Name: a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
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CACW wird von einem Doktorand des Medical Research Council unterstützt. GMF wird teilweise von einem Medical Research Council New Investigator Award (MR / N000609 / 1) und einem Tenovus Scotland Forschungsstipendium unterstützt.

1. Sortierung von kleinen Molekül-Kinase-Inhibitor-Bibliotheken <ol><li> Sortierung von Inhibitorbibliotheken aus öffentlich zugänglichen Kinase-Inhibitor-Sammlungen, zB Library of Integrated Network-based Cellular Signatures (LINCS) von der Harvard Medical School, eine gezielte Sammlung von 228 potenten und selektiven Kinase-Inhibitoren (http://lincs.hms.harvard.edu) , Und das Protein-Kinase-Inhibitor-Set (PKIS), eine 376 zusammengesetzte Sammlung, die von Industrieforschern zusammengestellt wurde (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativ können Sie eine maßgeschneiderte Kinase-Inhibitor-Kollektion aus handelsüblichen Verbindungen zusammensetzen. HINWEIS: In unserem Labor haben wir eine Sammlung von 72 potenten und selektiven Werkzeugkinase-Inhibitoren zusammengestellt, die 51 primäre Zielkinasen abdecken, die alle aus kommerziellen Quellen verfügbar sind. </li><li> Zusammensetzen von Kinase-Inhibitoren in 96-Well-Platten für eine optimale Hochdurchsatzverarbeitung bei mehreren Konzentrationen (Einsatz 1, 0,1 aNd 0,01 mM). In jede Plattenkontakt-Vertiefungen, die nur DMSO enthalten, und Referenzkontrollinhibitoren PD173074 (FGFRi) und Ruxolitinib (JAKi), die bekanntermaßen naive und grundierte pluripotenten Zustände fördern, enthalten sind. Annotieren Sie in einer Tabellenkalkulation oder einer ähnlichen Software. </li></ol> 2. mESC-Kulturbedingungen und -verfahren für die Screen-Vorbereitung <ol><li> 0,1 g-Gelatine-beschichtete 10-cm-Schalen zugeben, indem man 5 ml 0,1% (w / v) Gelatine zu 10 cm-Platten hinzufügt und bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert. Gelatine anziehen und 2 Minuten trocknen lassen. </li><li> Kultur jeder Standard-MESC-Linie bei 37 ° C 5% CO 2 auf 0,1% mit Gelatine beschichteten 10 cm-Schalen in Standard-MESC-Medien (siehe Materialtabelle ) mit 100 ng / mL GST-LIF, 10% Fetal-Kalbs Serum und 5% Knockout Serum Ersatz. Ersetzen Sie Medien jeden Tag und Durchgang mESCs bei etwa 80% Konfluenz jeden zweiten Tag bei einer Verdünnung von 1: 5-1: 10. </li><li> Zum Durchgang von MESCs, Absaugen von Medien und Waschen mit 5 ml OF Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Platte. </li><li> Füge 1 ml Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin, 0,02% EDTA) pro Platte von mESCs hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Restenzen Sie die trypsinisierten Zellen in 4 ml mESC-Medien und zentrifugieren Sie bei 1200 U / min für 5 min. </li><li> Das Pellet in 5 ml MESC-Medien sorgfältig resuspendieren, nach oben und unten pipettieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. </li><li> Zählzellen durch Kombinieren einer 10 &amp; mgr; l Zellsuspension und 10 &amp; mgr; l Trypan Blue (0,4%). In eine Zellzählkammer stellen oder ein Hämocytometer und Lichtmikroskop verwenden. </li><li> Samen 3 x 10 3 mESCs in 0,1% gelatinebeschichtete 96-Well-Platten, Endvolumen 100 μl Medium, unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. </li><li> Die Kinase-Inhibitoren bei 1: 100 Verdünnung (1 &amp; mgr; l Inhibitor zu 100 &amp; mgr; l Medium) unter Verwendung einer Mehrkanalpipette auftragen. Sanftes Pipettieren von Medikamenten, um Inhibitor und Zellsuspension zu mischen, dann lassen sich die Zellen in einer Gewebekulturhaube für 1 h absetzen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleistenSs die Überzugsfläche. Kulturzellen für 48 Stunden ohne Medienwechsel. HINWEIS: Stammplatten von 1 / 0,1 / 0,01 mM ergeben eine endgültige Inhibitorkonzentration von 10/1 / 0,1 μM. Empfiehlt es sich, den Bildschirm bei einer Endkonzentration von 1 μM zu starten, um eine wirksame Hemmung der primären Zielkinasen zu gewährleisten und gleichzeitig die Off-Target-Effekte zu minimieren. </li></ol> 3. Kinase Inhibitor Screening Analyse <ol><li> Waschen Sie 96 gut mESC Platten in 200 μL PBS mit Mehrkanal-Aspirator und Pipetten. </li><li> Zellextrakte in 150 μl Lysepuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0,5% Natriumdeoxycholat (w / v), 10 mM β-Glycerophosphat , 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4 , komplette Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten). </li><li> Klären Sie die Extrakte durch Zentrifugation bei 1.500 xg für 30 min in V-Boden-96-Well-Platten. </li><li> 100 μl Überstände auf ein Nitrocel immobilisierenLymphmembran unter Verwendung eines 96-Well-Vakuum-Punkt-Blot-Verteilers. </li><li> Trocknen Sie die Membran und Fleck mit 40 ml Ponceau S, um eine gleichmäßige Übertragung zu gewährleisten. </li><li> Waschmembran mit TBST und Block in TBST / 3% (w / v) Milch. </li><li> Inkubieren in Nanog- und Dnmt3b-Antikörpern bei einer Verdünnung von 1: 1000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) Milchpulver über Nacht. </li><li> Waschmembranen in 3 x 10 min in TBST waschen und in 30 ml Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1: 10.000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) Milch inkubieren. </li><li> Entwickeln Sie mit einem digitalen Immunoblotting-Imaging-System. HINWEIS: Wenn möglich, verwenden Sie quantitative Fluoreszenz-Immunoblotting, um Nanog und Dnmt3b zu erkennen. Allerdings ist das Hintergrundsignal für Dnmt3b durch Fluoreszenz-Immunoblotting zu hoch. Daher werden 800 nm Fluoreszenz-Anti-Kaninchen (Nanog) und Anti-Maus-HRP (Dnmt3b) sekundäre Antikörper verwendet. </li></ol> 4. Analyse der Screen-Daten und Validierung von Inhibitoren als Bona Fide Pluripotency Regulatoren <p class="jove_content"&gt; HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, um sicherzustellen, dass nur bona fide Pluripotenzmodulatoren identifiziert werden. Es ist entscheidend für Triage-Inhibitoren, die sowohl auf Nanog: Dnmt3b-Verhältnis als auch auf Gesamtsignal basieren, um sicherzustellen, dass Kinase-Inhibitoren, die das MESC-Überleben negativ beeinflussen, nicht für eine weitere Analyse ausgewählt werden. <ol><li> Quantifizieren Sie Nanog- und Dnmt3b-Signal mit Hilfe von Immunoblotting-Analyse-Software und importieren Sie Werte in eine Tabellenkalkulation oder ähnliche Software. Berechnen Sie das Nanog: Dnmt3b-Verhältnis für alle Proben im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Außerdem bestimmen Sie das gesamte Nanog- und das Dnmt3b-Signal, um sicherzustellen, dass Kinase-Inhibitoren das Nanog: Dnmt3b-Verhältnis nicht beeinflussen, indem sie die Lebensdauer von mESC verändern. </li><li> Verwenden Sie Ranglisten-Nanog: Dnmt3b-Verhältnisse, um Inhibitoren zu identifizieren, die naive Pluripotenz fördern (Nanog: Dnmt3b-Verhältnis höher als Kontrolle) und grundierte Pluripotenz (Nanog: Dnmt3b-Verhältnis niedriger als Kontrolle). Setzen Sie den Cut-off bei 2x Abweichung von den Steuerwerten und filtern Sie Kinase-Inhibitoren aus, die ein Gesamt-Nanog + Dnmt3b-Signal erzeugen50% des DMSO-Kontrollwertes, um eine hohe Vertrauensliste von Kinase-Inhibitoren zu erzeugen, die das naive (hohe Nanog: Dnmt3b-Verhältnis) und das geplante (niedrige Nanog: Dnmt3b-Verhältnis) pluripotenten Zustände stabilisieren. </li><li> Validieren von Kinase-Inhibitoren durch Samen von mESCs bei 2 x 10 5 Zellen pro 6-Well in 2-ml-Medien und Zugabe von Kinase-Inhibitoren bei 1 μM für 48 h, ohne Medienwechsel. </li><li> Lyse mESCs in Lysepuffer und analysieren Nanog- und Dnmt3b-Expression durch konventionelles SDS-PAGE-Immunoblotting. </li><li> Weiterhin validieren Sie Treffer durch SDS-PAGE-Immunoblotting für naive Pluripotenzmarker Klf2 und Klf4 und Oct4, um sicherzustellen, dass die Pluripotenz nach 48 h Inhibitorbehandlung aufrechterhalten wird. </li></ol>

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	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte aus dieser Studie.

Hier zeigen wir eine weit verbreitete Methodik, um die Rolle der Kinase-Signalwege bei der Regulierung des naiv-basierten pluripotenten Übergangs zu untersuchen. Hierbei handelt es sich um eine zentrale Frage im ESC-Bereich. Obwohl Hochdurchsatz-Genomik- und Transkriptomikansätze routinemäßig zur Identifizierung von Schlüssel-Transkriptionsregulatoren naiver und grundierter pluripotenter Zustände verwendet werden, hat sich die Aufklärung von Pluripotenz-Signalisierungsnetzwerken als herausfordernd erwiesen. Wir stellen nun eine flexible Strategie zur Verfügung, die chemische Inhibitoren einsetzt, um Kinasen zu identifizieren, die den naiv-basierten pluripotenten Übergang in mESCs kontrollieren. Dies beruht auf einfachen Geräten, Reagenzien und Materialien, die für die meisten Laboratorien zur Verfügung stehen, die Zellsignalisierung und ESC-Biologie untersuchen. Kritisch für den Erfolg dieser Plattform ist unsere Entwicklung eines robusten Assays, um den Übergang zwischen naiven und grundierten pluripotenten Zuständen zu quantifizieren. Die Etablierung dieses Assays erforderte signifikante iterative Modifikationen an ZellplattDichte, Zeit der Inhibitor-Inkubation und Immunoblotting-Bedingungen. Kleine Molekülansätze gewinnen Traktion für rationellen Einsatz in therapeutischen ESC-Anwendungen 15 , 16 . Eine wesentliche Stärke des kleinen Molekülscreens ist, dass Werkzeugverbindungen für eine effiziente zelluläre Aufnahme entworfen und / oder modifiziert werden. Die Transfektionseffizienz ist nicht beschränkend, und die Verwendung von gefährlichen Abgabesystemen wie Lentivirus ist nicht erforderlich. Darüber hinaus hemmen Inhibitoren häufig mehrere Isoformen innerhalb einer Kinase-Familie ( z. B. Fgfr1-4, Jak1-3), die eine funktionelle Redundanz überwindet, die genetische / genomische Interferenztechniken wie RNAi und CRISPR / Cas9 behindert. Da stärkere und selektive Werkzeugverbindungen sowohl aus akademischen als auch pharmazeutischen Wirkstoffforschungsprogrammen zur Verfügung stehen, werden unterschätzte und schlecht verstandene Kinasen an die Spitze der ESC-Forschung gelegt. Wir schlagen daher vor, dass diese hoch-thRoughput Screening-Ansatz eröffnet neue Wege der Forschung in Kern-ESC Regulierungsnetzwerke. Eine geringfügige Einschränkung dieser Technologie ist, dass selbst die stärksten und selektivsten Molekülinhibitoren in vivo mehrere nicht verwandte Kinasen einspritzen und hemmen. Jedoch erlauben zunehmend umfassende Kinase-Inhibitor-Profiling-Daten, dass funktionelle Ziele von Kinase-Inhibitoren leicht identifiziert werden können (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -Inhibitoren). Schließlich kann grundsätzlich unsere Plattform angewendet werden, um jeden kleinen Molekülsammel- und / oder zellulären Assay abzufragen, für den qualitativ hochwertige Immunoblotting-Antikörper verfügbar sind. Dies ermöglicht die Untersuchung mehrerer regulatorischer Systeme in der Pluripotenzregulation und erleichtert die Identifizierung von kleinen Molekülinhibitoren, die verschiedene zelluläre Prozesse modifizieren. Speziell sehen wir die Anwendung von aufkommenden kleinen Molekülsammlungen wie dem EpigenTic-Sonden, die vom Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) entwickelt wurden, haben das Potenzial, weitere neuartige Regulatoren von pluripotenten Übergängen aufzudecken.

Embryonale Stammzellen (ESCs) haben die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern oder in jeden Zelltyp im erwachsenen Körper zu differenzieren, ein Phänomen, das als Pluripotenz bekannt ist. Der jüngste Beweis deutet darauf hin, dass entwicklungsbedingte pluripotenten Zustände existieren, die als &quot;naive&quot; und &quot;grundierte&quot; Pluripotenz bezeichnet werden. Naive ESCs repräsentieren einen Entwicklungszustand ähnlich dem, der im Präimplantationsembryo gefunden wurde 3 . Im Gegensatz dazu sind grundierte pluripotenten ESCs bereit, Pluralipotenz zu verlassen und in spezialisierte embryonische Linien 4 , 5 zu differenzieren. Naive und grundierte pluripotenten Zustände sind durch unterschiedliche Genregulationsnetze gekennzeichnet. Naive Pluripotenz ist durch die Expression von Schlüsselpluripotenz-Transkriptionsfaktoren wie Nanog, Krueppel-artigen Transkriptionsfaktoren (Klfs), Rex1 2 und Esrrb charakterisiert <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6 Bei Maus-ESCs (mESCs) ist die grundierte Pluripotenz durch eine reduzierte Expression von naiven Markern und einer spezifischen Genexpressions-Signatur charakterisiert, die die de novo DNA-Methyltransferase Dnmt3b 7 enthält . In vivo exprimieren die grundierten pluripotenten postimplantation epiblaststammzellen (EpiSCs) 4 , 5 zusätzlich den Epiblastmarker Fgf5 und Marker der Abstammungsgrundierung wie Brachyury 8 . MESCs stellen ein tragbares Modell zur Verfügung, um Mechanismen zu untersuchen, die naiv-grundierte pluripotenten Übergänge in vitro kontrollieren. Bei der Kultivierung in Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und fötalem Rinderserum (FBS) unterliegen mESCs einem dynamischen Übergang zwischen naiven und grundierten pluripotenten Zuständen 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3-Signalisierungsfunktionen zur Förderung eines naiven Genregulationsnetzes 11 </Sup&gt;, während die autokrine Signalisierung über den Fibroblastenwachstumsfaktor 4 (Fgf4) Erk1 / 2-Weg den Übergang zum grundierten Zustand 12 überträgt. Allerdings bleibt es eine Herausforderung, die Rolle der Proteinkinasen bei der Festlegung unterschiedlicher pluripotenter Zustände systematisch zu bewerten. Hier beschreiben wir eine quantitative und skalierbare Plattform, mit der gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchgeführt werden können. Wir verwenden einfache mESC-Kulturbedingungen und Standardreagenzien, Materialien und Ausrüstung, um Kinase-Inhibitoren mit bisher unbekannter Fähigkeit zur Stabilisierung naiver Pluripotenz aufzudecken und zu validieren. Darüber hinaus diskutieren wir potenzielle erweiterte Anwendungen für diese Technologie, einschließlich für das Screening von anderen kleinen Molekülsammlungen wie auftauchende Inhibitorbibliotheken, die epigenetische Regulatoren ansprechen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;mESC media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESCs</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Final: 2 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Final: 50 U/ml</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td><td>MRC-PPU reagents and services</td><td></td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Thermo</td><td>PMC9484</td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Final: 1 mM</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Final: 5%</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher</td><td>10703464</td><td>Final: 10%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TC materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo</td><td>25300054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>Thermo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 well plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lysis Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyrophosphate</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Sigma</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Milk Powder</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Western Blotting&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &amp;micor;M&amp;nbsp; Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Laboratory Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I System</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc imager</td><td>BioRad</td><td>1708280&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Imager</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Nanog</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

Embryonale Stammzellen (ESCs) können sich in alle Zelltypen selbst erneuern oder differenzieren, ein Phänomen, das als Pluripotenz bekannt ist. Es wurden ausgeprägte pluripotenten Zustände beschrieben, die als &quot;naive&quot; und &quot;grundierte&quot; Pluripotenz bezeichnet werden. Die Mechanismen, die den naiv-vorbereiteten Übergang kontrollieren, sind schlecht verstanden. Insbesondere bleiben wir schlecht über Proteinkinasen informiert, die naive und grundierte pluripotenten Zustände angeben, trotz der zunehmenden Verfügbarkeit von hochwertigen Werkzeugverbindungen zur Sonden-Kinase-Funktion. Hier beschreiben wir eine skalierbare Plattform, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs in Maus-ESCs durchzuführen. Dieser Ansatz nutzt einfache Zellkulturbedingungen und Standardreagenzien, Materialien und Geräte, um Kinase-Inhibitoren mit bisher nicht geschätzten Effekten auf Pluripotenz aufzudecken und zu validieren. Wir diskutieren potenzielle Anwendungen für diese Technologie, einschließlich Screening von anderen kleinen MolekülSammlungen wie zunehmend anspruchsvolle Kinase-Inhibitoren und auftauchende Bibliotheken epigenetischer Werkzeugverbindungen.

Mit dem hier vorgestellten Verfahren (Abbildung 1 ) werden die LINCS-Bibliothek von 228 potenten und selektiven Kinase-Inhibitoren zur Identifizierung von MESC-Pluripotenzen untersucht. Die Bibliothek wird in einer Konzentration von 0,1 mM für eine 1: 100-Verdünnung und endgültige Siebkonzentration von 1 &amp; mgr; M in mESCs hergestellt. 48 h später wurden MESCs lysiert und Extrakte wurden für die quantitative Dot-Blot-Analyse der Nanog- und Dnmt3b-Expression vorbereitet (Abbildung 2 , oben). Ergebnisse aus anderen Screening-Konzentrationen sind hier nicht zur Kürze dargestellt. Nanog: Dnmt3b-Verhältnis wird für jeden Kinase-Inhibitor bestimmt und die Verbindungen werden eingestuft und ein 2x-Cut-off angewendet (Abbildung 2 , unten). Das Gesamt-Nanog- und Dnmt3b-Signal relativ zur Kontrolle wird auf die Inhibitor-Rangliste überlagert und einem 0,5-fachen Cut-off unterworfen, um ein Triaging von Inhibitoren zu ermöglichen, die eine signifikante MESC-Toxizität aufweisen. Wählen Sie Kinase-Inhibitoren, die die naive sta stabilisierenTe werden mit konventioneller Nanog / Dnmt3b-Immunoblotting validiert (Abbildung 3 ). Die primären Kinase-Targets dieser Inhibitoren sind in Tabelle 1 dargestellt. Wir zeigen auch die Anwendbarkeit dieses Bildschirms, um Inhibitoren zu identifizieren, die den grundierten Zustand stabilisieren 14 . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow zum Screening von Kinase-Inhibitoren, die den naiv-primierten Übergang modulieren MESC wurden mit einer 228-Verbindungs-Kinase-Inhibitor-Bibliothek in einer Endkonzentration von 1 &amp; mgr; M behandelt. Lysate wurden hergestellt und auf Nitrozellulosemembranen zur Immuno-Dot-Blot-Analyse transferiert und Nanog- und Dnmt3b-Spiegel bestimmt (Abbildung von Williams et al., 14 ). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um al</a><html> Arger Version dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Abbildung 2: Naive-grundierte Pluripotenz-Screen-Analyse und Inhibitor-Identifizierung. (Top) Repräsentative Nanog- und Dnmt3b-Immuno-Dot-Blot-Bilder. (Bottom) Nanog- und Dnmt3b-Werte für jeden Kinase-Inhibitor wurden relativ zu der DMSO-Kontrolle bestimmt, und Nanog: Dnmt3b-Verhältnisse und insgesamt relatives Nanog + Dnmt3b-Signal bestimmt und Inhibitoren im Vergleich zur DMSO-Kontrolle eingestuft. Inhibitoren gefunden, um Nanog zu ändern: Dnmt3b-Verhältnis über eine 2-fache Schwelle oberhalb oder unterhalb der DMSO-Kontrolle wurden als Treiber der naiven oder grundierten Pluripotenz identifiziert. Eine Schwelle von 2x unterhalb der DMSO-Kontrolle wurde auf Triage-Inhibitoren eingestellt, die das Überleben von MESC beeinträchtigen. Für die weitere Validierung ausgewählte Inhibitoren werden hervorgehoben. (Abbildung von Williams et al., 14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Abbildung 3: Validierung ausgewählter Trefferverbindungen identifiziert MESCs wurden entweder mit 1 &amp; mgr; M AZD4547 (einem selektiven FGFR-Inhibitor) oder den angegebenen Inhibitoren, die aus dem Screen in Fig. 2 identifiziert wurden, behandelt. Nanog: Dnmt3b-Spiegel, bestimmt durch Standard-SDS-PAGE und Immunoblot-Analyse. Numerische Werte von relativen Nanog: Dnmt3b und Nanog + Dnmt3b sind in der nachstehenden Tabelle angegeben und Inhibitoren, die den naiven pluripotenten Zustand, der grün hervorgehoben ist, stabilisieren. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Verbindung </td><td colspan="2"> Primäre Ziele </td><td> Andere Ziele </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> Src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR und TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Ausgewählte Hit-Verbindungen und ihre primäre Kinase-Ziel (e).

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A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Hier stellen wir ein quantitatives und skalierbares Protokoll vor, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchzuführen.

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K Aufrufe.  University of Dundee.  Hier stellen wir ein quantitatives und skalierbares Protokoll vor, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchzuführen. 

Serie: A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Biochemie

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Biologie

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identifikation von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor Signalgebung über das Screening von chemischen Inhibitors Bibliotheken

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Immunologie und Infektion

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...