JoVE Logo

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يسمح هذا البروتوكول بتحديد الحمض النووي المتحور بالعين المجردة في زيادة 200 ضعف من جزيئات الحمض النووي من النوع البري ، من خلال استغلال جزيئات الذهب النانوية والجسيمات الدقيقة المغناطيسية.

Abstract

يصف البروتوكول اختبارا لونيا بالعين المجردة للكشف عن طفرات النقاط الجسدية في فائض من الحمض النووي من النوع البري. التطبيق المستقبلي المتوقع لهذه الطريقة هو تحديد الطفرات النادرة في الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة من الخزعات السائلة ، مع أهمية في تشخيص السرطان والتقسيم الطبقي لمرضى الأورام للعلاج الشخصي. كدليل على المفهوم ، تم تصميم الاختبار للكشف عن طفرة BRAFV600E في جين BRAF ، وهو أمر مهم لتحديد المجموعة الفرعية لمرضى الورم الميلانيني الذين يمكنهم الاستفادة من العلاجات المستهدفة بمثبطات BRAF. ومع ذلك ، يمكن تعميم هذا الاختبار اللوني بسهولة على الطفرات الجسدية الأخرى ذات الصلة السريرية بسبب استخدام مجسات الكشف الشاملة ، مما يوفر إمكانات قوية في تشخيص الأورام.

يكتشف الاختبار 0.5٪ من BRAFV600E في فائض من BRAFWT DNA ، والذي يطابق حساسية بعض فحوصات الأدوات التجارية. هذه الحساسية ذات صلة سريريا لأغراض التشخيص ، مما يسمح بالتعرف المبكر على المرضى الحساسين للأدوية. على عكس المقايسات التجارية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، يتطلب هذا الاختبار الحد الأدنى من الأجهزة والمعالجة ، حيث يمكن إجراؤه على الحمض النووي المضخم باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي (أو تقنيات متساوية الحرارة) ويوفر قراءة بالعين المجردة مع تفاعل أنبوب واحد لبضع خطوات في ساعة واحدة فقط. في الوقت الحاضر ، تم استخدام الاختبار فقط على عينات الحمض النووي الاصطناعية. ومع ذلك ، فقد تم تصميم هذا الأخير لتقليد عينة حقيقية تم تضخيمها من الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة ، لصالح ترجمة الاختبار إلى التشخيص السريري.

Introduction

الغرض من الطريقة هو اكتشاف الطفرات النقطية الممثلة تمثيلا ناقصا في عينة الحمض النووي باستخدام منهجية قليلة الأدوات وقراءة بالعين المجردة. الهدف النهائي هو الحصول على اختبار إثبات المبدأ ، مناسب للتطبيقات المستقبلية في الاختبارات السريعة للكشف عن الطفرات الجسدية في الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة (ccf-DNA) (على سبيل المثال ، من عينات خزعة الدم) للتشخيص المبكر ومراقبة السرطان1. تمثل الطفرات الجسدية المرتبطة بالسرطان مؤشرا حيويا مهما للسرطان2 وهي موجودة في جزء بسيط (ولكنه متغير للغاية)3 من ccf-DNA ، مما يجعل تحديدها صعبا4. اخترنا ، كهدف نموذجي ، الطفرة المسرطنة BRAFV600E التي تسبب التنشيط التأسيسي ل BRAF kinase. هذه الطفرة موجودة في 80٪ من جميع أنواع BRAF المتحولة5 ويتم تمثيلها بشكل عام في <1٪ فقط من الحمض النووي للورمالمنتشر 6. يعد تحديد المرضى الذين يحملون هذه الطفرة أمرا مهما لأنه ينبئ بالاستجابة العلاجية لمثبطات BRAF. لذلك ، تم تطوير عدة طرق7،8،9،10 لتقييم حالة طفرة BRAF ، مع حساسيات تتراوح من 0.01٪ إلى 2٪.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على أحدث الطرق هي أن اكتشافها خال من الأدوات (بالعين المجردة) ، على عكس الكشف الآلي عن جزيئات الفلورسنت عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. ميزة أخرى هي كفاءته في تمييز جزيء DNA متحور واحد في ما يزيد عن 200 جزيء من الحمض النووي من النوع البري. عامل التمييز هذا البالغ 0.5٪ أعلىمن 11 أو يطابق12 معامل بعض المجموعات المختبرية أو المتاحة تجاريا ، بناء على الكشف الآلي ، وبالتالي فهو مناسب لتطبيقات التشخيص السريري. من ناحية أخرى ، كاختبار نموذجي مختبري ، تعتمد الطريقة على التحكم اليدوي في الخطوات الحساسة لدرجة الحرارة. ومع ذلك ، فإن عدد الخطوات والمدة الإجمالية للفحص محدودة ، مما يجعل تنفيذه في المستقبل في أنظمة الموائع الدقيقة الآلية أمرا ممكنا.

