Detección a simple vista de mutaciones puntuales raras en el ADN

Este protocolo permite la identificación a simple vista de ADN mutado puntual en un exceso de 200 veces de moléculas de ADN de tipo salvaje, mediante la explotación de nanopartículas de oro y micropartículas paramagnéticas.

El protocolo describe una prueba colorimétrica a simple vista para la detección de mutaciones puntuales somáticas en un exceso de ADN de tipo salvaje. La futura aplicación prevista del método es la identificación de mutaciones raras en el ADN libre circulante de biopsias líquidas, con relevancia en el diagnóstico del cáncer y la estratificación de pacientes oncológicos para la terapia personalizada. Como prueba de concepto, la prueba ha sido diseñada para detectar la mutación BRAF^V600E en el gen BRAF, que es importante para identificar el subgrupo de pacientes con melanoma que pueden beneficiarse de terapias dirigidas con inhibidores de BRAF. Sin embargo, esta prueba colorimétrica puede generalizarse fácilmente a otras mutaciones somáticas de relevancia clínica gracias al uso de sondas de detección universales, lo que proporciona un gran potencial en el diagnóstico oncológico.

La prueba detecta un 0,5% de BRAF^V600E en un exceso de ADN BRAF^WT , que coincide con la sensibilidad de algunos ensayos instrumentales comerciales. Dicha sensibilidad es clínicamente relevante para fines diagnósticos, permitiendo la identificación temprana de pacientes sensibles a los medicamentos. A diferencia de los ensayos comerciales basados en PCR en tiempo real, esta prueba requiere una instrumentación y un procesamiento mínimos, ya que se puede realizar en ADN amplificado con una PCR estándar (o técnicas isotérmicas) y proporciona una lectura a simple vista con una reacción de un solo tubo de unos pocos pasos en solo una hora. En la actualidad, la prueba solo se ha utilizado en muestras de ADN sintético. Sin embargo, estos últimos han sido diseñados para imitar una muestra real amplificada a partir de ADN libre de células circulantes, para favorecer la traducción de la prueba al diagnóstico clínico.

El propósito del método es detectar mutaciones puntuales subrepresentadas en una muestra de ADN con una metodología mínimamente instrumentada y una lectura a simple vista. El objetivo final es disponer de un ensayo de prueba de principio, adecuado para futuras aplicaciones en pruebas rápidas para la detección de mutaciones somáticas en el ADN libre circulante (ccf-DNA) (por ejemplo, a partir de muestras de biopsias de sangre) para el diagnóstico precoz y el seguimiento del cáncer¹. Las mutaciones somáticas relacionadas con el cáncer representan un importante biomarcador^{de cáncer 2} y están presentes en una fracción menor (pero muy variable)³ del ADN-ccf, lo que dificulta su identificación⁴. Elegimos como diana modelo la mutación oncogénica BRAF^V600E que provoca la activación constitutiva de la quinasa BRAF. Esta mutación está presente en el 80% de todos los cánceres con mutaciones en BRAF⁵ y generalmente está representada en solo el <1% del ADN tumoral circulante⁶. La identificación de los pacientes portadores de esta mutación es importante, ya que es predictiva de la respuesta terapéutica a los inhibidores de BRAF. Por lo tanto, se han desarrollado varios métodos 7,8,9,10 para evaluar el estado de la mutación BRAF, con sensibilidades que oscilan entre el 0,01% y el 2%.

La principal ventaja de este método frente a los métodos de última generación es que su detección es sin instrumentos (a simple vista), a diferencia de la detección instrumental de moléculas fluorescentes por PCR en tiempo real. Otra ventaja es su eficiencia para discriminar una sola molécula de ADN mutada en un exceso de 200 moléculas de ADN de tipo salvaje. Este factor de discriminación del 0,5% es superior¹¹ o igual a¹² al de algunos kits de laboratorio o disponibles comercialmente, basados en una detección instrumental y, por lo tanto, es relevante para aplicaciones de diagnóstico clínico. Por otro lado, como prueba prototipo de laboratorio, el método se basa en el control manual de pasos sensibles a la temperatura. Sin embargo, el número de pasos y la duración total del ensayo son limitados, lo que hace concebible su futura implementación en sistemas microfluídicos automatizados.

Este método de prueba de concepto se ha desarrollado utilizando moléculas de ADN sintéticas. Para que su traslación sea eficiente a las clínicas, debe validarse mediante el uso de muestras del mundo real amplificadas a partir de biopsias de sangre de los pacientes. Observamos que el campo de aplicación futuro del método no pretende ser el análisis directo de matrices biológicas complejas sin procesar, como los fluidos corporales. De este último, el ADN debe extraerse con metodologías estándar, y luego amplificarse y purificarse. En consecuencia, el material de partida para el análisis siempre será ADN purificado y amplificado, que sea razonablemente comparable, en términos de posibles sustancias interferentes, a una muestra de ADN sintético, como la utilizada para el desarrollo de este método.

1. Síntesis de sondas de nanopartículas de oro

1. Sintetice nanopartículas de oro cubiertas de citrato de 40 nm, utilizando el método de crecimiento de siembra estándar de dos pasos como se detalla a continuación.
   1. Sintetizar nanopartículas de oro recubiertas de citrato de 15 nm (semillas de AuNPs) utilizando el método clásico de Turkevich-Frens^13,14.
      1. Lave toda la cristalería con agua regia (HCl:HNO₃ en una proporción de 3:1 v/v).
      2. Calentar 250 mL de 0,25 mM HAuCl₄ a hervir mientras se revuelve uniformemente.
         PRECAUCIÓN: HAuCl₄ es corrosivo y tóxico.
      3. Agregue inmediatamente 25 mL de 38.8 mM_{de 3∙}citrato de Na3∙.
      4. Continúe hirviendo y revolviendo durante 30 minutos, mientras la solución adquiere un color rojo rubí.
      5. Retire la solución del fuego y deje enfriar a temperatura ambiente mientras revuelve.
      6. Filtre con filtros de jeringa de membrana de PTFE de 0,22 μm.
      7. Conservar a 4 °C en una botella de vidrio.
         NOTA: El experimento se puede pausar aquí.
   2. Sintetice nanopartículas de oro cubiertas de citrato de 40 nm (AuNPs de 40 nm) mediante la siembra de crecimiento¹⁵.
      1. Prepare la solución A: 390 μL de sulfato de hidroxilamina 0,1 M recién preparado con 13 mL de semillas de AuNP en un volumen total de 120 mL en H₂O.
         NOTA: La cantidad de semillas de AuNPs necesarias para obtener el tamaño deseado puede variar; debe ser titulado para cada nuevo stock de semillas de AuNPs.
         PRECAUCIÓN: El sulfato de hidroxilamina es corrosivo, tóxico, mutagénico y peligroso para el medio ambiente. Para la manipulación: Lavar a fondo después de la manipulación. Quítese la ropa contaminada y lávela antes de volver a usarla. Úselo con ventilación adecuada. Minimice la generación y acumulación de polvo. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. Mantenga el recipiente bien cerrado. Evite respirar polvo. No lo use con espátula de metal u otros artículos metálicos. Para almacenamiento: Almacene en un recipiente herméticamente cerrado. Almacene en un lugar fresco, seco y bien ventilado, lejos de sustancias incompatibles. Mantener alejado de los metales.
      2. Preparar la solución B: 12,25 mL de H₂O + 0,25 mL de 0,1 M HAuCl₄.
      3. Cargue la solución B en una jeringa y cargue la jeringa en una bomba de jeringa.
      4. Ajuste los parámetros de la bomba de jeringa: diámetro de la jeringa en mm; caudal: 90 mL/h; volumen total: 10,80 mL (de los cuales, 0,8 mL son el exceso necesario para el equilibrio del sistema, es decir, el llenado del tubo).
      5. Ponga en marcha la bomba de jeringa. Después de que los 0,8 mL iniciales de solución B hayan llenado el tubo y caído a un contenedor de residuos, coloque el tubo encima del matraz de reacción que contiene la solución A (mantenido bajo agitación moderada y uniforme) y deje que la solución B entre gota a gota.
      6. Tape agregando 2,65 mL de citrato 0,1 M Na₃∙ recién preparado y revuelva durante 5 min.
      7. Concentrar los 40 nm AuNPs obtenidos centrifugando a 2.460 x g durante 18 min a 10 °C.
      8. Retire el sobrenadante aspirando suavemente. Vuelva a suspender suavemente en el volumen residual.
      9. Conservar a 4 °C.
         NOTA: El experimento se puede pausar aquí.
2. Funcionalice nanopartículas de oro cubiertas de citrato de 40 nm mediante química tiol estándar¹⁶.
   1. Digiera el enlace disulfuro incubando oligonucleótidos de sonda tiolados (5′ T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3′) con 10 mM de Tris(2-carboxyethil)fosfina (TCEP) a temperatura ambiente durante 3 h bajo una agitación suave (400 rpm).
   2. Incubar un gran exceso de los oligonucleótidos digeridos durante la noche con 10 nM de AuNPs, a temperatura ambiente bajo una agitación suave (400 rpm).
   3. Lleve la mezcla de AuNPs-ADN a 0,3 M de NaCl en tampón de fosfato de 10 mM, pH 7,4, 0,01% SDS, añadiendo sal de forma escalonada durante un intervalo de tiempo de 10 h, bajo una agitación suave (400 rpm).
   4. Incubar durante la noche a temperatura ambiente bajo una agitación suave (400 rpm).
   5. Lave las AuNPs conjugadas con ADN 3 veces con NaCl 0,25 M en tampón de fosfato 10 mM más 0,01% SDS, para eliminar el exceso de oligonucleótidos no unidos.
   6. Almacene las sondas universales-AuNPs obtenidas a 4 °C hasta su uso.
      NOTA: El experimento se puede pausar aquí.
   7. Determine la densidad de las sondas de ADN en las AuNP utilizando un ensayo comercial basado en fluorescencia
   8. Mida la concentración de AuNPs mediante espectroscopía UV-vis. Para derivar la concentración de AuNPs a partir de los datos de absorbancia, se puede utilizar la Ley de Lambert y Beer (A=εbc) y los coeficientes de extinción publicados para AuNPs¹⁶ de 40 nm.
   9. Caracterizar las sondas de AuNPs mediante dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM).
      NOTA: El experimento se puede pausar aquí.

2. Discriminación colorimétrica de la mutación rara BRAF^V600E

1. Preparación de muestras objetivo para el análisis: mezclas de ADN sintético BRAF^V600E y ADN BRAF^WT en diferentes proporciones (BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100%, BRAF^wt 100%).
2. Equilibrar las micropartículas paramagnéticas lavándolas dos veces con tampón de hibridación (HB) (1x PBS pH 7,4, 5% p/v PEG 600) y volver a suspenderlas en un volumen de HB igual al volumen inicial. Para el lavado, coloque una alícuota de micropartículas paramagnéticas en un tubo de 1,5 mL (máximo 50 μL/tubo), agregue 500 μL de HB y mezcle tres veces pipeteando suavemente, aplique el imán, separe el sobrenadante transparente, agregue inmediatamente 500 μL de HB y repita el procedimiento para un segundo paso de lavado. Después de retirar el sobrenadante, agregue inmediatamente el HB para evitar que se sequen las gotas, según lo aconsejado por el fabricante.
3. Para cada muestra a analizar, prepare un tubo que contenga 2,5 μL de micropartículas paramagnéticas lavadas en HB.
4. Funcionalice micropartículas paramagnéticas incubando 2,5 μL de micropartículas paramagnéticas con 10 μL de una solución de 10 μM de una primera sonda discriminatoria biotinilada (DP1), que alberga la mutación BRAF^V600E , durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Separe magnéticamente las micropartículas de las sondas no unidas que interfieren y vuelva a suspenderlas en 12,5 μL de HB. Para ello, aplique el imán en el lateral del tubo y espere hasta que la solución esté transparente. Retire la solución pipeteando cuidadosamente, agregue inmediatamente HB y pipetee suavemente hasta que las perlas se vuelvan a suspender homogéneamente.
6. Añadir a la suspensión 10 μL de una mezcla de 10 μM de las muestras de ADN diana descritas en el paso 2.1.
7. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
8. Durante la incubación, agite las muestras cada 3 minutos para evitar la sedimentación de las micropartículas paramagnéticas.
9. Añadir a la suspensión 10 μL de una solución de 2 μM de una segunda sonda discriminante (DP2), diseñada para tener una porción complementaria al objetivo y una cola de poli-A.
10. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
11. Durante la incubación, agite las muestras cada 3 minutos para evitar la sedimentación de las micropartículas paramagnéticas.
12. Separe magnéticamente el exceso de DP2 después de la incubación.
13. Añadir inmediatamente 300 fmol de AuNPs conjugados con sondas de detección e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
14. Separar magnéticamente el sobrenadante que contenga el exceso de AuNPs y realizar el^1er paso de lavado añadiendo 100 μL de HB a temperatura ambiente.
15. Separar magnéticamente el sobrenadante y realizar un^2º paso de lavado añadiendo 100 μL de HB.
16. Incubar a 52 °C durante 5 min.
17. Sobrenadante separado magnéticamente a 52 °C.
18. Vuelva a suspender inmediatamente en 12,5 μL de HB para la lectura del resultado colorimétrico.
19. Fotografíe los resultados y almacene las muestras a 4 °C.

Este método se utilizó para la detección de la mutación BRAF^V600E en un exceso de ADN sintético BRAF^wt. En la figura 1 se muestran los detalles de la estrategia de detección. El ensayo da un resultado colorimétrico SÍ/NO^17,18 donde el rojo corresponde a un resultado positivo (SÍ) y el amarillo a uno negativo (NO).

Brevemente, las micropartíc...

El aspecto central del método es la capacidad de discriminar un ADN objetivo en el contexto de un exceso de ADN no objetivo que interfiere, donde el ADN objetivo y el ADN no objetivo solo difieren en un solo nucleótido. Por lo tanto, el diseño de las sondas y las condiciones de hibridación son críticas para lograr una discriminación sensible. El ensayo está diseñado para utilizar sondas colorimétricas universales que se adaptarán a la detección de cualquier mutación puntual d...

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores agradecen al profesor Stefano Gustincich (Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, IT) por el apoyo científico y financiero. Los autores también agradecen al Dr. Maurizio Congedo (Hospital Vito Fazzi, Lecce, IT) y al Dr. Paolo Tarantino (Hospital Vito Fazzi, Lecce, IT) por sus útiles discusiones científicas. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el proyecto insignia italiano NanoMax.