Nachweis seltener Punktmutationen in der DNA mit bloßem Auge

Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von punktmutierter DNA mit bloßem Auge in einem 200-fachen Überschuss an Wildtyp-DNA-Molekülen unter Verwendung von Goldnanopartikeln und paramagnetischen Mikropartikeln.

Das Protokoll beschreibt einen kolometrischen Test mit bloßem Auge zum Nachweis von somatischen Punktmutationen in einem Überschuss an Wildtyp-DNA. Die in Zukunft vorgesehene Anwendung der Methode ist die Identifizierung seltener Mutationen in zirkulierender zellfreier DNA aus Flüssigbiopsien, mit Relevanz in der Krebsdiagnostik und der Stratifizierung onkologischer Patienten für eine personalisierte Therapie. Als Proof of Concept wurde der Test entwickelt, um die BRAF^{V600E-Mutation} im BRAF-Gen nachzuweisen, was wichtig ist, um die Untergruppe der Melanompatienten zu identifizieren, die von gezielten Therapien mit BRAF-Inhibitoren profitieren können. Dieser kolorimetrische Test kann jedoch aufgrund der Verwendung von universellen Nachweissonden leicht auf andere somatische Mutationen von klinischer Relevanz verallgemeinert werden, was ein großes Potenzial in der onkologischen Diagnostik bietet.

Der Test weist 0,5 % BRAF^V600E in einem Überschuss an^BAF-WT-DNA nach, was der Empfindlichkeit einiger kommerzieller instrumenteller Assays entspricht. Eine solche Sensitivität ist klinisch relevant für diagnostische Zwecke und ermöglicht die frühzeitige Identifizierung arzneimittelempfindlicher Patienten. Im Gegensatz zu kommerziellen Assays, die auf Echtzeit-PCR basieren, erfordert dieser Test nur minimale Instrumentierung und Verarbeitung, da er an DNA durchgeführt werden kann, die mit einer Standard-PCR (oder isothermen Techniken) amplifiziert wurde, und eine Auslesung mit bloßem Auge mit einer Ein-Röhrchen-Reaktion von wenigen Schritten in nur einer Stunde ermöglicht. Bisher wird der Test nur bei synthetischen DNA-Proben angewendet. Letztere wurden jedoch so konzipiert, dass sie eine reale Probe nachahmen, die aus zirkulierender zellfreier DNA amplifiziert wurde, um die Übertragung des Tests in die klinische Diagnostik zu begünstigen.

Der Zweck der Methode besteht darin, unterrepräsentierte Punktmutationen in einer DNA-Probe mit einer minimal instrumentierten Methodik und einer Auslesung mit bloßem Auge zu erkennen. Das endgültige Ziel ist es, einen Proof-of-Principle-Assay zu haben, der für zukünftige Anwendungen in Schnelltests zum Nachweis von somatischen Mutationen in zirkulierender zellfreier DNA (ccf-DNA) (z. B. aus Blutbiopsieproben) für die Frühdiagnostik und Überwachung von Krebs geeignet^{ist 1}. Krebsbedingte somatische Mutationen stellen einen wichtigen Krebs-Biomarker^{dar 2} und sind in einer geringfügigen (aber sehr variablen)³ Fraktion der ccf-DNA vorhanden, was ihre Identifizierung schwierig macht⁴. Als Modellziel wählten wir die onkogene Mutation BRAF^V600E, die die konstitutive Aktivierung der BRAF-Kinase bewirkt. Diese Mutation ist bei 80 % aller BRAF-mutierten Krebsarten vorhanden⁵ und ist im Allgemeinen nur in <1 % der zirkulierenden Tumor-DNA vertreten⁶. Die Identifizierung von Patienten, die diese Mutation tragen, ist wichtig, da sie das therapeutische Ansprechen auf BRAF-Inhibitoren vorhersagt. Daher wurden mehrere Methoden 7,8,9,10 zur Beurteilung des BRAF-Mutationsstatus entwickelt, mit Sensitivitäten zwischen 0,01 % und 2 %.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber den neuesten Methoden der Technik besteht darin, dass ihre Detektion instrumentenfrei (bloßes Auge) erfolgt, im Gegensatz zur instrumentellen Detektion fluoreszierender Moleküle durch real-time PCR. Ein weiterer Vorteil ist seine Effizienz bei der Unterscheidung eines einzelnen mutierten DNA-Moleküls von mehr als 200 Wildtyp-DNA-Molekülen. Dieser Diskriminationsfaktor von 0,5 % ist besser¹¹ oder entspricht¹² dem einiger laborbasierter oder kommerziell erhältlicher Kits, die auf einem instrumentellen Nachweis basieren, und ist daher für klinische diagnostische Anwendungen relevant. Zum anderen beruht das Verfahren als Laborprototyptest auf der manuellen Steuerung temperaturempfindlicher Schritte. Die Anzahl der Schritte und die Gesamtdauer des Assays ist jedoch begrenzt, so dass eine zukünftige Implementierung in automatisierten mikrofluidischen Systemen denkbar ist.

Diese Proof-of-Concept-Methode wurde unter Verwendung synthetischer DNA-Moleküle entwickelt. Für eine effiziente Übertragbarkeit in die Kliniken sollte es anhand von realen Proben validiert werden, die aus Blutbiopsien von Patienten amplifiziert wurden. Wir weisen darauf hin, dass das zukünftige Anwendungsgebiet der Methode nicht die direkte Analyse von unverarbeiteten komplexen biologischen Matrices, wie z.B. Körperflüssigkeiten, sein soll. Aus letzterem muss die DNA mit Standardmethoden extrahiert und dann amplifiziert und gereinigt werden. Folglich wird das Ausgangsmaterial für die Analyse immer gereinigte und amplifizierte DNA sein, die hinsichtlich möglicher Störstoffe mit einer synthetischen DNA-Probe, wie sie für die Entwicklung dieser Methode verwendet wurde, einigermaßen vergleichbar ist.

1. Synthese von Gold-Nanopartikel-Sonden

1. Synthetisieren Sie 40-nm-Citrat-gedeckelte Goldnanopartikel unter Verwendung der zweistufigen Standard-Seeding-Wachstumsmethode, wie unten beschrieben.
   1. Synthese von 15 nm Citrat-gedeckelten Gold-Nanopartikeln (AuNPs-Samen) unter Verwendung der klassischen Turkevich-Frens-Methode^13,14.
      1. Alle Gläser mit Königswasser (HCl:HNO₃ im Verhältnis 3:1 v/v) spülen.
      2. 250 mL 0,25 mM HAuCl₄ unter gleichmäßigem Rühren zum Kochen bringen.
         ACHTUNG: HAuCl₄ ist ätzend und giftig.
      3. Sofort 25 mL 38,8 mM Na₃∙citrat zugeben.
      4. Kochen und Rühren 30 Minuten lang weiter, während die Lösung eine rote rubinrote Farbe annimmt.
      5. Die Lösung vom Herd nehmen und unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
      6. Filtrieren Sie mit 0,22 μm PTFE-Membranspritzenfiltern.
      7. Bei 4 °C in einer Glasflasche lagern.
         HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden.
   2. Synthetisieren Sie 40 nm Citrat-gedeckelte Goldnanopartikel (40 nm AuNPs) durch Seeding^{Growth 15}.
      1. Bereiten Sie Lösung A vor: 390 μl frisch zubereitetes 0,1 M Hydroxylaminsulfat mit 13 mL AuNP-Seeds in einem Gesamtvolumen von 120 mL in H₂O.
         HINWEIS: Die Menge an AuNPs-Seeds, die benötigt wird, um die gewünschte Größe zu erreichen, kann variieren; Er muss für jeden neuen AuNP-Saatgutbestand titriert werden.
         ACHTUNG: Hydroxylaminsulfat ist ätzend, giftig, mutagen und umweltschädlich. Für die Handhabung: Nach der Handhabung gründlich waschen. Kontaminierte Kleidung ausziehen und vor dem Wiedergebrauch waschen. Bei ausreichender Belüftung verwenden. Minimieren Sie die Staubentwicklung und -ansammlung. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung. Behälter fest verschlossen halten. Vermeiden Sie das Einatmen von Staub. Nicht mit Metallspatel oder anderen Metallgegenständen verwenden. Zur Lagerung: In einem dicht verschlossenen Behälter aufbewahren. An einem kühlen, trockenen und gut belüfteten Ort fern von unverträglichen Substanzen lagern. Von Metallen fernhalten.
      2. Lösung B herstellen: 12,25 mL H₂O + 0,25 mL 0,1 M HAuCl₄.
      3. Laden Sie Lösung B in eine Spritze und laden Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe.
      4. Stellen Sie die Parameter der Spritzenpumpe ein: Durchmesser der Spritze in mm; Durchflussmenge: 90 mL/h; Gesamtvolumen: 10,80 mL (davon 0,8 mL sind der Überschuss, der für die Systemäquilibrierung, d. h. die Röhrchenfüllung, benötigt wird).
      5. Starten Sie die Spritzenpumpe. Nachdem die ersten 0,8 ml Lösung B den Schlauch gefüllt haben und in einen Abfallbehälter gefallen sind, positionieren Sie das Röhrchen auf dem Reaktionskolben mit Lösung A (unter mäßigem und gleichmäßigem Rühren) und lassen Sie Lösung B tropfenweise eintreten.
      6. Verschließen Sie die Kappe mit 2,65 ml frisch zubereitetem 0,1 M Na₃∙citrat und rühren Sie 5 Minuten lang.
      7. Die erhaltenen 40 nm AuNPs werden durch Zentrifugieren bei 2.460 x g für 18 min bei 10 °C konzentriert.
      8. Entfernen Sie den Überstand durch leichtes Ansaugen. Sanft im Restvolumen resuspendieren.
      9. Bei 4 °C lagern.
         HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden.
2. Funktionalisierung von 40 nm Citrat-bedeckten Gold-Nanopartikeln durch Standard-Thiolchemie¹⁶.
   1. Verdau der Disulfidbindung durch Inkubation von thiolierten Sondenoligonukleotiden (5′ T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3′) mit 10 mM Tris(2-carboxyethil)phosphin (TCEP) bei Raumtemperatur für 3 Stunden unter leichtem Schütteln (400 U/min).
   2. Inkubieren Sie einen großen Überschuss der verdauten Oligonukleotide über Nacht mit 10 nM AuNPs bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln (400 U/min).
   3. Bringen Sie das AuNPs-DNA-Gemisch auf 0,3 M NaCl in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, 0,01 % SDS, indem Sie Salz schrittweise über einen Zeitraum von 10 Stunden unter leichtem Schütteln (400 U/min) hinzufügen.
   4. Über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln (400 U/min) inkubieren.
   5. Waschen Sie die DNA-konjugierten AuNPs 3-mal mit 0,25 M NaCl in 10 mM Phosphatpuffer plus 0,01 % SDS, um die überschüssigen ungebundenen Oligonukleotide zu entfernen.
   6. Lagern Sie die erhaltenen Universalsonden-AuNPs bis zur Verwendung bei 4 °C.
      HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden.
   7. Bestimmung der Dichte von DNA-Sonden auf den AuNPs mit einem kommerziellen fluoreszenzbasierten Assay
   8. Messen Sie die Konzentration von AuNP durch UV-Vis-Spektroskopie. Um die AuNPs-Konzentration aus den Absorptionsdaten abzuleiten, können das Lambert & Beer'sche Gesetz (A=εbc) und veröffentlichte Extinktionskoeffizienten für 40 nm AuNPs¹⁶ verwendet werden.
   9. Charakterisierung von AuNPs-Sonden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
      HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden.

2. Kolorimetrische Unterscheidung der seltenen BRAF^{V600E-Mutation}

1. Bereiten Sie Zielproben für die Analyse vor: Mischungen aus synthetischer BRAF^V600E DNA und BRAF^WT DNA in unterschiedlichen Verhältnissen (BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100%, BRAF^wt 100%).
2. Paramagnetische Mikropartikel werden durch zweimaliges Waschen mit Hybridisierungspuffer (HB) (1x PBS pH 7,4, 5% w/v PEG 600) äquilibriert und in einem HB-Volumen, das dem Ausgangsvolumen entspricht, resuspendiert. Geben Sie zum Waschen ein Aliquot paramagnetischer Mikropartikel in ein 1,5-ml-Röhrchen (maximal 50 μl/Röhrchen), fügen Sie 500 μl HB hinzu und mischen Sie dreimal durch vorsichtiges Pipettieren, setzen Sie den Magneten auf, trennen Sie den klaren Überstand, fügen Sie sofort 500 μl HB hinzu und wiederholen Sie den Vorgang für einen zweiten Waschschritt. Nach dem Entfernen des Überstands sofort das HB hinzufügen, um ein Austrocknen der Perlen zu vermeiden, wie vom Hersteller empfohlen.
3. Für jede zu untersuchende Probe ist ein Röhrchen mit 2,5 μl gewaschenen paramagnetischen Mikropartikeln in HB vorzubereiten.
4. Funktionalisieren Sie paramagnetische Mikropartikel durch Inkubation von 2,5 μl paramagnetischer Mikropartikel mit 10 μl einer 10 μM-Lösung einer biotinylierten ersten diskriminierenden Sonde (DP1), die die BRAF^{V600E-Mutation} aufweist, für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Trennen Sie die Mikropartikel magnetisch von störenden ungebundenen Sonden und resuspendieren sie in 12,5 μL HB. Bringen Sie zu diesem Zweck den Magneten an der Seite des Röhrchens an und warten Sie, bis die Lösung transparent ist. Entfernen Sie die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren, fügen Sie sofort HB hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, bis die Kügelchen homogen resuspendiert sind.
6. In die Suspension werden 10 μl eines 10 μM-Gemisches der in Schritt 2.1 beschriebenen DNA-Zielproben gegeben.
7. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
8. Während der Inkubation die Proben alle 3 Minuten schütteln, um eine Sedimentation der paramagnetischen Mikropartikel zu vermeiden.
9. Der Suspension werden 10 μl einer 2 μM-Lösung einer zweiten Diskriminationssonde (DP2) zugesetzt, die so konzipiert ist, dass sie einen zum Ziel komplementären Teil und einen Poly-A-Schwanz aufweist.
10. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
11. Während der Inkubation die Proben alle 3 Minuten schütteln, um eine Sedimentation der paramagnetischen Mikropartikel zu vermeiden.
12. Überschüssiges DP2 nach der Inkubation magnetisch abtrennen.
13. Sofort 300 fmol AuNPs, konjugiert mit Detektionssonden, zugeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
14. Überstand, der überschüssige AuNPs enthält, magnetisch abtrennen und den 1^. Waschschritt durch Zugabe von 100 μl HB bei Raumtemperatur durchführen.
15. Trennen Sie den Überstand magnetisch und führen Sie einen 2^. Waschschritt durch Zugabe von 100 μL HB durch.
16. Bei 52 °C 5 min inkubieren.
17. Magnetisch getrennter Überstand bei 52 °C.
18. Sofort in 12,5 μl HB resuspendieren, um das kolorimetrische Ergebnis auszulesen.
19. Fotografieren Sie die Ergebnisse und lagern Sie die Proben bei 4 °C.

Diese Methode wurde zum Nachweis einer BRAF^{V600E-Mutation} in einem Überschuss an BRAF^wt synthetischer DNA verwendet. Abbildung 1 zeigt die Details der Erkennungsstrategie. Der Assay liefert ein kolorimetrisches JA/NEIN-Ergebnis ^17,18, wobei Rot einem positiven Ergebnis (JA) und Gelb einem negativen Ergebnis (NEIN) entspricht.

Kurz gesagt, wurden stre...

Der Kernaspekt des Verfahrens ist die Fähigkeit, eine Ziel-DNA im Kontext eines Überschusses an interferierender Nicht-Ziel-DNA zu unterscheiden, wobei sich Ziel- und Nicht-Ziel-DNA nur für ein einzelnes Nukleotid unterscheiden. Daher sind das Design der Sonden und die Hybridisierungsbedingungen entscheidend, um eine empfindliche Unterscheidung zu erreichen. Der Assay ist so konzipiert, dass er universelle kolorimetrische Sonden verwendet, die an den Nachweis von Punktmutationen von I...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Autoren danken Professor Stefano Gustincich (Istituto Italiano di Tecnologia, Genua, IT) für die wissenschaftliche und finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken auch Dr. Maurizio Congedo (Vito Fazzi Hospital, Lecce, IT) und Dr. Paolo Tarantino (Vito Fazzi Hospital, Lecce, IT) für die nützlichen wissenschaftlichen Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise durch das italienische Flaggschiff-Projekt NanoMax unterstützt.