تم تطوير طريقة إثبات المفهوم هذه باستخدام جزيئات الحمض النووي الاصطناعية. من أجل ترجمته الفعالة إلى العيادات ، يجب التحقق من صحته باستخدام عينات من العالم الحقيقي تم تضخيمها من خزعات دم المرضى. نلاحظ أن مجال التطبيق المستقبلي للطريقة لا يقصد به أن يكون التحليل المباشر للمصفوفات البيولوجية المعقدة غير المعالجة ، مثل سوائل الجسم. من الأخير ، يجب استخراج الحمض النووي بمنهجيات قياسية ، ثم تضخيمه وتنقيته. وبالتالي ، فإن المادة الأولية للتحليل ستكون دائما منقاة وتضخيم الحمض النووي ، والذي يمكن مقارنته بشكل معقول ، من حيث المواد المسببة للتدخل المحتملة ، بعينة الحمض النووي الاصطناعية ، مثل تلك المستخدمة لتطوير هذه الطريقة.

Protocol

1. تخليق مجسات الجسيمات النانوية للذهب

  1. قم بتصنيع جزيئات الذهب النانوية المغطاة بالسترات 40 نانومتر ، باستخدام طريقة نمو البذر القياسية المكونة من خطوتين كما هو مفصل أدناه.
    1. قم بتجميع جسيمات الذهب النانوية المغطاة بالسترات 15 نانومتر (بذور AuNPs) باستخدام طريقة Turkevich-Frens الكلاسيكية13،14.
      1. اغسل جميع الأواني الزجاجية باستخدام أكوا ريجيا (HCl: HNO3 بنسبة 3: 1 v / v).
      2. سخني 250 مل من 0.25 ملي HAuCl4 حتى يغلي مع التحريك بشكل موحد.
        تنبيه: HAuCl4 مادة أكالة وسامة.
      3. أضف على الفور 25 مل من 38.8 ملي Na3∙citrate.
      4. استمر في الغليان والتقليب لمدة 30 دقيقة ، بينما يتحول المحلول إلى لون الياقوت الأحمر.
      5. ارفعي المحلول عن النار واتركيه يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة مع التحريك.
      6. تصفية باستخدام مرشحات حقنة غشائية PTFE 0.22 ميكرومتر.
      7. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في زجاجة.
        ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا.
    2. قم بتصنيع جسيمات الذهب النانوية المغطاة بالسترات 40 نانومتر (40 نانومتر AuNPs) عن طريق نمو البذر15.
      1. تحضير المحلول أ: 390 ميكرولتر من كبريتات الهيدروكسي لامين الطازجة 0.1 M مع 13 مل من بذور AuNP بحجم إجمالي 120 مل في H2O.
        ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية بذور AuNPs اللازمة للحصول على الحجم المطلوب. يجب معايرتها لكل مخزون بذور جديد من AuNPs.
        تنبيه: كبريتات الهيدروكسي لامين مادة أكالة وسامة ومطفرة وخطرة على البيئة. للمناولة: يغسل جيدا بعد المناولة. قم بإزالة الملابس الملوثة وغسلها قبل إعادة استخدامها. استخدم مع تهوية كافية. تقليل توليد الغبار وتراكمه. تجنب ملامسة العينين والجلد والملابس. احتفظ بالحاوية مغلقة بإحكام. تجنب استنشاق الغبار. لا تستخدمه مع ملعقة معدنية أو أشياء معدنية أخرى. للتخزين: يحفظ في وعاء مغلق بإحكام. يحفظ في مكان بارد وجاف وجيد التهوية بعيدا عن المواد غير المتوافقة. الابتعاد عن المعادن.
