Name: protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism at JoVE

この原稿の作成は、コロラド大学デンバー大学（JMRE）からのスタートアップファンドによってサポートされました。 AFはResearch and Creative Activities賞（RaCAS、CU Denver）の支援を受けたいと考えています。コロラド大学デンバー校の研究サービスオフィスからの報奨金は、出版費用をカバーすると認められています。私たちはビデオ部分での貢献について、Cassandra HerbertさんとYannick K. Dzowoさんに感謝したいと思います。

RNAオリゴヌクレオチドの固相合成<ol><li> 各ホスホラミダイトを含有する溶液の調製（表1）。 <ol><li>ヌクレオチドの数を数え、各塩基に対応するn + 1式（n =ヌクレオチドの数）に適合させ、欠損値を表に記入する。容積= 0.1Mの濃度でヌクレオチド当たり0.15mL、無水アセトニトリルに溶解した。 </li><li>各ホスホラミダイトをオーブン乾燥した10mLのアンバーボトル（Septum Top Amber 394 Amidite 13mm ID x 20mm OD Top）に入れ、直ちに乾燥剤を含むデシケーターを用いて真空下に置く。 </li><li>乾燥アルゴンでデシケータを満たし、ボトルを取り出し、対応する量のアセトニトリル（無水）で直ちに希釈してから、機器に固定します。 注記：気密シリンジを使用し、常に無水の雰囲気を保つようにしてください。 </li><li>ボトルからセプタムを取り出し、machine、ボトル変更機能を介して。 注：このプロセスでは、合成前にラインをプライミングするために、各溶液の追加0.15 mL（したがって、上記のn + 1式の余分な容量）が必要です。 </li></ol></li><li> ソフトウェアを用いたシーケンスおよび固相合成のセットアップ（ 図3 ）。 <ol><li>ソフトウェアアイコン（ 例： OligoNet 1.0.1）をクリックし、 機器名&gt; OKを選択します。 ファイル&gt;新規合成&gt;順序で新しい合成を作成します。 </li><li>記入：日付; RunID;楽器を選択する。シーケンス名。配列（5 &#39;から3&#39;末端）。 |サイクルの下で、前に作成したメソッドを割り当てます （ 図3 ）。エンド手順（ CPG樹脂に結合したオリゴヌクレオチドを残す）&gt;マニュアルを選択します。 </li><li> DMT Off&gt;を選択してください（合成の終わりに5&#39;-OH基を得る最後のステップでTCA処理） 。 ファイルを保存&gt;名前を付けて保存実験の名前を指定します。 </li><li>ファイルを送信して合成を開始するOrder&gt;シンセサイザに順序を送信して列を選択する 1-4 。シンセサイザーウィンドウを開き、 トリチルモニター|機能|トリティ|各ステップを選択を選択します 。 </li><li>一度に合成されるオリゴヌクレオチドの数に応じて必要に応じてステップを繰り返します（すべてのオーダーは同じ方法、 すなわち同じカップリング時間と一連の事象を有しなければならないことに注意してください）。 </li><li> シンセサイザを開始する準備を開始します。機器に表示されている位置に希望の3 &#39;端のカラムを置きます。計測器で、[ スタート]&gt; [いいえ ]（ABI準備用）をクリックします。 </li><li>合成が完了したら、カラムを機器から取り出し、丸底フラスコに入れ、減圧下で約0.5時間乾燥させる。 注記：深いオレンジ色がランドで観察されることを確認することをお勧めしますトリチルモニター機能からの潜在的なエラーを避けるために、カップリング（ステップ1.2.4~1.2.7）が必要である。 </li></ol></li><li> RNAオリゴヌクレオチドの脱保護および精製。 <ol><li>黒色のキャップをねじってカラムを開き、白色樹脂のすべて（または必要性または目的に応じて半分）を1.6 mL遠心チューブに移します。メチルアミン（水中40％）/アンモニア（水中40％）0.5mLを1：1で加える。 </li><li>パラフィルムで遠心チューブキャップを固定し、ヒートブロックを使用して60℃で1.5時間加熱します。 注：アンモニア濃度が反応チューブ内で一定に保たれるように、重いものをチューブの上に置くことができます。 </li><li>ヒートブロックから取り出し、室温までゆっくりと冷ます。試料を簡単に遠心分離して内容物を遠心分離し、上清を新しい遠心管に移す。 </li><li>チューブを液体窒素（またはドライアイス/エタノールバス）に浸してサンプルを凍結させ、スピンしながら乾固する減圧下で遠心分離する。 </li><li> 0.4mLのトリエチルアミン/ N-メチルピロリジノン/トリエチルアミン - トリヒドロフルオライド（2：2：3の比）溶液に固体を再懸濁する。 60℃で1.5時間加熱した後、室温までゆっくりと冷却する。 </li><li> 0.04mLのNaOAc溶液（3M、pH5.5 - HClで調整）を添加し、続いてピペットチップで穏やかに混合する。エタノール（1mL）を添加し、約1時間冷却する。 -70℃（ドライアイス/エタノール浴）15分間。 </li><li> 15,000 rpmで4℃で10分間遠心分離する。ピペットを使用してアリコートを抽出し、得られたペレットを減圧下で乾燥させる。 </li><li>得られた固体をローディングバッファー（0.2mL、90％水溶液ホルムアミド、1mM EDTA）に再懸濁し、混合物が均質になるまで混合する。 </li><li>予め調製したポリアクリルアミドゲル（20％変性、ウェルの寸法：30cm×1mm）に懸濁液をロードする22 。 </li><li>ブロモフェノールブルーマーカーが1/2〜2/3の間に位置するまでゲルに電流を流すゲルを下ろす（ゲルの寸法：〜21.5cm×30cm）。 </li><li>スタンドからゲルを取り出し、ガラスからプラスチックのラップ（両側を覆う）にゲルの内容物を移し、シリカで覆われた薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート（254nmの蛍光色素を含む）上に置き、バンドを可視化するUVランプ（ λmax = 254nm）を用いて測定した。 </li><li>マーカーを使用して、上部バンドの位置を示し、新しいカミソリの刃を使用してカットします。 50mLコニカルチューブにRNAを含むゲル（プラスチックラップなし）を置き、ガラス棒を用いて小片に粉砕する。 </li><li>ゲル残留物をNaCl水溶液に懸濁する。溶液（2mMおよび1mM EDTA）で洗浄し、懸濁液を37℃で12時間振とうする。コニカルチューブを10分間遠心分離する。 </li><li>逆相C18カートリッジを使用して脱塩する。 <ol><li> 10 mL注射器を使用してカートリッジを次のもので洗浄して準備します。 アセトニトリル（10mL） H 2 O（2回、10mL） 5mMのNH4 Cl aq。溶液（3mL） RNAを含む溶液で、ゲル残渣のいずれかを注ぎ込まないように注意してください。 </li><li> H 2 O（3回、10mL）で洗浄する。 </li><li> 60％aq。を用いてカラムから溶出する。メタノール溶液（3mL） </li></ol></li><li>減圧下で濃縮し、RNaseフリー水（0.3mL）に再溶解する。 </li><li>希薄溶液（10μL）を調製し、UV-vis装置（ 例えば Nanodrop）に1μLを掛けてUV-可視スペクトル（200-450nm）を測定する。 </li><li>得られた溶液の濃度を決定するためにBeer Lambertの法則を使用します： <img alt="式1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> A =得られた吸光度; ε =計算されたモル吸光係数。 c =濃度、1mmの経路長に対してl = 0.1である。 </li><li>オリゴヌクレオチドのモル吸光係数を計算する。オンライン計算機でここで計算それはDINAMeltソフトウェア（http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt）23を使用しています</li></ol></li><li> MALDI-TOFを介した濃度の決定および特性評価。 <ol><li> C18チップを充填したピペットチップを使用してサンプルを脱塩し、各オリゴヌクレオチドをスポットする。 <ol><li>先端を50％アセトニトリル（10μL×2）で洗浄する。チップを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA;10μL×2）で平衡化する。チップをチップにロードします（通常100-150 pmol）。 </li><li> 0.1％TFA（10μL×2）で、次いで水（10μL×2）でチップを洗浄する。 </li><li>所望のマトリックスを含む溶液に試料を溶出させる; 10μLの25mM-2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（THAP）、10mMクエン酸アンモニウム、および300mMフッ化アンモニウムの50％アセトニトリル溶液を使用した。 </li><li> 0.9μLを析出させ（その後、空気乾燥させる）、そして必要に応じて手順を繰り返すことによって、MALDIプレート上に直接スポットする。 注：すべてのスペクトルは、反射体ポジモードで得られた。 </li></ol></li></ol></li></ol> CD 経由 2. RNAの構造解析<ol><li> CD用溶液の調製。 <ol><li>修飾RNA [3μM]、NaCl [10mM]、リン酸ナトリウム緩衝液[10mM、pH7.2]およびMgCl 2 [5mM]を含む0.25mLを調製する。このサンプルはそのまま、特に単分子トランジションであればそのまま分析の準備ができています。 </li><li>目的が二本鎖構造または二分子転移を分析することである場合は、現時点で補体（該当する場合は1モル当量）を添加するか、または下のステップを続行します。 </li><li> 90°Cに予熱したヒートブロックにサンプルを置き、室温までの低速冷却（通常2〜4時間）を制御するために熱をオフにします。 </li></ol></li><li> スペクトル取得 <ol><li>ブランク溶液（NaCl 10mM、リン酸ナトリウム10mM、pH7.3、MgCl 2 5mM）を調製し、マイクロキュベット（1cmの経路長、250μLの最小容量）を使用し、機器内のサンプルチェンジャーのホルダ位置に置きます。 </li><li> RNAを含むサンプルを別のマイクロキュベットに移し、サンプルチェンジャーにセットします。熱変性の変化を測定する場合は、水層を破壊することなく油の層を注意深く加え、テフロン（登録商標）テープを用いてキュベットのキャップを固定する。 </li><li>窒素タンクを開けて、機器に設置されたエアーフローターをca. 40.クーラーの電源を入れます。 </li><li>機器の電源を入れ、ソフトウェアのSpectra Managerアイコンを開き、取得ウィンドウのSpectra Measurementを開きます。 </li><li>取得する前に、機器を窒素で5分間パージしてください。 </li><li> Measure&gt; Parametersを使用してスペクトルを取得し、次のようにパラメータを調整します。 <ol><li> General（一般）で 、次の項目を選択します。Scan 200-350 nm;チャネルCDとHT：データピッチ0.1nm; 100nm /分における走査速度; 1nmにおけるバンド幅; 5での累積数。 </li><li> セル単位で20℃を選択します。 制御下では、シャッターは自動的に開閉されます。を選択します。 情報の下で、名前、濃度、演算子を選択します。 </li><li> データの下で、目的のフォルダを参照します。 [ OK]をクリックします。 </li></ol></li><li> 測定&gt;サンプル測定を行い 、それに応じてサンプルチェンジャー1-6のキュベットの位置を特定し、 OKをクリックします。 </li></ol></li><li> 熱変性に移行する場合： <ol><li>取得ソフトウェアを終了するファイル&gt;終了し、新しいプログラムを開きます。 可変温度測定&gt;測定&gt;パラメータ 。 </li><li>次のパラメータを適用して、必要に応じて調整可能な熱遷移を記録します。 <ol><li> 温度の下で開始温度を選択してください：4℃;間隔：0.2;タrget：90℃;勾配：1℃/分; 0秒待ちます。 「 開始/終了」で 、「開始条件と終了条件」を選択します。 </li><li> General（一般）で 、3 Channels、CD / HT / Absを選択します。帯域幅：1nm;波長：270nm（または必要に応じて）。 [ 制御]で[なし]を選択します。 情報の下で、名前、濃度、演算子を選択します。 </li><li> データの下で、目的のフォルダを参照します。 [ OK]をクリックします。 </li></ol></li><li>サンプルを4℃に冷却し、この温度で5分間放置してからスペクトル測定を行います。 </li></ol></li><li> スペクトルのデータ処理。 <ol><li>ソフトウェア上の関数を使用して、ターゲット取得からのブランクスペクトルを減算し、使用中のバッファーシステムから生じるバックグラウンドシグナルを考慮に入れます： Spectra Analysis&gt; File&gt; Open 。 </li><li>空白のファイルとスペク​​トルファイルを開いたら、ビュー1の下のビュー2（画面の左側）をドラッグします。 </li><li> Prをクリックocessing&gt; subtraction&gt; OKまたは交換データ&gt; OKをクリックします。 </li><li>データをASCIIファイルとして抽出します： ファイル&gt;エクスポートを選択し、 ASCIIを選択します。 </li><li>ソフトウェアを使用して、対応するスペクトルをプロットします。信号対雑音比が予想よりも低い場合、データの平滑化はオプションです。この変換は、平滑化データオプションを適用することによって適用できます。 </li></ol></li><li> 熱変性転移のためのデータワークアップ。 <ol><li> ASCIIファイルとしてJASCOファイルからデータを抽出します。 </li><li>楕円率の点を温度の関数としてプロットする。典型的には、検査される波長に応じてデータの平滑化が必要である。ある場合には、210nmでの波長の使用は平滑化を必要とするプロット間のより大きな変動を示した。しかし、試料および濃度に応じて、生データを用いて多数の計算が行われた。 </li><li>サーマルデンを計算するにはaturation遷移（T mの）値は、曲線の一次導関数を得ます。最大値または最小値は、このパラメータの指標であった。前のステップと同様に、最も正確な値を得るためにデータの平滑化が必要な場合もありました。 注：実験は、典型的には三連で実施され、その結果、対応する測定の平均および標準偏差が得られた。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

この原稿の目的は、DNAまたはRNAのオリゴヌクレオチドの合成を首尾よく達成または促進するための、初心者または専門家の分野の研究者へのガイドとして役立つことである。記載された方法論は、標準的なホスホロアミダイト化学を介した自動DNA / RNA合成装置を用いた固相合成の使用に焦点を当てている。この報告書は、RNAドデカマーの合成、精製、および特徴付けの段階的描写について記?...

DNA / RNAのオリゴヌクレオチドを得るために、固相合成は、ホスホルアミダイトビルディングブロック4を使用して、1970年代1は、様々な分野でいくつかのアプリケーションを配信している強力なツールである2,3。その広範な影響の例としては、その6をプローブ構造（クリック化学反応を介して ）標識の衝撃5、、およびアンチセンス技術7、ならびに遺伝物質10のような生物学的機構8、9、ソースのその解明、および研究を我々はここで使用する多くothers.The修飾のうち種々の天然および/または化学修飾11、12、含有RNAオリゴヌクレオチドを得るための努力の最初のステップを表しますこの重要な生体高分子の構造および機能の時間的制御を可能にする光活性プローブ。 5 &#39; - [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39; - [AUG AUU CCG UAG] -3&#39;（下線部はC2&#39;- O-チオフェニルメチル修飾の取り込みを表す）を用いたRNAドデカマーの合成）が本研究の焦点となる。この配列は、RNA鎖の単鎖またはその対応する二本鎖構造（他の二次構造は熱力学的に安定であるとは予測されなかった）として定量化および測定できるように選択した。 CDを使用して、構造パラメーター、 すなわち二本鎖形成および熱変性転移を確立した。 合成 これらのオリゴヌクレオチドを得るための全体的な手順を図1に示し、段階的方法に従う：自動化された固相合成→Depr検出→定量→定量→特徴付け。 図2は、この手順で必要な単量体単位を示す 。それはホスホラミダイト化学（ 図2、左）およびG、A及びC上の求核性環外アミン、 例えばための塩基に不安定な保護基の使用に基づいているという点で、RNAの固相合成は、DNAの場合と同様ですアセチル、ベンゾイル、フェノキシアセチル、 t-ブチルまたはN 、 N-ジメチルホルムアミド（ 図2 、右）。 C2&#39;-OH基（デオキシオリゴヌクレオチドバイオポリマーに欠けている）の存在に起因してRNAにおいて考慮すべきもう一つの側面は、この求核位置の保護および引き続く脱保護のために取り込まなければならない追加の工程である。この点で、ケイ素系保護基は、それらが双直交部分としての可能性のために魅力的な戦略になっている（特定tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS）およびトリイソプロピルシリルオキシメチル（TOM）基を一般的な選択肢（ 図2 、左下）として使用して、フッ素の存在下で脱保護する。 この研究では、標準的なホスホルアミダイト化学を用いるDNA / RNA合成装置で自動合成を行った。装置の製造者の設定には、DNA用のホスホラミダイトの市販バージョンを使用する場合の自動希釈ステップ、またはユーザーが設定した容量で希釈するオプションが含まれる。しかし、我々は、RNAホスホラミダイトの重量を量り、手動で希釈することを決めた。すなわち、1）RNAのカノニカルホスホラミダイトの価格がより高い（場合によっては50倍も高価である）。 2）修飾ホスホラミダイトはしばしば少量で得られる。 3）自動化された希釈ステップ（製造業者によって設定）を使用する際の無駄な物質の量が多い。さらに、我々は、1）市販の固体支持体3 &#39;末端として機能するように保護された核酸塩基を含む核酸分子（ 例えば 、CPG） 2）C2&#39;- O-位置でTBDMS基で保護された市販のホスホラミダイト（カノニカル核酸塩基）。合成工程の詳細なリストは、RNA合成のために調整された工程に関するさらなる説明およびコメントとともに、 図3および表1に示されている。さらに、 図4は、各脱トリチル化工程から放出されたトリチルカチオンを定量する「トリチルモニター」オプションを選択した後の各ステップについて観察された段階的収率を示す。 典型的には、我々の経験では、制限因子は所望の修飾を含むホスホラミダイトを得ることであったことは注目に値する。すなわち、選択された部位に修飾の取り込みを可能にする合成方法の開発である。このレポートでは、対応する合成方法論であるC2&#39;- O-チオフェニルメチル基を確立した修飾ヌクレオチドの組み込み。この群は、サイズが小さく、固相合成に何ら影響を与えない。この群のRNAのオリゴヌクレオチドへの取り込みが構造的および熱力学的パラメーター4と共に報告されているので、修飾されたホスホラミダイトをもたらす有機合成の態様は本明細書に記載されない。 脱保護、精製およびキャラクタリゼーション 環外アミンおよびβ-シアノエチル基の脱保護は、CPG樹脂からの切断と同じ工程で起こる。得られた樹脂をAMAの水溶液の存在下で加熱し、フッ化物イオンの存在下でC2&#39;- O-シリル基を開裂させ、次いでゲルを介して精製するという一般的な条件を適用した電気泳動。これらは、多くの場合、標準的な条件、より穏やかな条件13、14、 例えば 、メタノール/炭酸カリウム（メタノール/ K 2 CO 3）、又はブチルアミンを必要とすることが基本条件またはフッ化物イオンに不安定な変更になってきています。したがって、対応するホスホラミダイト上の異なるセットの保護基が必要である。さらに、本発明者らは、この方法の以前の経験および他の機器の欠如を考慮して、脱保護されたオリゴマーを精製するための好ましい代替物として電気泳動を選択した。しかし、代わりにHPLCを有効な方法として使用することも可能である15 。精製されたオリゴヌクレオチドの特徴付けは、質量分析、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化 - 飛行時間（MALDI-TOF）を介して、我々のグループ16による報告された手順を用いて行った。 構造的特徴付けとその<html>得られた二重鎖の安定性はCD を介して行った。具体的には、CDを用いて、修飾されたRNAおよび修飾されていないRNAの熱変性転移を、バンドの楕円率の低下をca. （負の楕円率を有する）バンドの消失とともに、210nmでのλmaxでの消光を示す。ハイブリダイゼーションの前後のスペクトル比較は、それらの違いを説明し、使用された方法論のバリデーションを提供するために提供される。 CDの使用は、核酸およびアミノ酸17の構造モチーフの決定において広く受け入れられており、したがって、様々な構造および熱力学的パラメーターを決定するためのツールとして使用することができる18 。しかしながら、この技術を熱変性の変化を評価するために用いる多くの例はない。いくつかの場合には、G-quadruplexesを含むDNAに対する熱安定性の決定が含まれる尻=「外部参照」&gt; 19、20、または二本鎖RNAと21のヘアピンです。 このレポートは、非専門家の読者または視聴者に、この種の研究を円滑に開始するための一連のツールを提供する予定です。このエキサイティングな科学分野に関わる他の研究機関の方法論や技術を強化し、比較するのに役立ちます。このレポートの内容は、さまざまな情報源からこのテクノロジーの既存のプロトコルを追加し、各ステップの視覚的な援助の経験を豊かにし、容易にします。

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide, 99+%</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Fluoride&amp;nbsp; 98.0%, ACS grade</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra high purity</td><td>&amp;nbsp;Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide Ultra pure</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous, histological grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2%</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, 99.9%,&amp;nbsp; HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Methylamine 40% in water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5%</td><td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&amp;nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0%</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;,4&amp;rsquo; Triethylamine, 99+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6&amp;rsquo;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for the RNA synthesis:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Phosphoramidite&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Phosphoramidite&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism

固相合成は、様々な分野および異なる研究目的での応用のための一般的な方法論にしてきた核酸、特にDNAまたはRNAのカノニカルおよび修飾ポリマーを得るために使用されてきた。本明細書に記載の手順は、C2 &#39; O位に位置する0個、1個または2個の修飾を含むRNA5&#39; - [CUA CGG AAU CAU] -3 &#39;のドデカマーの合成、精製および特徴づけに焦点を当てている。プローブは、2-チオフェニルメチル基に基づいており、標準的な有機合成によってRNAヌクレオチドに組み込まれ、それぞれのホスホルアミダイトを介して対応するオリゴヌクレオチドに導入される。この報告では、2&#39;- O-メチルアミノ基で修飾された2-チオフェニルメチル官能基化ヌクレオチドと同様に、4つの標準核酸塩基（Uridine（U）、Cytosine（C）、Guanosine（G）、Adenosine（A））を介したホスホラミダイト化学、ポジション;しかし、この方法論は大きなvar何年にもわたって開発されてきた変更の数々。オリゴヌクレオチドは、制御された孔のガラス（CPG）支持体上で合成され、続いて樹脂から切断され、標準的な条件、 すなわちアンモニアとメチルアミン（AMA）、続いてフッ化水素/トリエチルアミン/ N-メチルピロリジノンの混合物の下で脱保護された。対応するオリゴヌクレオチドは、逆相クロマトグラフィー（9-PAK、C 18 -カラム）を介して溶出、脱塩、及び単離に続いて、ポリアクリルアミド電気泳動（20％変性）を介して精製しました。 UV可視（UV-vis）および円二色性（CD）光度分析により、定量化および構造パラメータを評価した。このレポートは、この分野に着手するのに興味がある初心者や専門家のためのリソースとガイドとして役立つことを目指しています。新しい技術と方法論が開発されるにつれて、それは進行中の仕事として役立つことが期待されています。 thi内の方法論とテクニックの記述ホスホラミダイト化学を使用するDNA / RNA合成装置（2013年に改装され購入された）に対応しています。

C2&#39;- O-位に0個、1個または2個の2-チオフェニルメチル修飾を含むRNAドデカマーの合成を、対応する精製および特徴付けとともに記載する。さらに、CDを介して行われた構造解析の詳細な説明も含まれています。 固相合成によってRNAの4つの鎖（相補的配列を有する鎖を含む）を得た後、各オリゴヌクレオチドの300~70...

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Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

この記事では、C2&#39;- O-位置で修飾されたRNAのドデカマーの固相合成、精製、およびキャラクタリゼーションに関する詳細な手順を提供します。 UV-visおよび円二色性光度分析を用いて、構造的側面、 すなわち一本鎖または二本鎖を定量化および特徴づける。

2 &#39;末端を含むRNAのオリゴマーの固相合成のためのプロトコール<em&gt; O</em&gt;チオフェンメチル修飾と環状二色性によるキャラクタリゼーション

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

18.9K ビュー.  University of Colorado Denver. この記事では、C2'- O-位置で修飾されたRNAのドデカマーの固相合成、精製、およびキャラクタリゼーションに関する詳細な手順を提供します。 UV-visおよび円二色性光度分析を用いて、構造的側面、 すなわち一本鎖または二本鎖を定量化および特徴づける。 

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Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

化学

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

遺伝学

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a complementary DNA (cDNA) intermediate. However, such approaches are rarely applied as a de novo RNA sequencing method, but used mainly as a tool that can assist in quality assurance for confirming known sequences of purified single-stranded RNA samples. Recently, we developed&#160;a direct RNA sequencing method by integrating a 2-dimensional mass-retention time hydrophobic end-labeling strategy into MS-based sequencing (2D-HELS MS Seq). This method is capable of accurately sequencing single RNA sequences as well as mixtures containing up to 12 distinct RNA sequences. In addition to the four canonical ribonucleotides (A, C, G, and U), the method has the capacity to sequence RNA oligonucleotides containing modified nucleotides. This is possible because the modified nucleobase either has an intrinsically unique mass that can help in its identification and its location in the RNA sequence, or can be converted into a product with a unique mass. In this study, we have used RNA, incorporating two representative modified nucleotides&#160;(pseudouridine (&#936;) and 5-methylcytosine (m5C)), to illustrate the application of the method for the de novo sequencing of a single RNA oligonucleotide&#160;as well as a mixture of RNA oligonucleotides, each with a different sequence and/or modified nucleotides. The procedures and protocols described here to sequence these model RNAs will be applicable to other short RNA samples (&#60;35 nt) when using a standard high-resolution LC-MS system, and can also be used for&#160;sequence verification of modified therapeutic RNA oligonucleotides.&#160;In the future, with the development of more robust algorithms and with better instruments, this method could allow sequencing of more complex biological samples.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

Here, we describe a detailed protocol for an LC-MS-based sequencing method that can be used as a direct method to sequence short RNA (&#60;35 nt per run) without a cDNA intermediate, and as a general method to sequence different nucleotide modifications in a single study at single-base precision.

2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

rRNA 2'-O-メチル化のDNAzyme依存性分析

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

発生生物学

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers and modulators. While these dynamic states remain hidden to most structural methods, R1&#961; relaxation dispersion (RD) spectroscopy allows the study of conformational dynamics in the micro- to millisecond regime at atomic resolution. The use of 1H as the observed nucleus further expands the time regime covered and gives direct access to hydrogen bonds and base pairing.
The challenging steps in such a study are high-purity and high-yield sample preparation, potentially 13C- and 15N-labeled, as well as setup of experiments and fitting of data to extract population, exchange rate, and secondary structure of the previously invisible state. This protocol provides crucial hands-on steps in sample preparation to ensure the preparation of a suitable RNA sample and setup of 1H R1&#961; experiments with both isotopically labeled and unlabeled RNA samples.

We present a protocol to measure micro- to millisecond dynamics on 13C/15N-labeled and unlabeled RNA with 1H R1&#961; relaxation dispersion nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The focus of this protocol lies in high-purity sample preparation and setup of NMR experiments.

RNAの1H R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

生化学

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

生物学

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

オリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

2 '末端を含むRNAのオリゴマーの固相合成のためのプロトコール

要約

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ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

rRNA 2'-O-メチル化のDNAzyme依存性分析

^RNAの1H _R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

RNAを含むオリゴヌクレオチドを使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

オリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化

2 '末端を含むRNAのオリゴマーの固相合成のためのプロトコール

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一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

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2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

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RNAの1H R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

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^RNAの1H _R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

RNAを含むオリゴヌクレオチドを使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代