DNA의 희귀 점 돌연변이에 대한 육안 검출

이 프로토콜은 금 나노 입자와 상자성 미량 입자를 활용하여 야생형 DNA 분자의 200배 초과에서 점 돌연변이 DNA를 육안으로 식별할 수 있도록 합니다.

이 프로토콜은 과도한 야생형 DNA에서 체세포 점 돌연변이를 감지하기 위한 육안 비색 검사를 설명합니다. 이 방법의 향후 예상 응용 분야는 액체 생검에서 순환하는 무세포 DNA에서 드문 돌연변이를 식별하는 것이며, 이는 암 진단 및 맞춤형 치료를 위한 종양 환자의 계층화와 관련이 있습니다. 개념 증명으로, 이 검사는 BRAF 유전자에서 BRAF^V600E 돌연변이를 검출하도록 설계되었으며, 이는 BRAF 억제제의 표적 치료로 혜택을 받을 수 있는 흑색종 환자의 하위 그룹을 식별하는 데 중요합니다. 그러나 이 비색 검사는 범용 검출 프로브를 사용하기 때문에 임상적 관련성이 있는 다른 체세포 돌연변이에 쉽게 일반화될 수 있으므로 종양 진단에 강력한 잠재력을 제공합니다.

이 검사는 BRAF^WT DNA를 초과하여 BRAF^V600E의 0.5%를 검출하며, 이는 일부 상용 기기 분석의 감도와 일치합니다. 이러한 민감도는 진단 목적과 임상적으로 관련이 있어 약물에 민감한 환자를 조기에 식별할 수 있습니다. Real-Time PCR을 기반으로 하는 상용 분석법과 달리, 이 검사는 표준 PCR(또는 등온 기법)로 증폭된 DNA에서 수행할 수 있고 단 1시간 만에 몇 단계의 단일 튜브 반응으로 육안 판독을 제공하기 때문에 최소한의 계측 및 처리가 필요합니다. 현재 이 검사는 합성 DNA 샘플에만 사용되어 왔습니다. 그러나 후자는 순환하는 무세포 DNA에서 증폭된 실제 샘플을 모방하도록 설계되어 테스트를 임상 진단으로 변환하는 데 유리합니다.

이 방법의 목적은 최소한의 계측 방법론과 육안 판독으로 DNA 샘플에서 과소 대표된 점 돌연변이를 검출하는 것입니다. 최종 목표는 암의 조기 진단 및 모니터링을 위해 순환하는 무세포 DNA(ccf-DNA)의 체세포 돌연변이(예: 혈액 생검 샘플)에서 체세포 돌연변이를 검출하기 위한 신속한 테스트의 향후 응용 분야에 적합한 원리 증명 분석을 갖는 것입니다¹. 암 관련 체세포 돌연변이는 중요한 암 바이오마커²를 나타내며 ccf-DNA의 미미한(그러나 매우 가변적인)³ 분획에 존재하여 식별을 어렵게 만듭니다⁴. 우리는 BRAF 키나아제의 구조적 활성화를 유발하는 발암성 돌연변이^{BRAF V600E}를 모델 타겟으로 선택했습니다. 이 돌연변이는 모든 BRAF 돌연변이 암의 80%에서 나타나며⁵ 일반적으로 순환 종양 DNA의 <1%에서만 나타난다⁶. 이 돌연변이를 가진 환자를 식별하는 것은 BRAF 억제제에 대한 치료 반응을 예측하기 때문에 중요합니다. 따라서 BRAF 돌연변이 상태를 평가하기 위한 여러 방법 7,8,9,10이 개발되었으며 민감도는 0.01%에서 2%에 이릅니다.

최신식 방법에 이 방법의 주요 이점은 그것의 탐지가 순간 PCR에 의하여 형광성 분자의 instrumental 탐지와 반대로, 계기 자유로운 (육안)이다. 또 다른 장점은 200개가 넘는 야생형 DNA 분자에서 하나의 단일 돌연변이된 DNA 분자를 구별하는 효율성입니다. 0.5%의 이 변별계수는 기기 검출에 기초한 일부 실험실 기반 또는 상업적으로 이용 가능한 키트의 변별계수보다 우월하거나¹¹ 또는^{일치하며12} 임상진단응용에 적합하다. 반면에, 실험실 프로토타입 테스트로서 이 방법은 온도에 민감한 단계를 수동으로 제어하는 데 의존합니다. 그러나 분석 단계의 수와 총 지속 시간은 제한되어 있어 자동화된 미세유체 시스템에서의 향후 구현이 가능합니다.

이 개념 증명 방법은 합성 DNA 분자를 사용하여 개발되었습니다. 클리닉에 효율적으로 전달하기 위해서는 환자의 혈액 생검에서 증폭된 실제 샘플을 사용하여 검증해야 합니다. 우리는 이 방법의 향후 응용 분야가 체액과 같은 처리되지 않은 복잡한 생물학적 매트릭스의 직접 분석을 위한 것이 아니라는 점에 주목합니다. 후자에서는 표준 방법론으로 DNA를 추출한 다음 증폭 및 정제해야 합니다. 결과적으로, 분석을 위한 출발 물질은 항상 정제 및 증폭된 DNA가 될 것이며, 이는 가능한 간섭 물질 측면에서 이 방법의 개발에 사용된 것과 같은 합성 DNA 샘플과 합리적으로 비교할 수 있습니다.

1. 금 나노 입자 프로브의 합성

1. 아래에 설명된 대로 2단계 표준 파종 성장 방법을 사용하여 40nm 구연산염 캡 금 나노 입자를 합성합니다.
   1. 고전적인 Turkevich-Frens 방법^13,14를 사용하여 15nm 구연산염 캡 금 나노 입자 (AuNP 종자)를 합성하십시오.
      1. 모든 유리 제품을 왕수(3:1 v/v 비율의 HCl:HNO₃ )로 세척하십시오.
      2. 0.25mM HAuCl₄ 250mL를 균일하게 저으면서 끓입니다.
         주의: HAuCl₄ 는 부식성이며 독성이 있습니다.
      3. 즉시 38.8mM Na₃∙시트레이트 25mL를 첨가합니다.
      4. 용액이 붉은 루비색으로 변하는 동안 30분 동안 계속 끓이고 저어줍니다.
      5. 열에서 용액을 제거하고 저어주면서 실온으로 식히십시오.
      6. 0.22μm PTFE 멤브레인 주사기 필터를 사용한 필터.
      7. 유리병에 4 °C에서 보관하십시오.
         참고: 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다.
   2. 성장 파종에 의해 40nm 구연산염 캡 금 나노 입자 (40nm AuNPs) 합성¹⁵.
      1. 용액 A 준비 : H₂O에서 총 부피 120 mL의 AuNP 종자 13 mL와 함께 갓 준비된 0.1 M 하이드 록실 아민 설페이트 390 μL.
         참고 : 원하는 크기를 얻는 데 필요한 AuNP 종자의 양은 다를 수 있습니다. 각각의 새로운 AuNP 종자에 대해 적정해야 합니다.
         주의 : 하이드록실아민 설페이트는 부식성, 독성, 돌연변이 유발 성이며 환경에 유해합니다. 취급 방법: 취급 후에는 철저히 세척하십시오. 오염된 의복을 벗고 재사용하기 전에 세탁하십시오. 적절한 환기와 함께 사용하십시오. 먼지 생성 및 축적을 최소화합니다. 눈, 피부, 의복에 닿지 않도록 하십시오. 용기를 단단히 닫아 보관하십시오. 먼지를 흡입하지 마십시오. 금속 주걱 또는 기타 금속 제품과 함께 사용하지 마십시오. 보관용: 단단히 밀폐된 용기에 보관하십시오. 서늘하고 건조하며 통풍이 잘되는 곳에 보관하고 호환되지 않는 물질이 없는 곳에 보관하십시오. 금속에서 멀리 보관하십시오.
      2. 용액 B 준비 : 12.25 mL의 H₂O + 0.25 mL의 0.1 M HAuCl₄.
      3. 용액 B를 주사기에 넣고 주사기 펌프에 주사기를 로드합니다.
      4. 주사기 펌프 매개 변수를 설정하십시오 : 주사기의 직경 (mm); 유속: 90mL/h; 총 부피: 10.80mL(이 중 0.8mL는 시스템 평형, 즉 튜브 충전에 필요한 초과분).
      5. 주사기 펌프를 시작합니다. 용액 B의 초기 0.8mL가 튜브를 채우고 폐기물 용기에 떨어뜨린 후 용액 A가 들어 있는 반응 플라스크 위에 튜브를 위치시키고(적당하고 균일한 교반 상태로 유지) 용액 B가 적변 방향으로 들어가도록 합니다.
      6. 갓 준비한 0.1M Na₃∙시트레이트 2.65mL를 넣고 5분 동안 저어줍니다.
      7. 얻어진 40nm AuNP를 10°C에서 18분 동안 2,460 x g 에서 원심분리하여 농축합니다.
      8. 부드럽게 흡입하여 상층액을 제거합니다. 잔류 부피에 부드럽게 재현탁합니다.
      9. 4 °C에서 보관하십시오.
         참고: 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다.
2. 표준 티올 화학에 의해 40nm 구연산염 캡핑 금 나노 입자를 기능화합니다¹⁶.
   1. 티올 화 프로브 올리고뉴클레오티드(5'T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3')를 10mM Tris(2-carboxyethil)포스핀(TCEP)으로 가벼운 진탕(400rpm)으로 3시간 동안 실온에서 배양하여 이황화 결합을 분해합니다.
   2. 과량의 소화된 올리고뉴클레오티드를 10 nM AuNPs로 하룻밤 동안 실온에서 가벼운 진탕(400 rpm)으로 배양합니다.
   3. 가벼운 진탕(400rpm)에서 10시간 동안 소금을 단계적으로 첨가하여 AuNPs-DNA 혼합물을 10mM 인산염 완충액, pH 7.4, 0.01% SDS에서 0.3M NaCl로 가져옵니다.
   4. 실온에서 약한 흔들림(400rpm)으로 밤새 배양합니다.
   5. DNA 접합 AuNP를 10mM 인산염 완충액에 0.25M NaCl과 0.01% SDS로 3회 세척하여 과도한 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드를 제거합니다.
   6. 얻은 범용 프로브-AuNP를 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
      참고: 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다.
   7. 상용 형광 기반 분석을 사용하여 AuNP에서 DNA 프로브의 밀도를 측정합니다.
   8. UV-vis 분광광도계로 AuNP의 농도를 측정합니다. 흡광도 데이터에서 AuNP 농도를 도출하기 위해 Lambert & Beer의 법칙(A=εbc)과 40nm^AuNPs16 에 대해 발표된 흡광 계수를 사용할 수 있습니다.
   9. AuNP 프로브를 동적 광 산란(DLS) 및 투과 전자 현미경(TEM)으로 특성화합니다.
      참고: 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다.

2. BRAF^V600E 희귀 돌연변이의 비색 변별

1. 분석을 위한 표적 시료 준비: 서로 다른 비율의 합성 BRAF^V600E DNA와 BRAF^WT DNA의 혼합물(BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100%, BRAF^wt 100%).
2. 혼성화 완충액(HB)(1x PBS pH 7.4, 5% w/v PEG 600)으로 두 번 세척하여 상자성 미립자를 평형화하고 시작 부피와 동일한 HB 부피로 재현탁합니다. 세척을 위해 상자성 미세입자 분취액을 1.5mL 튜브(최대 50μL/튜브)에 넣고 500μL의 HB를 첨가한 후 부드럽게 피펫팅하여 3회 혼합한 후 자석을 적용하고 투명한 상등액을 분리한 후 즉시 500μL의 HB를 추가하고 두 번째 세척 단계를 위해 절차를 반복합니다. 상층액을 제거한 후 제조업체의 조언에 따라 비드 건조를 피하기 위해 즉시 HB를 첨가하십시오.
3. 테스트할 각 샘플에 대해 HB에서 세척된 상자성 미세 입자 2.5μL가 들어 있는 튜브를 준비합니다.
4. 2.5μL의 상자성 미세입자를 BRAF^V600E 돌연변이를 보유한 비오틴화된 첫 번째 판별 프로브(DP1)의 10μM 용액 10μL와 함께 실온에서 5분 동안 배양하여 상자성 미세입자를 기능화합니다.
5. 언바운드 프로브를 간섭하는 미세입자를 자기적으로 분리하고 12.5μL의 HB에 재현탁합니다. 이를 위해 자석을 튜브 측면에 적용하고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다. 조심스럽게 피펫팅하여 용액을 제거하고, 즉시 HB를 첨가하고, 비드가 균일하게 재현탁될 때까지 부드럽게 피펫팅합니다.
6. 2.1단계에서 설명한 DNA 표적 샘플의 10μM 혼합물 중 10μL를 현탁액에 추가합니다.
7. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
8. 배양 중에는 상자성 미세입자의 침전을 방지하기 위해 3분마다 샘플을 흔듭니다.
9. 현탁액에 2 판별 프로브(DP2)의 2 μM 용액 10 μL를 추가하며, 이 프로브는 타겟과 폴리-A 테일을 보완하도록 설계되었습니다.
10. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
11. 배양 중에는 상자성 미세 입자의 침전을 방지하기 위해 3분마다 샘플을 흔듭니다.
12. 배양 후 과잉 DP2를 자기적으로 분리합니다.
13. 검출 프로브와 결합된 AuNP 300fmol을 즉시 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
14. 과량의 AuNP를 함유하는 상층액을 마그네틱으로 분리하고 실온에서 HB 100μL를 첨가하여 1^{차 세척 단계를} 수행합니다.
15. 상층액을 마그네틱하게 분리하고 HB 100μL를 첨가하여 2^차 세척 단계를 수행합니다.
16. 52 °C에서 5 분 동안 배양합니다.
17. 52 °C에서 자기적으로 분리된 상등액.
18. 비색 결과를 판독하기 위해 12.5μL의 HB에 즉시 재현탁합니다.
19. 결과를 촬영하고 샘플을 4°C에서 보관합니다.

이 방법은 BRAF^wt 합성 DNA를 과도하게 함유한 BRAF^V600E 돌연변이를 검출하는 데 사용되었습니다. 그림 1은 탐지 전략의 세부 정보를 보여줍니다. 이 분석은 비색 측정 YES / NO 결과^17,18을 제공하며, 여기서 빨간색은 양성 결과 (YES)에 해당하고 노란색은 음성 결과 (NO)에 해당합니다.

이 방법의 핵심 측면은 표적 DNA와 비표적 DNA가 하나의 단일 뉴클레오티드에 대해서만 다른 과도한 간섭 비표적 DNA의 맥락에서 표적 DNA를 구별하는 능력입니다. 따라서 프로브의 설계와 혼성화 조건은 민감한 식별을 달성하는 데 중요합니다. 이 분석은 범용 비색 프로브를 사용하여 관심 있는 모든 점 돌연변이를 검출하도록 조정되도록 설계되었습니다. 그러나, 새로운 ?...

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저자는 과학적, 재정적 지원을 해준 Stefano Gustincich 교수(Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, IT)에게 감사의 뜻을 전합니다. 저자는 또한 유용한 과학적 논의를 해준 Maurizio Congedo 박사(Vito Fazzi Hospital, Lecce, IT)와 Paolo Tarantino 박사(Vito Fazzi Hospital, Lecce, IT)에게 감사를 표합니다. 이 작업은 이탈리아의 플래그십 프로젝트 NanoMax의 일부 지원을 받았습니다.