      2. تحضير المحلول ب: 12.25 مل من H2O + 0.25 مل من 0.1 M HAuCl4.
      3. قم بتحميل المحلول B في حقنة وقم بتحميل المحقنة في مضخة حقنة.
      4. اضبط معلمات مضخة الحقنة: قطر المحقنة بالمليمتر ؛ معدل التدفق: 90 مل / ساعة ؛ الحجم الإجمالي: 10.80 مل (منها 0.8 مل هي الفائض اللازم لتحقيق توازن النظام ، أي ملء الأنبوب).
      5. ابدأ تشغيل مضخة الحقنة. بعد أن يملأ المحلول B الأولي 0.8 مل الأنبوب ويسقط في حاوية النفايات ، ضع الأنبوب أعلى قارورة التفاعل التي تحتوي على محلول A (يتم الاحتفاظ بها تحت التحريك المعتدل والموحد) واترك المحلول B يدخل بالتنقيط.
      6. غطيها بإضافة 2.65 مل من 0.1 M Na3∙citrate المحضرة حديثا ، وقلبي لمدة 5 دقائق.
      7. قم بتركيز 40 نانومتر AuNPs التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي عند 2,460 × جم لمدة 18 دقيقة عند 10 درجات مئوية.
      8. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط برفق. أعد التعليق برفق في الحجم المتبقي.
      9. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا.
  2. وظيفية 40 نانومتر من جزيئات الذهب المغطاة بالسترات بواسطة كيمياء الثيول القياسية16.
    1. هضم رابطة ثاني كبريتيد عن طريق احتضان قليل النوكليوتيدات المسبار الثيولي (5′ T (30) - (O - CH2 - CH2) 3 - SH 3 ′) مع 10 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات تحت اهتزاز خفيف (400 دورة في الدقيقة).
    2. احتضان فائض كبير من قليل النوكليوتيدات المهضومة بين عشية وضحاها باستخدام 10 نانومتر AuNPs ، في درجة حرارة الغرفة تحت اهتزاز خفيف (400 دورة في الدقيقة).
    3. ارفع خليط AuNPs-DNA إلى 0.3 M كلوريد الصوديوم في مخزن مؤقت للفوسفات 10 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.01٪ SDS ، عن طريق إضافة الملح خطوة بخطوة على مدى فترة زمنية مدتها 10 ساعات ، تحت اهتزاز خفيف (400 دورة في الدقيقة).
    4. احتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة تحت اهتزاز خفيف (400 دورة في الدقيقة).
    5. اغسل AuNPs المترافقة بالحمض النووي 3 مرات باستخدام 0.25 M كلوريد الصوديوم في محلول فوسفات 10 ملي مولار بالإضافة إلى 0.01٪ SDS ، لإزالة قليل النوكليوتيدات الزائدة غير المرتبطة.
    6. قم بتخزين المجسات العالمية التي تم الحصول عليها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا.
    7. تحديد كثافة مجسات الحمض النووي على AuNPs باستخدام مقايسة تجارية قائمة على التألق
    8. قياس تركيز AuNPs عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. من أجل اشتقاق تركيز AuNPs من بيانات الامتصاص ، يمكن استخدام قانون لامبرت وبير (A = εbc) ومعاملات الانقراض المنشورة ل 40 نانومتر AuNPs16 .
    9. توصيف مجسات AuNPs عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM).
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا.

2. التمييز اللوني للطفرة النادرة BRAFV600E

  1. تحضير العينات المستهدفة للتحليل: مخاليط من الحمض النووي الاصطناعي BRAFV600E والحمض النوويبالوزن BRAF بنسب مختلفة (BRAFV600E:BRAF WT 1:10 ، 1: 100 ، 1: 200 ، BRAFV600E 100٪ ، BRAFwt 100٪).
  2. قم بموازنة الجسيمات الدقيقة المغناطيسية عن طريق غسلها مرتين باستخدام المخزن المؤقت للتهجين (HB) (1x PBS pH 7.4 ، 5٪ وزن / حجم PEG 600) وإعادة تعليقها في حجم HB يساوي حجم البداية. للغسيل ، ضع كمية من الجسيمات الدقيقة المغناطيسية في أنبوب 1.5 مل (بحد أقصى 50 ميكرولتر / أنبوب) ، أضف 500 ميكرولتر من HB واخلطه ثلاث مرات عن طريق الماصة برفق ، وقم بتطبيق المغناطيس ، وافصل المادة الطافية الشفافة ، وأضف على الفور 500 ميكرولتر من HB وكرر الإجراء لخطوة غسيل ثانية. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف HB على الفور لتجنب تجفيف الخرزة ، وفقا لنصيحة الشركة المصنعة.
  3. لكل عينة يتم اختبارها ، قم بإعداد أنبوب يحتوي على 2.5 ميكرولتر من الجسيمات الدقيقة المغناطيسية المغسولة في HB.
  4. إضفاء الطابع الوظيفي على الجسيمات الدقيقة المغناطيسية عن طريق احتضان 2.5 ميكرولتر من الجسيمات الدقيقة المغناطيسية مع 10 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من مسبار تمييز أول بيوتينيل (DP1) ، الذي يؤوي طفرة BRAFV600E ، لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. افصل الجسيمات الدقيقة مغناطيسيا عن المجسات غير المرتبطة المتداخلة وأعد تعليقها في 12.5 ميكرولتر من HB. لهذا الهدف ، ضع المغناطيس على جانب الأنبوب ، وانتظر حتى يصبح المحلول شفافا. قم بإزالة المحلول عن طريق سحب العينة بعناية ، وأضف HB على الفور والماصة برفق حتى يتم تعليق الخرزات بشكل متجانس.
  6. أضف إلى المعلق 10 ميكرولتر من خليط 10 ميكرومتر من عينات الحمض النووي المستهدفة الموضحة في الخطوة 2.1.
  7. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. أثناء الحضانة ، رج العينات كل 3 دقائق لتجنب ترسيب الجسيمات الدقيقة المغناطيسية.
  9. أضف إلى المعلق 10 ميكرولتر من محلول 2 ميكرومتر لمسبار تمييزي ثان (DP2) ، مصمم بحيث يكون له جزء مكمل للهدف وذيل بولي A.
  10. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. أثناء الحضانة ، رج العينات كل 3 دقائق لتجنب ترسيب الجسيمات الدقيقة المغناطيسية.
  12. افصل مغناطيسيا DP2 الزائد بعد الحضانة.
  13. أضف على الفور 300 fmol من AuNPs المقترنة بمجسات الكشف واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  14. مادة طافية منفصلة مغناطيسيا تحتوي على AuNPs الزائدة وتنفيذخطوة الغسيل 1 عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من HB في درجة حرارة الغرفة.
  15. افصل المادة الطافية مغناطيسيا وقم بإجراءخطوة غسيل ثانية عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من HB.
  16. احتضان عند 52 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  17. طافي منفصل مغناطيسيا عند 52 درجة مئوية.
  18. أعد التعليق على الفور في 12.5 ميكرولتر من HB لقراءة نتيجة قياس الألوان.
  19. تصوير النتائج وتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

النتائج

تم استخدام هذه الطريقة للكشف عن طفرة BRAFV600E في فائض من الحمض النووي الاصطناعي BRAFwt . يوضح الشكل 1 تفاصيل استراتيجية الكشف. يعطي الاختبار نتيجة YES/NO اللونية17،18 حيث يتوافق اللون الأحمر مع نتيجة موجبة (YES) والأصفر مع ا?...

Discussion

الجانب الأساسي للطريقة هو القدرة على تمييز الحمض النووي المستهدف في سياق فائض من الحمض النووي غير المستهدف المتداخل ، حيث يختلف الحمض النووي المستهدف وغير المستهدف فقط بالنسبة لنيوكليوتيد واحد. وبالتالي ، فإن تصميم المجسات وظروف التهجين أمر بالغ الأهمية لتحقيق تمييز ح...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للبروفيسور ستيفانو جوستينشيش (المعهد الإيطالي للتكنولوجيا ، جينوفا ، تكنولوجيا المعلومات) للدعم العلمي والمالي. يعرب المؤلفون أيضا عن تقديرهم للدكتور ماوريتسيو كونجيدو (مستشفى فيتو فازي ، ليتشي ، تكنولوجيا المعلومات) والدكتور باولو تارانتينو (مستشفى فيتو فازي ، ليتشي ، تكنولوجيا المعلومات) للمناقشات العلمية المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المشروع الإيطالي الرائد NanoMax.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bench Top Centrifuge- Allegra X 30Beckman CoulterA99473
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, GermanyD0632-25G
Dynabeads M-280 streptavidin paramagnetic microparticlesInvitrogen11205D
Hydroxylamine sulfateSigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany379913-25G
KDS 100 Legacy Syringe PumpkdScientific789100
NanoDrop OneC spectrophotometerThermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)
Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany806552-500ML
Pierce™ TCEP-HCl, No-Weigh™ FormatThermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)A35349
Polyethylene glycol 600Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany202401
PTFE 0,22 µm filters, FluoroporeMilliporeFGLP04700
Quant-iT™ OliGreen™ ssDNA Assay KitThermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)O11492
Sodium citrate dihydrateSigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, GermanyW302600
Synthetic oligonucleotidesIntegrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Tetrachloroauric(III) acidSigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany520918
Thiolated polyT DNA probesIntegrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Transmission electron microscopy (TEM)JEOL JEM 1011 microscope
Zetasizer Nano S - Dynamic Light Scattering SystemMalvern Panalytical

References

  1. Udayan, G., Marsella, A., Valentini, P. An ultrasensitive colorimetric test for the detection of somatic rare mutations in DNA. Nanoscale. 12 (5), 2973-2979 (2020).
  2. Schwarzenbach, H., Hoon, D. S., Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11 (6), 426-437 (2011).
  3. Diehl, F., et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nature Medicine. 14 (9), 985-990 (2008).
  4. Diefenbach, R. J., Lee, J. H., Rizos, H. Monitoring Melanoma Using Circulating Free DNA. American Journal of Clinical Dermatology. 20 (1), 1-12 (2019).
  5. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  6. Sullivan, R. J., Flaherty, K. T. Resistance to BRAF-targeted therapy in melanoma. European Journal of Cancer. 49 (6), 1297-1304 (2013).
  7. Board, R. E., et al. Detection of BRAF mutations in the tumour and serum of patients enrolled in the AZD6244 (ARRY-142886) advanced melanoma phase II study. British Journal of Cancer. 101 (10), 1724-1730 (2009).
  8. Aung, K. L., et al. Analytical validation of BRAF mutation testing from circulating free DNA using the amplification refractory mutation testing system. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 343-349 (2014).
  9. Ascierto, P. A., et al. Phase II trial (BREAK-2) of the BRAF inhibitor dabrafenib (GSK2118436) in patients with metastatic melanoma. Journal of Clinical Oncology. 31 (26), 3205-3211 (2013).
  10. Shinozaki, M., et al. Utility of circulating B-RAF DNA mutation in serum for monitoring melanoma patients receiving biochemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2068-2074 (2007).
  11. Cheng, L., Lopez-Beltran, A., Massari, F., MacLennan, G. T., Montironi, R. Molecular testing for BRAF mutations to inform melanoma treatment decisions: a move toward precision medicine. Modern Pathology. 31 (1), 24-38 (2018).
  12. Ashida, A., Sakaizawa, K., Mikoshiba, A., Uhara, H., Okuyama, R. Quantitative analysis of the BRAF (V600E) mutation in circulating tumor-derived DNA in melanoma patients using competitive allele-specific TaqMan PCR. International Journal of Clinical Oncology. 21 (5), 981-988 (2016).
  13. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillier, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discussions of the Faraday Society. 11, 55-75 (1951).
  14. Frens, G. Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions. Nature Physical Science. 241 (105), 20-22 (1973).
  15. Jana, N. R., Gearheart, L., Murphy, C. J. Seeding Growth for Size Control of 5-40 nm Diameter Gold Nanoparticles. Langmuir. 17 (22), 6782-6786 (2001).
  16. Hurst, S. J., Lytton-Jean, A. K. R., Mirkin, C. A. Maximizing DNA Loading on a Range of Gold Nanoparticle Sizes. Analytical Chemistry. 78 (24), 8313-8318 (2006).
  17. Valentini, P., et al. Gold-nanoparticle-based colorimetric discrimination of cancer-related point mutations with picomolar sensitivity. ACS Nano. 7 (6), 5530-5538 (2013).
  18. Valentini, P., et al. Naked-eye fingerprinting of single nucleotide polymorphisms on psoriasis patients. Nanoscale. 8 (21), 11027-11033 (2016).
  19. Valentini, P., Pompa, P. P. A Universal Polymerase Chain Reaction Developer. Angewandte Chemie International Edition English. 55 (6), 2157-2160 (2016).
  20. Zhao, Y., Chen, F., Li, Q., Wang, L., Fan, C. Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chemical Reviews. 115 (22), 12491-12545 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BRAFV600E BRAF BRAF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved