הכנת כתב היד הזה נתמכה באמצעות קרנות הזנק מאוניברסיטת קולורדו דנבר (JMRE). AF רוצה להכיר בתמיכה מענק מחקר ופעילויות יצירתיות (RaCAS, CU Denver). מימון של משרד שירותי מחקר, אוניברסיטת קולורדו דנבר כדי לכסות את הוצאות הפרסום הוא הודה. ברצוננו להודות לחברת המעבדה גב &#39;קסנדרה הרברט ומר יאניק ק&#39; דז&#39;ו על תרומתם בחלק הווידאו.

<ol>
	<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+oligodeoxypyrimidines+on+a+polymer+support.">The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support.</a> Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).</li><li>Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxynucleoside+phosphoramidites-A+new+class+of+key+intermediates+for+deoxypolynucleotides.">Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides.</a> Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).</li><li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+synthesis+machines:+DNA+Chemistry+and+its+uses.">Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses.</a> Science. 230 (4723), 281-285 (1985).</li><li>Nguyen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+Thermal+Stability,+Biophysical+Properties,+and+Molecular+Modeling+of+Oligonucleotides+of+RNA+Containing+2'-O-2-Thiophenylmethyl+Groups.">Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups.</a> J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).</li><li>El-Sagheer, A. H., Brown, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+with+DNA.">Click chemistry with DNA.</a> Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).</li><li>Puffer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluoro+pyrimidines:+labels+to+probe+DNA+and+RNA+secondary+structures+by+1D+19F+NMR+spectroscopy.">5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).</li><li>Wan, W. B., Seth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medicinal+chemistry+of+therapeutic+oligonucleotides.">The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides.</a> J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).</li><li>Zhou, C., Greenberg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+by+histone+radicals+in+nucleosome+core+particles.">DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles.</a> J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-Induced+proton-coupled+electron+transfer+in+cyclic+DNA+miniduplexes.">UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes.</a> J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).</li><li>Anosova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+diversity+of+artificial+genetic+polymers.">The structural diversity of artificial genetic polymers.</a> Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).</li><li>Riml, C., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+5-Hydroxymethylcytidine-+and+5-Hydroxymethyl-uridine-Modified+RNA.">Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA.</a> Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).</li><li>Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+Two+Strategies+for+Mixed-Sequence+Recognition+of+Double-Stranded+DNA:+Pseudocomplementary+Invader+Probes.">Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes.</a> J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).</li><li>Beaucage, S. L., Iyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+oligonucleotides+by+the+phosphoramidite+approach.">Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach.</a> Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).</li><li>Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Sch&#228;rer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene+(dG-AAF)+into+oligonucleotides+using+modified+'ultra-mild'+DNA+synthesis.">Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis.</a> Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+a+very+long+oligoribonucleotide+with+2-cyanoethoxymethyl+(CEM)+as+the+2'-O.-protecting+group:+structural+identification+and+biological+activity+of+a+synthetic+110mer+precursor-microRNA+candidate.">Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate.</a> Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).</li><li>Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties,+thermal+stability+and+functional+impact+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+on+oligonucleotides+of+RNA+-+a+study+of+duplex,+hairpins+and+the+aptamer+for+preQ1+as+models.">Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models.</a> Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).</li><li>Ranjbar, B., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+dichroism+techniques:+Biomolecular+and+nanostructural+analyses+-+A+review.">Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review.</a> Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).</li><li>Mergny, J. -. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraplex+formation+of+a+guanine-containing+nonameric+DNA+fragment.">Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment.</a> Science. 250 (4980), 543-546 (1990).</li><li>Virgilio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine+residues+in+the+thrombin+binding+aptamer:+Investigating+anticoagulant+activity+by+making+a+tiny+chemical+modification.">5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification.</a> CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).</li><li>Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+and+thermal+stability+of+oligonucleotides+of+RNA+containing+7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.">Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.</a> Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).</li><li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. 14, 173-185 (1987).</li><li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNAFold:+software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization.">UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).</li><li>Breslow, R., Huang, D. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+ions+including+Mg2++and+lanthanides+on+the+cleavage+of+ribonucleotides+and+RNA+model+compounds.">Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).</li><li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+ribonuclease-free+environment.">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).</li><li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions.">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li><li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, 45-80 (2010).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הכוונה של כתב היד הזה היא לשמש מדריך לחוקרים בתחום, מתחילים או מומחה, כדי להשיג בהצלחה או לשפר את הסינתזה של oligonucleotides של DNA או RNA. המתודולוגיה המתוארת מתמקדת בשימוש סינתזה שלב מוצק באמצעות סינתיסייזר DNA / RNA אוטומטי באמצעות כימיה phosphoramidite סטנדרטי. הדו&quot;ח מתאר תיאור שלב ...

סינתזה שלב מוצק כדי להשיג oligonucleotides של DNA / RNA הוא כלי רב עוצמה אשר שימש מספר יישומים בתחומים שונים מאז 1970s 1 , 2 , 3 באמצעות אבני הבניין phosphoramidite 4 . דוגמאות להשפעה הרחבה שלה כוללות: השפעתה על תיוג ( באמצעות תגובת כימיה בלחץ) 5 , בדיקה מבנית 6 , וטכנולוגיות אנטיסנס 7 , כמו גם הבהרה של מנגנונים ביולוגיים 8 , 9 , מקור כחומר גנטי 10 , שונה טבעי ו / או שינויים כימיים 11 , 12 , בין רבים אחרים.השינוי שאנו משתמשים כאן מייצג את הצעד הראשון במאמצינו להשיג oligonucleotides RNA המכיליםבדיקות פוטואקטיביות כדי לאפשר שליטה זמנית של המבנה והפונקציה של biopolymer חשוב זה. סינתזה של Dodecamers RNA עם רצפים: 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [AUG AUU CCG UAG] -3&#39; (עמדות קו תחתון מייצגות שילוב של שינוי C2&#39;- O -thiophenylmethyl ) מהווה את המוקד של מחקר זה. רצפים נבחרו כדי לאפשר כימות ומדידה של גדילי רנ&quot;א כמו גדילי יחיד, או כמו מבנים דופלקס המקביל שלהם (שום מבנים משניים אחרים לא חזו יציבות יציבה תרמודינמית). CD שימש כדי לקבוע את הפרמטרים המבניים, כלומר , היווצרות דופלקס ומעברים denaturation תרמית. סִינתֶזָה ההליך הכולל להשגת אלה oligonucleotides מודגם באיור 1 ו עוקב את התהליך בשלבים: אוטומטי שלב מוצק סינתיזה → DeprOtection → טיהור → כימות → אפיון. איור 2 מציג את היחידות המונומריות הנחוצות בהליך זה. הסינתזה מוצק השלב של RNA היא דומה לזה של ה- DNA בכך שהיא מבוססת על כימית phosphoramidite (איור 2, משמאל) את השימוש בקבוצות הגנה-רָפִיף בסיס האמין exocyclic nucleophilic על G, A ו- C, למשל, אצטיל, בנזואיל, phenoxyacetyl, t- בוטיל או N , N- dimethylformamide ( איור 2 , מימין). היבט נוסף שיש להביא בחשבון ב RNA, בשל נוכחות של C2&#39;-OH הקבוצה (חסר bioxymers deoxyoligucleototide), הוא צעד נוסף שיש לשלב את ההגנה, ולאחר מכן deprotection, של עמדה זו נוקלאופילי. מבחינה זו, קבוצות הגנה מבוססות סיליקון הפכו לאסטרטגיה אטרקטיבית בשל הפוטנציאל שלהם כמו moieties biorthogonal (ספציפייםy deprotected בנוכחות פלואוריד), עם -butyldimethylsilyl טרט (TBDMS) ו triisopropylsilyloxymethyl (טום) קבוצות כמו האפשרויות הפופולריות (איור 2, ימין למטה). בעבודה זו, הסינתזה האוטומטית בוצעה על סינתיסייזר DNA / RNA המשתמש בכימיה phosphoramidite סטנדרטי. הגדרות היצרן על המכשיר כוללות צעד דילול אוטומטי בעת שימוש בגרסאות מסחריות של phosphoramidites עבור DNA, או את האפשרות לדלל בכרכים שנקבעו על ידי המשתמש. עם זאת, החלטנו לשקול את phosphoramidite רנ&quot;א לדלל באופן ידני בהתחשב בכך: 1) המחיר של phosphoramidites הקנונית של רנ&quot;א גבוה (עד פי 50 פעמים יקר יותר במקרים מסוימים); 2) phosphoramidites שונה מתקבלים לעתים קרובות בכמויות קטנות; ) 3 כמות החומר המבוזבז בעת שימוש בצעד דילול אוטומטי (שנקבע על ידי היצרן) הוא גדול. בנוסף, השתמשנו: 1) תומך מוצק זמין מסחרית( למשל , CPG) המכיל נוקלאובאז מוגן לתפקד כמו 3-end; ו 2) phosphoramidites מסחריים (nucleobases הקנונית) מוגן עם קבוצת TBDMS ב C2&#39;- O -position. רשימה מפורטת של השלבים סינתזה מסופק באיור 3 ו 1 טבלה , יחד עם תיאור נוסף והערות על צעדים שהותאמו לסינתזה RNA. יתר על כן, איור 4 ממחיש את התשואות בשלבים שנצפו עבור כל צעד לאחר בחירת האפשרות &#39;Trityl צג&#39;, אשר quantitates קטיון trityl שוחרר מכל צעד detritylation. ראוי לציין כי בדרך כלל, מניסיוננו, הגורם המגביל היה קבלת phosphoramidite המכיל את השינוי הרצוי. כלומר, פיתוח מתודולוגיה סינתטית המאפשרת שילוב של שינויים באתרים נבחרים. בדוח זה, אנו מתמקדיםשילוב של נוקליאוטיד שונה שעבורו הקמנו את המתודולוגיה הסינתטית המתאימה, קבוצת C2&#39;- O -thiophenylmethyl. קבוצה זו קטנה בגודלה ואינה משפיעה על סינתזת הפאזה המוצקה בכל צורה שהיא. מאז שילוב של קבוצה זו לתוך oligonucleotides של RNA כבר דיווחו, יחד עם פרמטרים מבניים תרמודינמיים 4 , שום היבטים של סינתזה אורגנית המובילה phosphoramidites שונה יתואר כאן. הגנה, טיהור ואפיון Deprotection של אמינים exocyclic וקבוצות cyanoethyl- K מתרחשת באותו צעד כמו זה של המחשוף שרף CPG. אנו להחיל את התנאים הנפוצים של חימום שרף שהתקבל בנוכחות פתרון מימי של AMA, ואחריו מחשוף של קבוצות C2&#39;- O- silyl בנוכחות יוני פלואוריד, ולאחר מכן טיהור באמצעות ג&#39;לאלקטרופורזה. בעוד אלה הפכו תנאים סטנדרטיים במקרים רבים, שינויים כי הם labile לתנאים בסיסיים או יונים פלואוריד עשוי לדרוש תנאים מתונים 13 , 14 , למשל , מתנול / אשלגן פחמתי (MeOH / K 2 CO 3 ), או בוטילאמין. לפיכך, קבוצה אחרת של הגנה על קבוצות על phosphoramidites המקביל הוא הכרחי. יתר על כן, בחרנו אלקטרופורזה כחלופה מועדפת כדי לטהר את oligomers deprotected בהתחשב הניסיון הקודם שלנו עם שיטה זו וחוסר מכשור אחרים. עם זאת, HPLC יכול לחילופין לשמש שיטה יעילה 15 . אפיון של oligonucleotides מטוהרים בוצע באמצעות ספקטרומטריית מסה, מטריצה ​​בסיוע לייזר desorption / יינון זמן הטיסה (MALDI-TOF), באמצעות הליך דיווח על ידי הקבוצה שלנו 16 . אפיון מבני<html> יציבות מלוא של דופלקסים שהתקבלו בוצעו באמצעות תקליטור. באופן ספציפי, אנו עושים שימוש בתקליטור כדי לקבוע את מעברי denaturation תרמית של oligonucleotides שונה ושונה של RNA על ידי ביצוע הירידה אליפטיות של הלהקה ב CA. 270 ננומטר, כמו גם היעלמות של הלהקה (עם אליפטיות שלילית) עם מקסימום λ ב 210 ננומטר. השוואת ספקטרה לפני ואחרי הכלאה מסופק כדי להמחיש את ההבדלים שלהם ולספק אימות של המתודולוגיה המועסקים. השימוש בתקליטור מקובל באופן נרחב בקביעת מוטיבים מבניים בחומצות גרעין ובאמינואידים 17 , ולכן ניתן להשתמש בהם ככלי לקביעת פרמטרים מבניים ותרמודינמיים שונים 18 ; עם זאת, אין דוגמאות רבות שבו הטכניקה משמשת כדי להעריך מעברים denaturation תרמית. מקרים מסוימים כוללים קביעת יציבות תרמית על דנ&quot;א המכיל G-quadruplexesהתחת = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 או בדופלקסים וסיכות של רנ&quot;א 21 . דוח זה מתכוון לספק את הקורא שאינו מומחה או הצופה עם סט של כלים המאפשרים התחלה חלקה של סוג זה של מחקר. זה ישמש כדי לשפר ולהשוות עם מתודולוגיות וטכניקות במעבדות מחקר אחרים המעורבים בענף זה מרגש של המדע. התוכן בדו&quot;ח זה מוסיף לפרוטוקולים הקיימים של טכנולוגיה זו ממקורות שונים, ומעשיר ומקדם את החוויה בסיוע חזותי לכל צעד.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide, 99+%</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Fluoride&amp;nbsp; 98.0%, ACS grade</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra high purity</td><td>&amp;nbsp;Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide Ultra pure</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous, histological grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2%</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, 99.9%,&amp;nbsp; HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Methylamine 40% in water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5%</td><td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&amp;nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0%</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;,4&amp;rsquo; Triethylamine, 99+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6&amp;rsquo;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for the RNA synthesis:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Phosphoramidite&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Phosphoramidite&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism

סינתזה של שלב מוצק שימשה להשגת פולימרים קנוניים ומשתנים של חומצות גרעין, במיוחד של DNA או RNA, שהפכו אותה למתודולוגיה עממית ליישומים בתחומים שונים ולמטרות מחקר שונות. הנוהל המתואר כאן מתמקד בסינתזה, טיהור, אפיון של dodecamers של RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; המכיל אפס, אחד, או שני שינויים הממוקם ב C2&#39;- O -position. בדיקות מבוססים על קבוצות 2-thiophenylmethyl, משולבים לתוך נוקליאוטידים RNA באמצעות סינתזה אורגנית סטנדרטית הציג לתוך oligonucleotides המקביל באמצעות phosphoramidites שלהם בהתאמה. דו&quot;ח זה עושה שימוש כימית phosphoramidite באמצעות הארבעה nucleobases הקנונית (uridine (U), ציטוזין (C), guanosine (G), אדנוזין (א)), כמו גם 2-thiophenylmethyl נוקלאוטידים פונקציונליים השונים על 2&#39;- O - עמדה; עם זאת, המתודולוגיה היא מקובלת עבור var גדולשינויי ההתפתחות שהתפתחו במשך השנים. את oligonucleotides היו מסונתז על זכוכית מבוקר הנקבוביות (CPG) תמיכה ואחריו מחשוף של שרף deprotection בתנאים סטנדרטיים, כלומר , תערובת של אמוניה מתילאמין (AMA) ואחריו מימן פלואוריד / טריאתילאמין / N-methylpyrrolidinone. Oligonucleotides המקביל היו מטוהרים באמצעות electroporesis polyacrylamide (20% denaturing) ואחריו elution, desalting, ובידוד באמצעות כרומטוגרפיה הפוכה שלב (ספטמבר, פאק, C 18 -Cumnumn). כימות ופרמטרים מבניים הוערכו באמצעות ניתוח אולטרה-סגול גלוי (UV-V) ו- Dycroism (CD), בהתאמה. דו&quot;ח זה נועד לשמש משאב ומדריך לחוקרים מתחילים ומבקשים המעוניינים לצאת לתחום זה. הוא צפוי לשמש עבודה ב-התקדמות כמו טכנולוגיות מתודולוגיות חדשות מפותחות. תיאור המתודולוגיות והטכניקות שבתוךשל מסמך המתאים DNA / RNA סינתיסייזר (שופץ ונרכש בשנת 2013) המשתמשת כימיה phosphoramidite.

הסינתזה של DNAecamers RNA המכיל אפס, אחד, או שני 2-thiophenylmethyl שינויים ב C2&#39;- O- אופוזיציה מתואר יחד עם טיהור המקביל שלו אפיון. כמו כן, נכלל תיאור מפורט של הניתוח המבני שבוצע באמצעות התקליטור. ארבעת גד?...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism at JoVE

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

מאמר זה מספק הליך מפורט על סינתזה שלב מוצק, טיהור, אפיון של dodecamers של רנ&quot;א שונה ב C2&#39;- O -position. UV- מול וניתוח מעגלי דיכרואי פוטומטרי משמשים לכמת ולאפיין היבטים מבניים, כלומר , גדילים בודדים או פעמיים גדילים.

Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ&quot;א המכיל 2 &#39;<em&gt; הו</em&gt; שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

18.9K Views.  University of Colorado Denver.  מאמר זה מספק הליך מפורט על סינתזה שלב מוצק, טיהור, אפיון של dodecamers של רנ"א שונה ב C2'- O -position. UV- מול וניתוח מעגלי דיכרואי פוטומטרי משמשים לכמת ולאפיין היבטים מבניים, כלומר , גדילים בודדים או פעמיים גדילים. 

Video: Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Genetics

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a complementary DNA (cDNA) intermediate. However, such approaches are rarely applied as a de novo RNA sequencing method, but used mainly as a tool that can assist in quality assurance for confirming known sequences of purified single-stranded RNA samples. Recently, we developed&#160;a direct RNA sequencing method by integrating a 2-dimensional mass-retention time hydrophobic end-labeling strategy into MS-based sequencing (2D-HELS MS Seq). This method is capable of accurately sequencing single RNA sequences as well as mixtures containing up to 12 distinct RNA sequences. In addition to the four canonical ribonucleotides (A, C, G, and U), the method has the capacity to sequence RNA oligonucleotides containing modified nucleotides. This is possible because the modified nucleobase either has an intrinsically unique mass that can help in its identification and its location in the RNA sequence, or can be converted into a product with a unique mass. In this study, we have used RNA, incorporating two representative modified nucleotides&#160;(pseudouridine (&#936;) and 5-methylcytosine (m5C)), to illustrate the application of the method for the de novo sequencing of a single RNA oligonucleotide&#160;as well as a mixture of RNA oligonucleotides, each with a different sequence and/or modified nucleotides. The procedures and protocols described here to sequence these model RNAs will be applicable to other short RNA samples (&#60;35 nt) when using a standard high-resolution LC-MS system, and can also be used for&#160;sequence verification of modified therapeutic RNA oligonucleotides.&#160;In the future, with the development of more robust algorithms and with better instruments, this method could allow sequencing of more complex biological samples.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

Here, we describe a detailed protocol for an LC-MS-based sequencing method that can be used as a direct method to sequence short RNA (&#60;35 nt per run) without a cDNA intermediate, and as a general method to sequence different nucleotide modifications in a single study at single-base precision.

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

Developmental Biology

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers and modulators. While these dynamic states remain hidden to most structural methods, R1&#961; relaxation dispersion (RD) spectroscopy allows the study of conformational dynamics in the micro- to millisecond regime at atomic resolution. The use of 1H as the observed nucleus further expands the time regime covered and gives direct access to hydrogen bonds and base pairing.
The challenging steps in such a study are high-purity and high-yield sample preparation, potentially 13C- and 15N-labeled, as well as setup of experiments and fitting of data to extract population, exchange rate, and secondary structure of the previously invisible state. This protocol provides crucial hands-on steps in sample preparation to ensure the preparation of a suitable RNA sample and setup of 1H R1&#961; experiments with both isotopically labeled and unlabeled RNA samples.

We present a protocol to measure micro- to millisecond dynamics on 13C/15N-labeled and unlabeled RNA with 1H R1&#961; relaxation dispersion nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The focus of this protocol lies in high-purity sample preparation and setup of NMR experiments.

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Biochemistry

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Biology

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ"א המכיל 2 '

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת ¹H R_1ρ הרפיה ניסויים של RNA

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים