本プロトコルは、RNA分子における確認交換を調べるプロトンR1rho緩和分散測定のためのRNAサンプル調製およびNMR設定について説明する。陽子がプローブされるため、この方法は同位体標識を必要とせず、シフトされたベースペアリングなどの構造的特徴に直接アクセスできます。ピペットは、サンプルが別の方法で製造された場合でも、R1rho緩和分散を測定することができるという意味で非常にモジュラーです。
まず、プラスミドサンプルを調製し、テキスト原稿に記載されているようにインビトロ転写および切断反応を設定します。反応を摂氏37度で1時間インキュベートします。その後、サンプルの1マイクロリットルを10倍の負荷溶液で希釈します。
そして、変性ページゲル上の1マイクロリットルを実行します。切断反応が成功した場合は、目的のボリュームに反応をスケールし、一晩実行します。次に、別の変性PAGEゲルを実行し、切断反応が完了したかどうかを評価します。
不完全な切断の場合は、反応液を450ワットの従来のマイクロ波で15秒間加熱します。その後、溶液を摂氏37度まで40分間ゆっくりと冷却し、RNAと切断ガイドを再膜します。そして、新しい沈殿物の形成に注意してください。
さらに無機のパイロホスファターゼとRNase H.Incubate摂氏37度で1〜3時間の反応を加えます。次に、変性PAGEで切断反応の完了を確認する。RNase H切断反応が完了したら、EDTAを50ミリモル最終濃度に添加して反応を焼き付ける。
そして、徹底的に渦。0.2ミクロンのシリンジフィルターを使用して溶液をフィルター処理します。そして、浄化のためにHPLCシステムに注入可能な容積に溶液を濃縮する。
濃縮および精製サンプルをNMRチューブに加える前に、豊富な水で洗い流してチューブを洗浄してください。次いで、RNase除染試薬、水、および95%エタノールを除いた。最後の水ですすった後、乾燥させておきます。
プランジャーを水で洗い流し、リントフリーワイプを使用してRNase除染試薬と95%エタノールで洗浄します。チューブとプランジャーを乾燥させた後、NMRサンプルに10%D2Oを加えます。大きなピペットチップを使用してRNAサンプルをNMRチューブに移し、チューブ壁の側面に沿って流します。
気泡を取り除くために速いねじれ運動でそれを押し下げてチューブにプランジャーを挿入し、新しい気泡を作成せずにゆっくりとプランジャーを引き上げます。そして、パラフィンワックスフィルムでそれを修正します。RNA 割り当てのために完全に標識された RNA サンプルに使用される芳香族陽子炭素 HSQC データセットに基づいて、新しいデータセットを作成します。
一般的なパラメータと RD 固有のパラメータを設定します。次に、テスト用にプロトンスピンロックパワーを1.2キロヘルツに設定します。1 つのエントリ、0 ミリ秒のテスト vd リストを生成し、TDF1 を 1 に設定し、D30 を更新してテスト スペクトラムを実行します。
テスト vd リストを設定した後、D30 と TDF1 を更新します。そして、異なるスピンロックの長さのためにピークの強度をプロットします。元のピークの強度が 3 分の 1 に減少するスピン ロックの長さを識別します。
テストの実行結果から、実験で使用する最終的な vd リストを作成します。スキャン数を選択して、リストの最も弱いピークの信号対ノイズ比が少なくとも10になるようにします。タンデム転写物のいくつかの切断反応の結果をここに示す。
20ヌクレオチド標的RNAを、正常な反応で生成した。失敗した反応は、サンプルの不完全で失敗した切断をもたらした。RNAサンプルのHPLC注入は、38分で純粋な標的RNAのピークを明らかにした。
より長く、より短い製品は、関心のピークから十分に分離されていました。RNAヘアピンの分析は、観察されたイミノ陽子の数が二次構造シミュレーションから予想されるイミノ陽子の数と一致することを示した。RNAの芳香共鳴のプロトン炭素HSQCスペクトルは、フォールディング後に4つのシグナルを示した。
そして折る前に3つの信号だけ。2つの異なるH8原子および2つの異なる合成RNAヘアピンについて得られた共鳴曲線の代表において、G6H8は確認交換を経験する。A4H8はしませんが。
G6H8では、色付きのスピンロック力を選択し、オフ共鳴データを記録した。交換が遅いCG構成体では、R1rho行値対オフセットプロットは、すでに微小な曲線の非対称性を示し、化学シフト差δΩの兆候を示した。R2 と REX プロットでは、R1 寄与が除去される場合に、このことがさらに明らかになります。
一方、GC構築物は交換が速く、R1rho値対オフセットプロットは、R2とREXプロットでもデルタオメガの抽出があまり明白にならないほど広い曲線を示した。RNAのダイナミクスが解明されると、状態を特徴づけ、閉じ込めることができます。これらの閉じ込められた状態は、例えば、生物学的アッセイで試験することができる。
この方法により、活性マイクロRNA miRNA複合体における機能的で関連する塩基対合シフト、リボソームRNAにおけるループ再配列、および一塩基膨らみの塩基対安定性を観察することができます。
