A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يسمح هذا البروتوكول بتحديد الحمض النووي المتحور بالعين المجردة في زيادة 200 ضعف من جزيئات الحمض النووي من النوع البري ، من خلال استغلال جزيئات الذهب النانوية والجسيمات الدقيقة المغناطيسية.
يصف البروتوكول اختبارا لونيا بالعين المجردة للكشف عن طفرات النقاط الجسدية في فائض من الحمض النووي من النوع البري. التطبيق المستقبلي المتوقع لهذه الطريقة هو تحديد الطفرات النادرة في الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة من الخزعات السائلة ، مع أهمية في تشخيص السرطان والتقسيم الطبقي لمرضى الأورام للعلاج الشخصي. كدليل على المفهوم ، تم تصميم الاختبار للكشف عن طفرة BRAFV600E في جين BRAF ، وهو أمر مهم لتحديد المجموعة الفرعية لمرضى الورم الميلانيني الذين يمكنهم الاستفادة من العلاجات المستهدفة بمثبطات BRAF. ومع ذلك ، يمكن تعميم هذا الاختبار اللوني بسهولة على الطفرات الجسدية الأخرى ذات الصلة السريرية بسبب استخدام مجسات الكشف الشاملة ، مما يوفر إمكانات قوية في تشخيص الأورام.
يكتشف الاختبار 0.5٪ من BRAFV600E في فائض من BRAFWT DNA ، والذي يطابق حساسية بعض فحوصات الأدوات التجارية. هذه الحساسية ذات صلة سريريا لأغراض التشخيص ، مما يسمح بالتعرف المبكر على المرضى الحساسين للأدوية. على عكس المقايسات التجارية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، يتطلب هذا الاختبار الحد الأدنى من الأجهزة والمعالجة ، حيث يمكن إجراؤه على الحمض النووي المضخم باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي (أو تقنيات متساوية الحرارة) ويوفر قراءة بالعين المجردة مع تفاعل أنبوب واحد لبضع خطوات في ساعة واحدة فقط. في الوقت الحاضر ، تم استخدام الاختبار فقط على عينات الحمض النووي الاصطناعية. ومع ذلك ، فقد تم تصميم هذا الأخير لتقليد عينة حقيقية تم تضخيمها من الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة ، لصالح ترجمة الاختبار إلى التشخيص السريري.
الغرض من الطريقة هو اكتشاف الطفرات النقطية الممثلة تمثيلا ناقصا في عينة الحمض النووي باستخدام منهجية قليلة الأدوات وقراءة بالعين المجردة. الهدف النهائي هو الحصول على اختبار إثبات المبدأ ، مناسب للتطبيقات المستقبلية في الاختبارات السريعة للكشف عن الطفرات الجسدية في الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة (ccf-DNA) (على سبيل المثال ، من عينات خزعة الدم) للتشخيص المبكر ومراقبة السرطان1. تمثل الطفرات الجسدية المرتبطة بالسرطان مؤشرا حيويا مهما للسرطان2 وهي موجودة في جزء بسيط (ولكنه متغير للغاية)3 من ccf-DNA ، مما يجعل تحديدها صعبا4. اخترنا ، كهدف نموذجي ، الطفرة المسرطنة BRAFV600E التي تسبب التنشيط التأسيسي ل BRAF kinase. هذه الطفرة موجودة في 80٪ من جميع أنواع BRAF المتحولة5 ويتم تمثيلها بشكل عام في <1٪ فقط من الحمض النووي للورمالمنتشر 6. يعد تحديد المرضى الذين يحملون هذه الطفرة أمرا مهما لأنه ينبئ بالاستجابة العلاجية لمثبطات BRAF. لذلك ، تم تطوير عدة طرق7،8،9،10 لتقييم حالة طفرة BRAF ، مع حساسيات تتراوح من 0.01٪ إلى 2٪.
الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على أحدث الطرق هي أن اكتشافها خال من الأدوات (بالعين المجردة) ، على عكس الكشف الآلي عن جزيئات الفلورسنت عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. ميزة أخرى هي كفاءته في تمييز جزيء DNA متحور واحد في ما يزيد عن 200 جزيء من الحمض النووي من النوع البري. عامل التمييز هذا البالغ 0.5٪ أعلىمن 11 أو يطابق12 معامل بعض المجموعات المختبرية أو المتاحة تجاريا ، بناء على الكشف الآلي ، وبالتالي فهو مناسب لتطبيقات التشخيص السريري. من ناحية أخرى ، كاختبار نموذجي مختبري ، تعتمد الطريقة على التحكم اليدوي في الخطوات الحساسة لدرجة الحرارة. ومع ذلك ، فإن عدد الخطوات والمدة الإجمالية للفحص محدودة ، مما يجعل تنفيذه في المستقبل في أنظمة الموائع الدقيقة الآلية أمرا ممكنا.
تم تطوير طريقة إثبات المفهوم هذه باستخدام جزيئات الحمض النووي الاصطناعية. من أجل ترجمته الفعالة إلى العيادات ، يجب التحقق من صحته باستخدام عينات من العالم الحقيقي تم تضخيمها من خزعات دم المرضى. نلاحظ أن مجال التطبيق المستقبلي للطريقة لا يقصد به أن يكون التحليل المباشر للمصفوفات البيولوجية المعقدة غير المعالجة ، مثل سوائل الجسم. من الأخير ، يجب استخراج الحمض النووي بمنهجيات قياسية ، ثم تضخيمه وتنقيته. وبالتالي ، فإن المادة الأولية للتحليل ستكون دائما منقاة وتضخيم الحمض النووي ، والذي يمكن مقارنته بشكل معقول ، من حيث المواد المسببة للتدخل المحتملة ، بعينة الحمض النووي الاصطناعية ، مثل تلك المستخدمة لتطوير هذه الطريقة.
1. تخليق مجسات الجسيمات النانوية للذهب
2. التمييز اللوني للطفرة النادرة BRAFV600E
تم استخدام هذه الطريقة للكشف عن طفرة BRAFV600E في فائض من الحمض النووي الاصطناعي BRAFwt . يوضح الشكل 1 تفاصيل استراتيجية الكشف. يعطي الاختبار نتيجة YES/NO اللونية17،18 حيث يتوافق اللون الأحمر مع نتيجة موجبة (YES) والأصفر مع ا?...
الجانب الأساسي للطريقة هو القدرة على تمييز الحمض النووي المستهدف في سياق فائض من الحمض النووي غير المستهدف المتداخل ، حيث يختلف الحمض النووي المستهدف وغير المستهدف فقط بالنسبة لنيوكليوتيد واحد. وبالتالي ، فإن تصميم المجسات وظروف التهجين أمر بالغ الأهمية لتحقيق تمييز ح...
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
يعرب المؤلفون عن امتنانهم للبروفيسور ستيفانو جوستينشيش (المعهد الإيطالي للتكنولوجيا ، جينوفا ، تكنولوجيا المعلومات) للدعم العلمي والمالي. يعرب المؤلفون أيضا عن تقديرهم للدكتور ماوريتسيو كونجيدو (مستشفى فيتو فازي ، ليتشي ، تكنولوجيا المعلومات) والدكتور باولو تارانتينو (مستشفى فيتو فازي ، ليتشي ، تكنولوجيا المعلومات) للمناقشات العلمية المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المشروع الإيطالي الرائد NanoMax.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bench Top Centrifuge- Allegra X 30 | Beckman Coulter | A99473 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D0632-25G | |
Dynabeads M-280 streptavidin paramagnetic microparticles | Invitrogen | 11205D | |
Hydroxylamine sulfate | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 379913-25G | |
KDS 100 Legacy Syringe Pump | kdScientific | 789100 | |
NanoDrop OneC spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA) | ||
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 806552-500ML | |
Pierce™ TCEP-HCl, No-Weigh™ Format | Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA) | A35349 | |
Polyethylene glycol 600 | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 202401 | |
PTFE 0,22 µm filters, Fluoropore | Millipore | FGLP04700 | |
Quant-iT™ OliGreen™ ssDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA) | O11492 | |
Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | W302600 | |
Synthetic oligonucleotides | Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA) | ||
Tetrachloroauric(III) acid | Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 520918 | |
Thiolated polyT DNA probes | Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA) | ||
Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL JEM 1011 microscope | ||
Zetasizer Nano S - Dynamic Light Scattering System | Malvern Panalytical |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved