Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
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この作品は、(RGT3/13 ・ RG42/15 g. c. に) 教育 (MOE) の層 1 のシンガポール省と萌え層 2 (MOE2013-T2-2-024 と g. c. に MOE2015-T2-1-028) によって支持されました。

ここで報告される作業に基づく特許出願 (パット/179/14/15/PCT) が提出されています。

RNA 二重バインディング PNA オリゴマー (例えば、10 mers) 中型の分子でありこうして示すことができる結合する電気泳動の移動性シフト Rna に同等またはわずかに大きいサイズの (例えば、50 mer またはより小さい)。RNA が PNA よりも著しく大きい場合、RNA に PNA の滴定が限られたゲルの移動性シフトのため機能しません。したがって、ページの非変化試金のため大規模な RNA が切り捨てられます。大規模な RNA の蛍光ラベルの PNA に滴定ゲル40の途中でロード サンプル非変化のアガロースゲル三重鎖形成の監視が可能です。
RNA の一定濃度の非変化ページによる滴定実験のため通常効率的な投稿が無料 RNA と三重のバンドのエチジウム ブロマイドで染色の 1 μ M のラベルの RNA 濃度を使用します。RNA 濃度 0.2 μ M としては RNA 構造31によって十分な場合もあります。ラベル付けされていない RNA 濃度 (0.2 μ M) は 0.2 μ M 程度より大きいこと正確に測定することができるKd値を決定します。他の染色の染料は、染色の効率を高めるために使えます。また、未発表データは、タイトなバインディング イベントを測定する非変化ページ実験で Cy3 色素標識 Rna が使えるをお勧めします。
による 2-アミノプリンは適度蛍光灯のみ、という事実のためにによる 2-アミノプリンの蛍光滴定してKd値 0.2 μ M31以上に近い結合の測定に限られています。蛍光信号53,54,の変化における結合結果する場合蛍光滴定液で比較的タイトなバインドを定量化するための比較的明るい染料 RNA または PNA で付いたことがあります。55。
PNAs の dsRNA バインディングによって RNA の構造を対象とする戦略は、Rna の限られた数のテストされています。シーケンスと塩基組成の異なる二本のバインディング プロパティが異なることが考えられます。1 つは常に TFPNAs の設計のための二重のプリン豊富なストランドを選択可能性があります。どのように連続 q · を理解することが重要C G トリプル、トリプレックスの安定性に影響を与える可能性があります。広範なシーケンスに依存した研究は明らかに TFPNAs の配列依存的結合特性を理解する必要です。
TFPNAs の結合親和性は、長くおよび/または TFPNAs の基盤およびバックボーン用56,57のさらなる変更によってさらに強化できます。ただし、連続二重地域がしばしば成り立たない、中断することがなく 10 以上の連続塩基の非ワトソン Crick 構造によって。TFPNAs を共役 dsRNA 地域に隣接する非ワトソン Crick 構造の認識のための小分子で 1 つ可能性があります。原則として、TFPNA 小分子の共役結合親和性と TFPNA や小さな分子だけに比べて特異性が強化されます。ただし、活用58,59,60,61,62,63,64 リンカーの化学および物理的特性最適化する必要があります。
TFPNAs は ssRNAs と二本、二本に選択的にバインドできますという事実を示唆非常に有用なプローブと RNA 構造力学との相互作用の調節を介して潜在的な治療のリガンドとして TFPNAs を開発することが可能です。タンパク質と代謝産物。低分子、ペプチド、ナノ粒子などの細胞貫通部分の活用やリポソーム56,などの超分子構造との錯形成を通して TFPNAs の細胞内取り込みを促進することがあります。 ,12,17,25,31,41,65,66。さらに蛍光物質や放射性同位元素などのバイオ イメージング タグ TFPNAs の高機能化は、検出、イメージング、および生きている有機体の機能性 RNA の構造のターゲットを促進するかもしれない。

Rna の重要なバイオ マーカーおよび調節における Rna の役割の発見と多様な生物学的プロセス1,2,3の触媒の最近の進歩のための治療上のターゲットとして浮上しています。伝統的に、アンチセンス鎖はワトソン Crick 二重形成3,4,5,6,7,8、を ssRNAs にバインドに使用されています。9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 最近、三重鎖形成性ペプチド核酸 (TFPNAs) は、接合 (図 1)3,28,29Hoogsteen 水素経由で二本にバインドする設計されています。dsRNA 地域は Mrna および Mrna、事前または pri miRNAs3、多く他非コーディング RNAs1,26,27など伝統的なアンチセンス標的 Rna の大部分であります。TFPNAs を使用して三重らせんを形成を通して二本を対象とその構造の特異性のため有利になること、調節不全疾患では、例えば Rna の正常な機能を復元するのに使えない可能性大です。
最近公開された3,28,29,30,31,32,33、Roznersらと私たちの仕事 34,35,36,37,38,39,40,41, 改善の努力を報告強化された関係を持つ二本に向けて変更された TFPNAs の選択的結合。チオ-pseudoisocytosine (L) モノマー30グアニジン変更 5-メチル シトシン (Q) モノマー31など合理的に設計の PNA モノマー (図 2) の合成法を開発しました。さまざまな生化学と生物物理学的評価方法により L と Q 残基を組み込んだ比較的短い PNAs (6-10 残基) が二本でそれぞれ、ワトソン Crick G C と C G の塩基対の認識率が改善を示すことを確認しました。また、L と Q 残基を含む PNAs 未変更 PNAs に比べると、宿主と dsDNA dsRNA の方より選択的バインドを表示しています。Q ベースのグアニジン機能42 HeLa 細胞31を入力する PNAs ができます。
当研究室で合成マニュアルの Boc 化学 PNAs (Boc またはt- Boc の略 tert butyloxycarbony (図 2参照) 固相ペプチド合成方法4。アミンの保護基として Boc と PNA モノマーの合成は、Boc のグループは PNA 単量体結合中に有益であるかもしれないグループを保護する fluorenylmethyloxycarbonyl (fmoc 保護) アミンと比較して立体かさばらず便利なしっかりサポート。Boc のグループは酸に不安定、簡単に削除できます固体支持の 20-50% トリフルオロ酢酸 (TFA) ジクロロ メタン (DCM) で PNA 合成時に。自動ペプチド合成は PNA オリゴマーの合成に用いることができます。ただし、PNA 単量体の 3-5 倍の過剰は、自動ペプチド合成に必要です。手動合成には、大幅に少ない PNA モノマー (2 ~ 3 倍過剰)、各結合カイザー テスト43で容易に監視が必要です。また、多くの自動化されたシンセサイザー Boc 除去ステップ中に腐食性 TFA の使用のため Boc 戦略合成との互換性はありません。
逆相高速液体クロマトグラフィー (クロマトグラフィー) MALDI-TOF の分子量特性評価に続いて、PNA オリゴマーを浄化することが (図 3 と4)30,31. 三重鎖形成を監視するという無料の RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているためにを表示別の移行率 (図 5)30,31ページの非変化を用いて.ラベルは必要ありません RNA 二重と PNA· の両方の効率化後染色が得られるならRNA2三重バンド。比較的少量の試料は、非変性ページ実験に必要です。ただし、読み込み (インキュベーション) バッファーおよび実行バッファー (pH 8.3) できない場合があります同じ 8.3 の比較的高い pH は大きく、トリプレックスを揺るがす可能性がありますので、速度論的に安定したおしゃれに限定されている測定の結果します。
による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度 (約 370 に発光ピークを持つ nm) はローカル構造的な環境変化に敏感とバインド サイト (PNA 近く設立による 2-アミノプリンの残基三重鎖形成の監視に適しています図 6)31. 多く他の染料は目に見える範囲で蛍光性の放出を示すとは異なり 2-アミノプリン標識 RNA が写真漂白なし室内灯に公開できます。実行バッファー pH 8.3 がしばしば必要となるページの実験とは異なりによる 2-アミノプリンの蛍光滴定指定した pH で 1 つのソリューションに結合の測定が可能、測定と比較的弱いの検出可能性があることと速度論的に不安定な平衡のバインディングします。
UV 吸光度検出熱溶融実験許可二重 (図 7)31とトライの熱安定性の測定プレックス30,32,44,45。長さとシーケンスの組成によっておしゃれの融解は、明確な転移を示さないかもしれない。熱力学的パラメーターは、加熱と冷却曲線が重なっている場合に得られるかもしれない。等温滴定熱量測定 (ITC)32; 正確な熱力学的パラメーターを取得します。ただし、比較的大量のサンプルが ITC の一般的に必要です。

<table><tbody><tr><td>Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&lt;span class=&quot;font6&quot;&gt;&amp;Yuml;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font0&quot;&gt;HCl)&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhyride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Unmodified PNA monomers</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisole</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoromethanesulfonic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&amp;reg; 100 RP-18 endcapped (5 &amp;micro;m) LiChroCART&amp;reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA Oligos&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Customized&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td><td>1st Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&amp;nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&amp;nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

Rna の重要なバイオ マーカーおよび治療上のターゲットとして浮上しています。従って、化学プローブや RNA 配列および構造の認識のため治療上の配位子の開発に大きな可能性があります。化学修飾ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーが最近開発されているシーケンス固有の方法で RNA 二重鎖を認識することができます。PNAs は中立的なペプチドのようなバックボーンを持つ化学的に安定しています。PNAs は、その手動 Boc 化学固相ペプチド合成法によるは簡単に比較的合成することができます。PNAs、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-時間飛行 (MALDI-TOF) の分子量特性によって続いて逆相 HPLC により精製しました。非変化のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) 法を容易に三重鎖形成のイメージングを慎重に設計無料 RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているのでショー別の移行率。エチジウム ブロマイド ポスト染色と非変性のページはしばしば結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるための簡単で有益な技術です。通常、複数の RNA のヘアピン構造または単一塩基変異は、PNA のバインディング プロパティ、親和性と特異性のバインドなどの特性評価に使用できます。による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度はローカル構造的な環境変化に敏感な三重鎖形成による 2-アミノプリンの残基の PNA 結合部位付近の監視に適しています。による 2-アミノプリンの蛍光滴定は、一本鎖 Rna (ssRNAs) をバインディング ターゲットの二本鎖 Rna (二本) へ変更された PNAs 性を確認する使用できます。UV 吸光度検出熱溶融実験許可 PNA RNA 二重鎖と PNA· の熱安定性の測定RNA2おしゃれ。ここで合成について述べる、PNA オリゴマーを組み込むの精製残基を変更変更 PNAs によって RNA 二重鎖の認識の生化学的および生物物理学的法を記述します。

逆相高速液体クロマトグラフィーでは、PNA オリゴマーの浄化をことができます。我々 は、高速液体クロマトグラフィー精製 (図 3) の 2 つのラウンドで純粋な PNA オリゴマーを取得できます。MALDI-TOF 分析 (図 4) によって、PNAs の id を確認できます。
非変性のページは結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるため簡単で有益な手法です。私たち通常使用複数の RNA のヘアピン構造や二重単一塩基変異を持つバインディング プロパティ (図 5) を特徴付けるため。非変化ページのデータを図 5に示すように明確に示唆している、Q と L-修飾 PNA C G ペア (図 5B底板) で dsRNA 領域を認識できる (図 5B、トップ C G ペアがないものではないが、パネル)。この特定と強化された認識は、T·、A U、L·G-C、および q ·C G PNA·RNA2基本トリプル (図 1A C D) の形成。1 つまたは複数の遺伝子変異を有する様々 な PNAs も変更された PNA の改良された結合特性を発揮する使えます。インキュベーション バッファーに 2 mM Mg2 +を追加するバインドは影響しませんを示した大幅31。
Q と L 変更の PNA にバインド ターゲット dsRNA 地域 (図 6A, 6 C, 6 D) がいない宿主 (図 6B、6 e、6 f) による 2-アミノプリン蛍光滴定法により実証しました。PNA P3 は 0.8 ± 0.1 μ M のKのd値を持つ 2-アミノプリン ラベル dsRNA にバインドします。370 で蛍光強度 2-アミノプリン ラベル宿主の nm、宿主の PNA P3 結合の欠如を示す、P3 濃度が異なると比較的一定している残る。
PNAs の融解転移 (図 7)、宿主へのバインドがないことを示すない熱 Q 残留 (P2、P3) ショーを含みます。これ立体衝突 Q G ペアのようなワトソン Crick に存在ためです。未変更の PNA P1 と比較して、PNAs P4 と P5 を含む変更 L 残基がない Q 残留、ショーは立体衝突 L G ペアのようなワトソン Crick の存在により対応する RNA PNA デュープレックスの溶解温度を減少しました。UV 吸光度検出熱溶融データも Q と L 残基を含む PNA は宿主にかなりバインドできません表示による 2-アミノプリンの蛍光滴定データと一致している (図 6B、6 e、6 階)。Q ベース ワトソン Crick 様 L G ペア (図 1E と比較してワトソン Crick 様 Q G ペア (図 1F) の形成でより重要な立体衝突があり、L ベースよりもより不安定 Q ベースを組み込むことは).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
図 1: 安定した基本トリプルと不安定な塩基対の構造の化学構造。(A ~ D)主要な溝 PNA·T· の RNA2基本組(A) A U, C+·G-C (B) L·G C (C)、および q ·C G (D)。(E, F)L G (E) と (F) - G の Q の PNA RNA 塩基対のような不安定なワトソン Crick。R の文字は、RNA の糖リン酸塩のバックボーンを表します。水素結合は、黒の破線で示されます。図は参照31から再現します。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
図 2: PNA 単量体の化学構造。4 PNA モノマー (T、C、L、および Q) が表示されます。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
図 3: PNA オリゴマーと RP hplc 精製の化学構造。(A) PNA シーケンス P3 の化学構造。(B、C)原油の PNA P3 のクロマトグラフィー データ (B) PNA P3 を再精製 (C)。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
図 4:精製 PNA P3 の MALDI-TOF スペクトル。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
図 5:RNA のヘアピンと PNA シーケンスおよび非変化のページによるバインディングの評価。(A) RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2)、PNA P3 と、PNA·PNA P3 と rHP2 間に RNA2三重が形成されました。(B) 非変性ページ (12%) は、rHP1 と PNA P3 への rHP2 結合の結果します。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。読み込まれた RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2) は、20 μ L で 1 μ M にあります。左から右への車線で PNA 濃度が 0、0.2、0.4、1、1.6、2、4、10、16、20、28、50 μ M. PNA P3 にバインドされません rHP1 と rHP2 (上部パネル) がバインド (底板)。(C) Kd定量 rHP2 P3 バインディングのため。三重鎖形成 (Y) の割合は、PNA の濃度に対してプロットしました。図は参照31から適応です。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
図 6: PNA P3 バインディングの蛍光滴定法の研究2-アミノプリン標識 Rna。による 2-アミノプリンの残渣は、RNA シーケンスに '2' として指定されます。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。(A)、PNA·P3 と 2-アミノプリン ラベル dsRNA (dsRNA2 2AP) 間に RNA2三重が形成されました。P3 と 2-アミノプリン ラベル宿主 (ssRNA2 2AP) 間に (B) A 仮想 PNA RNA 二重が形成されました。(C、 E)蛍光発光スペクトル 2-アミノプリン標識 RNA 二重 (1 μ M) と宿主 (1 μ M) のそれぞれと様々 な pH 7.5 で P3 濃度。ピークで約 475 nm は PNA の L ベースの弱い蛍光発光によるもの。(D, F)Kによる 2-アミノプリンの蛍光強度のプロットに基づくd定量 (370 で nm) の RNA 二重と宿主、PNA P3 濃度対それぞれ。図は参照31から適応です。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
図 7: 熱溶融性二本鎖 RNA PNA の結果。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM NaH2PO4、pH 7.5 です。すべてのサンプルには、単一座礁させた RNA (ssRNA1) ・ 130 μ。 (A) 単一座礁させた rna (ssRNA1) PNA、PNAs (P1、P2、P3、P4、P5) PNA P3 と平行方向に ssRNA1 間に形成された仮説的な PNA RNA 二重の 5 μ M が含まれています。Q G と L G ペアのようなワトソン Crick の立体の衝突は示されます。異なる PNAs の曲線に (B) 溶融 ssRNA1 へのバインディングします。溶ける温度が融点が遷移曲線の表示されます。図は参照31から適応です。

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Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

今回は合成のためのプロトコル、ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーを組み込むの精製変更残基。PNAs の変更によって RNA 二重鎖の認識の特性の生化学的および生物物理学的方法を説明します。

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

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Genetics

9.4K ビュー.  Nanyang Technological University. 今回は合成のためのプロトコル、ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーを組み込むの精製変更残基。PNAs の変更によって RNA 二重鎖の認識の特性の生化学的および生物物理学的方法を説明します。

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

生化学

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

遺伝学

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

化学

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to control gene expression. These regulatory proteins control gene expression either at the level of DNA (transcription) or at the level of RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, decay, and translation). Identification of regulatory sequences helps understand not only how a gene is switched on or off, but also which downstream genes are regulated by a particular regulatory protein. Here, we describe a one-step approach that allows saturation mutagenesis of a protein binding site in RNA. It involves doping DNA template with non-wild-type nucleotides within the binding site, synthesis of separate RNAs with each phosphorothioate nucleotide, and isolation of the bound fraction following incubation with protein. Interference from non-wild-type nucleotides results in their preferential exclusion from the protein-bound fraction. This is monitored by gel electrophoresis following selective chemical cleavage with iodine of phosphodiester bonds containing phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis or PTM). This single-step saturation mutagenesis approach is applicable to the characterization of any protein binding site in RNA.

Proteins that bind specific RNA sequences play critical roles in gene expression. Detailed characterization of these binding sites is crucial for our understanding of gene regulation. Here, a single-step approach for saturation mutagenesis of protein-binding sites in RNA is described. This approach is relevant for all protein-binding sites in RNA.

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

免疫・感染学

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, and free radicals, are ubiquitous. As a result, RNA undergoes various reactions that include its cleavage, degradation, or modification, leading to biologically relevant species with distinct functions and implications. One example is the oxidation of guanine to 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), which may occur in the presence of reactive oxygen species (ROS). Overall, procedures that characterize such products and transformations are largely valuable to the scientific community. To this end, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry is a widely used method. The present protocol describes how to characterize RNA fragments formed after enzymatic treatment. The chosen model uses a reaction between RNA and the exoribonuclease Xrn-1, where enzymatic digestion is halted at oxidized sites. Two 20-nucleotide long RNA sequences [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] and [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] were obtained via solid-phase synthesis, quantified by UV-vis spectroscopy, and characterized via MALDI-TOF. The obtained strands were then (1) 5&#39;-phosphorylated and characterized via MALDI-TOF; (2) treated with Xrn-1; (3) filtered and desalted; (4) analyzed via MALDI-TOF. This experimental setup led to the unequivocal identification of the fragments associated with the stalling of Xrn-1: [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], and [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. The described experiments were carried out with 200 picomols of RNA (20 pmol used for MALDI analyses); however, lower amounts may result in detectable peaks with spectrometers using laser sources with more power than the one used in this work. Importantly, the described methodology can be generalized and potentially extended to product identification for other processes involving RNA and DNA, and may aid in the characterization/elucidation of other biochemical pathways.

MALDI-TOF was used to characterize fragments obtained from the reactivity between oxidized RNA and the exoribonuclease Xrn-1. The present protocol describes a methodology that can be applied to other processes involving RNA and/or DNA.

MALDI−TOF質量分析法を用いた酵素分解によるRNA断片の同定

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Precision DNAzyme ナノマシンによる識別型RNAおよびDNA分析

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:DNAナノセンサーの進歩 – 分子検出における感度と選択性の課題への対処

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

要約

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この動画の章

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングルステップの特性

調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

MALDI−TOF質量分析法を用いた酵素分解によるRNA断片の同定

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

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一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

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オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

MALDI−TOF質量分析法を用いた酵素分解によるRNA断片の同定

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングルステップの特性