % à l’aide d’une pince dans un nouveau tube conique de 15 mL avec une solution de PBS et lavez-le trois fois (5 min chacune, sur un agitateur à 150-200 tr/min) pour éliminer tout résidu de PFA.
2. Préparation de l’hydrogel à 4 %
   1. Utilisez la solution de gel à 30 % (ProtoGel) pour préparer l’hydrogel. Pour préparer une solution d’hydrogel à 4 %, diluer la solution mère à 30 % est diluée dans du PBS. Pour préparer 12 ml d’hydrogel à 4 %, prendre 1,6 ml de solution de gel à 30 % et ajouter 10,4 ml de PBS.
3. Transférez le tissu fixé à partir de l’étape 3.1. à la solution d’hydrogel à 4 % dans du PBS dans un tube conique de 15 ml et incubé à 4 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : Il est fortement recommandé de laver le tissu sans PFA à l’aide de PBS après une nuit d’incubation. Les tissus stockés plus longtemps dans le PFA ne donnent pas de bons résultats avec les étapes et la coloration ultérieures. Le tissu fixé après les lavages PBS peut être stocké à 4 °C pendant une semaine.

4. Étape de polymérisation et de délipidation de l’hydrogel (éclaircissement) (Jour 3)

1. Prélever le tube conique contenant le tissu dans une solution d’hydrogel à partir de 4 °C. Transférer dans un bain-marie à 37 °C et incuber pendant 1 h. Cette étape permet la polymérisation de l’hydrogel.
2. Après 1 h, retirez le tube conique contenant le tissu incrusté dans l’hydrogel du bain-marie et versez la solution d’acrylamide. Maintenant, rincez doucement le mouchoir avec un seul lavage PBS à température ambiante pour éliminer l’excès d’hydrogel.
3. Étape de délipidation
   1. Délipidate en incubant le tissu dans du dodécylsulfate de sodium (8 % SDS) dans du PBS. Transférez le tissu incrusté d’hydrogel de l’étape 4.2 dans une solution de SDS à 8 % dans un tube conique de 50 ml. Assurez-vous que le tissu est complètement immergé dans la solution SDS et que le tube est bouché.
   2. Transférez le tube bouché de 50 ml contenant le tissu en FDS dans un agitateur à 37 °C (200 tr/min) à température ambiante pendant 2 jours (jours 4 et 5) pour permettre la délipidation.
      REMARQUE : S’assurer que la solution SDS est remplie à au moins 20-25 mL dans le tube conique de 50 mL, pour compenser toute évaporation qui pourrait se produire à 37 °C pendant les 2 jours d’incubation.
4. Les jours 4 et 5, incubez le tissu dans SDS à 37 °C (200 tr/min) à température ambiante.

5. Lavage du détergent du tissu nettoyé (jour 6)

1. Prélever le tissu de la solution SDS. Le tissu apparaîtra « clair » ou transparent.
2. Transférez le mouchoir dans un nouveau tube comical de 50 ml avec une solution de PBS et lavez-le au cours de la journée sur un agitateur (150-200 tr/min) à température ambiante avec plusieurs changements de PBS, pour s’assurer que toutes les traces de SDS sont éliminées. Au moins 10 changements de solution PBS garantiront que les tissus sont exempts de la FDS, et une bonne règle de base est de vérifier si le lavage final du PBS n’a pas de traces de mousse/mousse de la FDS. Il s’agit d’une étape critique car les SDS peuvent interférer avec les étapes de coloration ultérieures.
   REMARQUE : À la fin de la journée, le tissu éliminé après plusieurs lavages dans le PBS est maintenant prêt pour l’immunocoloration ou peut-être stocké à 4 °C jusqu’à 3 semaines.
3. Le stockage des tissus intestinaux clairsemés pendant plus d’un mois dans une solution de PBS affectera l’intégrité des tissus et la qualité de la coloration. Utilisez le tissu intestinal nettoyé immédiatement ou dans les 1 à 2 semaines suivant l’élimination pour de meilleurs résultats.

6. Coloration immunofluorescente des neurones, des cellules gliales et entéroendocrines

1. Transférez le tissu éliminé dans un tube de 1,5 ou 2 ml et incubez dans un volume de 500 μL des anticorps primaires respectifs dilués dans du sérum d’âne normal à 0,5 % dans du PBS contenant 0,3 % de Triton X-100) pendant une nuit à 4 °C. Les anticorps (Ab) utilisés : Tuj1 ou β-3-tubuline (marqueur neuronal Pan, 1:1000), protéine d’acide fibrillaire glial (GFAP, 1:500), chromogranine A (1:250).
2. Après une nuit d’incubation, soumettre le tissu à 3 lavages de PBS (5 minutes chacun avec 1 à 1,5 ml de PBS) pour éliminer les anticorps primaires non liés.
3. Transférez le tissu dans un nouveau tube, puis incubez avec 500 μL d’Alexa Fluor Ab (AF) secondaire approprié pendant 1,5 h à température ambiante dans l’obscurité. Les Ab secondaires utilisés sont AF 488 pour Tuj1 (1:1000), AF-555 pour GFAP (1:500) et AF 555 (1:250) pour Chromogranine A.
4. Après l’incubation, lavez le tissu trois fois avec du PBS comme à l’étape 6.2.
5. Pour colorer les noyaux, incuber le tissu dans du DAPI (dilution 1:10000 ou 0,2 μL dans 2 mL de PBS) pendant 5 min à température ambiante.
6. Enfin, transférez le tissu coloré sur une lame de verre propre, ajoutez une lamelle sur le tissu et fixez-le à l’aide de 100 μL de VectaShield pour l’imagerie confocale.
7. Placez les lames dans l’obscurité à température ambiante dans un support de lames pendant 30 min pour le séchage, après quoi elles peuvent être imagées ou stockées à -20 °C. La paroi intestinale de souris est assez mince et une fois ouverte le long du mésentère, elle peut être montée sur des lames de verre directement avec une lamelle. Si vous travaillez avec des tissus plus gros comme la rate, les reins, des lames de chambre (cavité) ou des espaceurs peuvent être utilisés. Pour les tissus plus gros comme, une lame de cavité peut être utilisée pour le montage.
   REMARQUE : Il est à noter que si le segment intestinal n’a pas été ouvert au début de l’étape (voir la note à l’étape 1), il est conseillé d’ouvrir le tube intestinal avec des micro-ciseaux qui faciliteront les étapes de montage.

7. Imagerie confocale

REMARQUE : Le tissu clair, coloré et monté peut être imagé immédiatement ou peut être stocké dans des boîtes à lames à -20°C.

1. Image à l’aide d’un microscope confocal (p. ex., Olympus FV1000).
2. Prenez des empilements z sur 50 m d’épaisseur du tissu intestinal pour visualiser les régions de la lumière intestinale vers la couche séreuse.
3. Stockez les images de la pile z sous forme de fichiers image, .avi fichiers vidéo ou convertissez-les en image 3D à l’aide du logiciel⁵.

Les images du tissu intestinal de souris clarifié par CLARITY sont représentées à la figure 1. Une mise en œuvre réussie du protocole permet d’obtenir des images nettes de haute qualité où tous les détails cellulaires peuvent être visualisés clairement. La coloration DAPI des noyaux est un très bon indice pour évaluer la qualité du protocole CLARITY et de l’immunocoloration ultérieure, car elle peut décrire l’intégrité du tissu. De plus, la forme de la cellule fournit également un indice sur la façon dont le protocole a réussi, en particulier dans le cas de cellules neuronales, gliales et entéroendocrines avec une morphologie cellulaire distincte. Une cellule déformée avec une coloration peu abondante / aberrante montre que la préparation des tissus a été compromise.

L’iléon de souris coloré avec le marqueur pan-neuronal Tuj1 (β-3-tubuline, rouge) et co-coloré avec le marqueur glial Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP, vert) est illustré à la figure 1A. La figure 1B montre une image 3D d’un côlon de souris coloré avec le marqueur neuronal Tuj1 (en rouge) généré à partir de la pile z à l’aide du logiciel d’imagerie. La coloration des cellules entéroendocrines produisant la chromogranine A dans le côlon de souris est illustrée à la figure 1C. Dans toutes les images, le bleu représente la coloration nucléaire avec DAPI. Les figures 1A et 1B ont été capturées à un grossissement de 40x et la figure 1C à 60x. La co-coloration telle que représentée dans la figure 1A peut être utilisée pour évaluer la co-localisation de divers marqueurs d’intérêt tels que les récepteurs sur des types de cellules spécifiques, les cellules immunitaires, etc. ou la co-localisation nucléaire avec DAPI. Les images 3D peuvent être utilisées pour comparer les densités cellulaires (par exemple, la densité neuronale myentérique) entre deux conditions expérimentales ou une souche de souris de type sauvage et knock-out, etc. La densité des projections neuronales peut également être évaluée en images 3D. Les changements dans les populations de cellules entéroendocrines avec des récepteurs d’intérêt dans des conditions physiologiques normales et pathologiques peuvent être évalués par coloration pour divers marqueurs comme la chromogranine, comme le montre la figure 1C. De plus, les changements d’intensité et/ou de localisation de diverses protéines de jonction serrée qui maintiennent l’intégrité de la barrière épithéliale peuvent être évalués par coloration CLARITY dans des conditions normales ou inflammatoires. Les tissus spléniques éliminés peuvent être colorés pour des types de cellules immunitaires spécifiques sur la base des intérêts de recherche impliquant des modèles de souris inflammatoires.

Ainsi, sans les étapes de sectionnement fastidieuses et les processus de récupération d’antigènes, le tissu peut être visualisé avec une qualité et des détails bien supérieurs sur toute son épaisseur via des piles z, et peut fournir les détails en 3D. La technique présente également l’avantage de pouvoir être utilisée pour colorer les tissus d’animaux imprégnés de sérum physiologique.

Figure 1 : Immunocoloration représentative des tissus intestinaux clairs. Images confocales (enface) de (A) l’iléon de souris nettoyé coloré avec le marqueur neuronal Tuj1 (β-3-tubuline) et le marqueur glial Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP), avec coloration nucléaire DAPI et (B) image 3D générée à partir de piles z de côlon de souris coloré avec Tuj1 (C) Cleared mouse colon coloré avec Chromogranine A et DAPI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La méthode CLARITY est très utile pour colorer l’intestin de souris afin de visualiser divers types de cellules, y compris les épithéliums, les neurones et les cellules gliales en 3D, en particulier le réseau de projections neuronales qui s’étendent à travers la paroi intestinale jusqu’à la lumière⁵ et leur innervation aux cellules gliales et EEC. La méthode présentée ici a été modifiée selon l’étude originale de Yang et al. 2014¹.

Les étapes critiques du protocole comprennent le rinçage immédiat du fixateur après la fixation du tissu intestinal pendant la nuit, l’enrobage ultérieur d’hydrogel et la délipidation. Les lavages PBS suite à la délipidation sont cruciaux pour éliminer le détergent résiduel utilisé dans l’étape de délipidation.

La coloration CLARITY est supérieure en ce sens qu’elle permet l’imagerie tissulaire préservant la structure tissulaire, les protéines et les acides nucléiques, sans section, fournit des images d’excellente qualité même dans les tissus perfusés, et l’évaluation 3D de la microarchitecture tissulaire et des interactions cellulaires comme neurone-glie, EEC-glia, etc. On observe également que les lames colorées CLARITY conservent une bonne fluorescence même après un stockage à -20 °C, et peuvent donc être imagées plus tard si nécessaire.

De plus, plusieurs modifications de la technique CLARITY l’ont rendue apte aux études d’hybridation in situ. Par exemple, la modification du processus à l’aide de la fixation à base de carbodiimide peut aider à préserver l’intégrité des acides nucléiques (ARN) et la quantification ultérieure⁶. Une nouvelle méthode appelée imagerie 3D des organes éliminés par solvant (3DISCO) a été spécifiquement développée en 2012 pour nettoyer les tissus du cerveau et de la moelle épinière de la souris, ainsi que l’ensemble du corps de Drosophila melanogaster (mouche des fruits). 3DISCO implique la fixation des tissus par le paraformaldéhyde, suivie d’étapes de déshydratation en série utilisant 50 à 100 % de tétrahydrofurane dans l’eau, suivie d’une extraction des lipides avec du dichlorométhane et d’une immersion finale dans de l’éther dibenzylique pour l’adaptation de l’indice de réfraction. Le protocole 3DISCO est le mieux adapté aux tissus fixes avec des fluorophores puissants comme la protéine fluorescente verte dans les modèles transgéniques. Plusieurs modifications du protocole 3DISCO comme iDISCO (immunomarking-enabled imaging of solvant cleared organs) et uDISCO (ultimate marking of solvent cleared organs) ont été perfectionnées pour permettre l’immunomarquage avant élimination (iDISCO) et préserver la fluorescence (uDISCO). CUBIC est une autre méthode de clarification développée en 2014 où, en plus des lipides, les chromophores absorbant la lumière à base de fer sont également retirés des tissus. Une comparaison de divers tissus et du processus d’élimination recommandé est détaillée dans une élégante revue de Muntifering et al. (2018)⁷.

CLARITY est également un excellent outil pour mesurer et comparer les densités cellulaires (neurones, cellules immunitaires, etc.) dans des conditions normales et pathologiques. Par exemple, les interactions hôte-pathogène ou l’inflammation caractérisées par l’infiltration de cellules immunitaires dans les tissus intestinaux et les ganglions peuvent être quantifiées par coloration CLARITY et sont supérieures au dénombrement des numéros de cellules à partir d’images obtenues à partir de coupes de tissus⁸. De même, la quantification des densités de cellules neuronales et gliales dans le plexi sous-muqueux et myentérique est possible par coloration CLARITY car nous ne disposons pas de marqueurs spécifiques pour différencier les populations neuronales ou gliales sous-muqueuses des populations neuronales ou gliales myentériques⁵.

Les limitations impliquent un temps comparativement plus long qui est nécessaire pour délipider ou éliminer les tissus, ce qui nécessite 5 jours pour le tissu intestinal. En plus des neurones, de la glie et de l’EEC, les tissus éliminés peuvent également être colorés pour divers types de cellules immunitaires dans l’intestin et d’autres tissus comme le foie, la rate et les reins. L’étape de délipidation devrait être modifiée en conséquence pour éliminer ces tissus, car les tissus plus gros comme le foie auraient besoin de plus de temps de délipidation pour disparaître (3 à 5 jours).

La coloration CLARITY est un outil précieux pour imager l’environnement intestinal en se concentrant sur les cellules épithéliales, entéroendocrines, neuronales, gliales et immunitaires, en mesurant les densités cellulaires (densités neuronales, immunitaires ou gliales) et l’interaction cellule-cellule dans des conditions homéostatiques et pathologiques. Étant donné que les interactions entre les neurones immunitaires, les cellules gliales immunitaires, les cellules gliales et les cellules gliales ont été fortement impliquées dans la physiopathologie des troubles cérébraux-intestinaux tels que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer et les troubles du spectre autistique⁴, CLARITY serait un excellent outil pour imager l’environnement intestinal dynamique et corréler les caractéristiques intestinales à la progression de la pathologie cérébrale. De plus, la coloration CLARITY pour des types de cellules spécifiques pourrait également être utilisée comme marqueur ou indice de pathologie de la maladie. Par exemple, l’accumulation de protéines aberrantes comme la synucléine dans l’intestin et les modifications de la motilité intestinale peuvent être corrélées au développement d’une pathologie cérébrale et à des changements dans le comportement cognitif.

Ainsi, CLARITY offre des possibilités illimitées d’imagerie dans les tissus intacts en 3D sans le biais d’interprétation qui peut résulter du sectionnement des tissus dans le contexte d’une distribution inégale des types de cellules. De plus, de nombreuses variantes de la méthode d’élimination des tissus, comme l’imagerie tridimensionnelle des organes éliminés par solvant (3DISCO), ont évolué en utilisant des solvants organiques ^9,10. De plus, la méthode CLARITY a été largement modifiée pour incorporer une chimie à base de carbodiimide afin de retenir de manière stable les ARN dans les tissus clarifiés afin d’améliorer l’intégrité des tissus et la stabilité des ARN afin d’offrir plus de possibilités d’hybridation in situ dans les tissus clairs, qui pourraient être exploitées dans l’analyse des microARN pertinents pour différentes pathologies pathologiques⁶. La méthode peut également être adaptée de manière appropriée pour colorer d’autres tissus de souris tels que le cerveau¹, le muscle squelettique¹¹, les ovaires¹² et d’autres tissus d’intérêt pour la recherche comme le tissu de biopsie humaine¹³, le poisson zèbre⁸ et la drosophile, qui sont également des modèles de recherche clés en plus du modèle murin.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’American Gastroenterology Association (AGA) AGA-Rome Functional GI motility Disorders Pilot Research Award (à la Colombie-Britannique), de la subvention AI64462 (ASN) des National Institutes of Health des États-Unis et de l’Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core.