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Method Article
このプロトコルは、金ナノ粒子と常磁性微粒子を利用することにより、野生型DNA分子の200倍過剰の点変異DNAの肉眼同定を可能にします。
このプロトコルは、野生型DNAの過剰における体細胞点突然変異を検出するための肉眼比色試験を説明しています。この方法の将来予測される応用は、リキッドバイオプシーからの循環無細胞DNAのまれな突然変異の同定であり、がん診断や個別化治療のための腫瘍患者の層別化に関連しています。概念実証として、この検査はBRAF遺伝子のBRAFV600E 変異を検出するように設計されており、これはBRAF阻害剤による標的療法の恩恵を受けることができる黒色腫患者のサブグループを特定するために重要です。しかし、この比色試験は、ユニバーサル検出プローブの使用により、臨床的に関連性のある他の体細胞変異に容易に一般化することができ、したがって、腫瘍学的診断において強力な可能性を提供する。
この検査では、BRAFV600E の0.5%が過剰なBRAFWT DNAを検出し、これは一部の市販の機器アッセイの感度と一致します。このような感度は、診断目的に臨床的に関連し、薬剤感受性の患者を早期に特定することができます。リアルタイムPCRに基づく市販のアッセイとは対照的に、この検査は、標準的なPCR(または等温技術)で増幅されたDNAに対して実行でき、わずか1時間で数ステップのワンチューブ反応で肉眼で読み出すことができるため、最小限の機器と処理で済みます。現在、この検査は合成DNAサンプルにのみ使用されています。しかし、後者は、循環する無細胞DNAから増幅された実際のサンプルを模倣するように設計されており、検査を臨床診断に変換するのに有利に働きます。
この方法の目的は、最小限の計装方法と肉眼での読み取りにより、DNAサンプル中の過小評価されている点変異を検出することです。最終的な目標は、がんの早期診断とモニタリングのための循環無細胞DNA(ccf-DNA)(血液生検サンプルなど)の体細胞変異の検出のための迅速検査における将来のアプリケーションに適した原理実証アッセイを持つことです1。がん関連の体細胞変異は、重要ながんバイオマーカー2であり、ccf-DNAのマイナーな(しかし非常に変動しやすい)3分画に存在するため、その同定は困難である4。モデル標的として、BRAFキナーゼの構成的活性化を引き起こす発がん性変異BRAFV600Eを選択した。この変異は、すべてのBRAF変異がんの80%に存在し5、一般に循環腫瘍DNAの<1%にしか存在しません6。この変異を持つ患者を特定することは、BRAF阻害剤に対する治療反応を予測するため、重要です。したがって、BRAF変異状態を評価するためのいくつかの方法7,8,9,10が開発されており、感度は0.01%から2%の範囲である。
この方法が最先端の方法と比較した場合の主な利点は、リアルタイムPCRによる蛍光分子の機器検出とは対照的に、その検出が機器不要(肉眼)であることです。別の利点は、200を超える野生型DNA分子のうち、1つの変異したDNA分子を識別できる効率です。この0.5%の識別係数は、機器による検出に基づいて、一部の実験室ベースまたは市販のキットよりも優れている11 または12 と一致しており、したがって、臨床診断アプリケーションに関連しています。一方、実験室でのプロトタイプテストとして、この方法は温度に敏感なステップの手動制御に依存しています。ただし、アッセイのステップ数と合計時間は限られているため、将来的には自動化されたマイクロ流体システムへの実装が考えられます。
この概念実証法は、合成DNA分子を用いて開発されました。クリニックへの効率的な翻訳のためには、患者の血液生検から増幅された実際のサンプルを使用して検証する必要があります。この方法の将来の応用分野は、体液などの未処理の複雑な生物学的マトリックスの直接分析を意図したものではないことに注意してください。後者から、DNAを標準的な方法で抽出し、増幅して精製する必要があります。したがって、分析の出発物質は常に精製および増幅されたDNAであり、干渉物質の可能性という点では、この方法の開発に使用されたような合成DNAサンプルと合理的に同等です。
1. 金ナノ粒子プローブの合成
2. BRAFV600E 希少変異の比色識別
この方法は、過剰なBRAFwt合成DNAにおけるBRAFV600E変異の検出に使用されました。図 1 は、検出戦略の詳細を示しています。アッセイは、比色YES/NO結果17,18を与え、赤は陽性結果(YES)に対応し、黄色は陰性結果(NO)に対応します。
簡単に説明すると、ストレプトアビジ?...
この分析法の中核的な側面は、1つのヌクレオチドについて標的DNAと非標的DNAが異なるだけの場合、過剰な干渉する非標的DNAの状況で標的DNAを識別する能力です。したがって、プローブの設計とハイブリダイゼーション条件は、感度の高い識別を達成するために重要です。このアッセイは、関心のある任意の点突然変異の検出に適応するために、ユニバーサル比色プ?...
著者は何も開示していません。
著者らは、科学的および財政的支援について、Stefano Gustincich教授(Istituto Italiano di Tecnologia、ジェノバ、IT)に感謝します。また、著者らは、有益な科学的議論を行ったMaurizio Congedo博士(Vito Fazzi Hospital, Lecce, IT)とPaolo Tarantino博士(Vito Fazzi Hospital, Lecce, IT)にも感謝しています。この作業は、イタリアの旗艦プロジェクトNanoMaxによって部分的に支援されました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bench Top Centrifuge- Allegra X 30 | Beckman Coulter | A99473 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D0632-25G | |
Dynabeads M-280 streptavidin paramagnetic microparticles | Invitrogen | 11205D | |
Hydroxylamine sulfate | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 379913-25G | |
KDS 100 Legacy Syringe Pump | kdScientific | 789100 | |
NanoDrop OneC spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA) | ||
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 806552-500ML | |
Pierce™ TCEP-HCl, No-Weigh™ Format | Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA) | A35349 | |
Polyethylene glycol 600 | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 202401 | |
PTFE 0,22 µm filters, Fluoropore | Millipore | FGLP04700 | |
Quant-iT™ OliGreen™ ssDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA) | O11492 | |
Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | W302600 | |
Synthetic oligonucleotides | Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA) | ||
Tetrachloroauric(III) acid | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 520918 | |
Thiolated polyT DNA probes | Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA) | ||
Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL JEM 1011 microscope | ||
Zetasizer Nano S - Dynamic Light Scattering System | Malvern Panalytical |
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