CACW נתמך על ידי דוקטורט המועצה למחקר רפואי PhD. GMF נתמך בחלקו על ידי מחקר רפואי המועצה פרס חדש החוקר (MR / N000609 / 1) ומענק מחקר Tenovus סקוטלנד.

1. איסוף של קטן מולקולה Kinase מעכבי ספריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ספריות מעכבות מאוספי מעכבי קינאז נגישים לציבור, כגון ספריית הרשתות המשולבות מבוססות רשת (LINCS) מבית הספר לרפואה של הרווארד, אוסף ממוקד של 228 מעכבי קינאז רבי עוצמה וסלקטיביים (http://lincs.hms.harvard.edu) , ואת Proinin Kinase inhibitor Set (PKIS), אוסף 376 המתחם התאספו על ידי חוקרים תעשייתיים (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . לחלופין, להרכיב אוסף מעכב קינאז מעכב מתוך תרכובות זמין מסחרית. הערה: במעבדה שלנו, יש לנו התאספו אוסף של 72 מעכבי קינאז כלי חזק סלקטיבי המכסים 51 קינאזות היעד העיקרי, כל אלה זמינים ממקורות מסחריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מעכבי קינאז לתוך צלחות 96-היטב עבור עיבוד תפוקה גבוהה אופטימלית בריכוזים מרובים (השתמש 1, 0.1 aNd 0.01 מ&quot;מ). כלול בכל בארות בקרת צלחת המכילה DMSO בלבד מעכבי בקרה התייחסות PD173074 (FGFRi) ו Ruxolitinib (JAKi), אשר ידועים לקדם מדינות pluripotent נאיבי מתוחכם בהתאמה. הוסף הערות בגיליון אלקטרוני או בתוכנה דומה. </li></ol> 2. mESC תנאי התרבות והנהלים להכנת מסך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1% ג &#39;לטין מצופה 10 ס&quot;מ מנות על ידי הוספת 5 מ&quot;ל של 0.1% (w / V) ג&#39; לטין עד 10 צלחות ס&quot;מ ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לשאוב ג&#39;לטין ולתת צלחת יבש במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות כל קו mESC רגיל ב 37 ° C 5% CO 2 על 0.1% ג &#39;לטין מצופה 10 ס&quot;מ מנות בתקשורת mESC סטנדרטי (ראה טבלה חומרים) המכיל 100 ng / mL GST-LIF, 10% עגל סרום סרום 5% סרום נוקאוט תַחֲלִיף. החלף מדי יום את התקשורת ואת mESCs המעבר סביב confluency 80% בכל יום שני בדילול של 1: 5-1: 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבור mESCs, לשאוב התקשורת לשטוף עם 5 מ&quot;ל oF פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין, 0.02% EDTA) לכל צלחת של mESCs ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים trypsinized ב 4 מ&quot;ל של התקשורת mESC ו צנטריפוגה בסל&quot;ד 1,200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend תא גלולה ב 5 מ&quot;ל של התקשורת mESC, pipetting למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים על ידי שילוב של השעיה 10 תא μL ו 10 μL של Trypan כחול (0.4%). מקום לתא ספירה תא או להשתמש hemocytometer ומיקרוסקופ אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 3 x 10 3 mESCs לתוך 0.1% ג&#39;לטין מצופה 96 צלחות היטב, נפח סופי 100 μL של התקשורת, באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעכבי קינאז ב דילול 1: 100 (מעכב 1 μL הוסיף 100 Media μL) באמצעות פיפטה רב ערוצי. בעדינות פיפטה התקשורת לערבב מעכב ההשעיה תא, ולאחר מכן לאפשר תאים להתיישב ברדס תרבות רקמה עבור 1 שעות כדי להבטיח את הפצה שווה אקרוSs משטח ציפוי. תרבות תאים במשך 48 שעות מבלי לשנות את התקשורת. הערה: לוחות מלאי של 0.1 / 0.1 / 0.01 מ&quot;מ ייתן ריכוז מעכב סופי של 10/1 / 0.1 מיקרומטר בהתאמה. אנו ממליצים להתחיל את המסך בריכוז סופי של 1 מיקרומטר כדי להבטיח עיכוב יעיל של קינאזים היעד העיקרי תוך מזעור מחוץ לכוון השפעות. </li></ol> 3. קינאז מעכבים ניתוח הקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 96 צלחות mESC גם 200 μL PBS באמצעות אספירטור רב ערוצי ו pipettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את תמציות התא μL 150 של חיץ תמוגה (20 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 150 מ&quot;מ NaCl, 1 מ&quot;מ EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0.5% נתרן deoxycholate (w / v), 10 מ&quot;מ β-glycerophosphate , 10 מ&quot;ל pyrophosphate נתרן, 1 NaF mM, 2 mM Na 3 VO 4 , Protease מעכב שלם קוקטייל טבליות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר תמציות על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 דקות V- התחתונה 96 צלחות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immobilize 100 μL של supernatants על nitrocel<html> קרום lulose באמצעות 96-גם ואקום נקודה כתם סעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הממברנה, ואת הכתם עם 40 מ&quot;ל של Ponceau S כדי להבטיח העברה עקבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום עם TBST ולחסום ב TBST / 3% (w / V) חלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בננוג ו Dnmt3b נוגדנים בדילול של 1: 1000 (v / v) ב TBST / 3% (w / v) אבקת חלב לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנות ב 3 x 10 דקות ב TBST ו דגירה ב 30 מ&quot;ל של נוגדנים משניים בדילול של 1: 10,000 (v / v) ב TBST / 3% (w / V) חלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח באמצעות מערכת דיגיטלית immunoblotting הדמיה. הערה: אם אפשר, להשתמש immunoblotting פלואורסצנטי כמותי כדי לזהות Nanog ו Dnmt3b. עם זאת, האות הרקע של Dnmt3b על ידי immunoblotting פלואורסצנטי גבוה מדי. לכן, 800 ננומטר פלואורסצנטי נגד ארנבת (ננוג) ו anti-mouse-HRP (Dnmt3b) נוגדנים משניים משמשים. </li></ol> 4. ניתוח של נתוני המסך ו אימות של מעכבים כמו רגולטוריים plaipipotency בתום לב &gt; הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח כי רק מאפננים ploreipotency בתום לב מזוהים. זה חיוני מעכבי triage מבוסס על שניהם Nanog: יחס Dnmt3b ואת האות הכולל, כדי להבטיח כי מעכבי קינאז אשר משפיעים לרעה הישרדות mESC לא נבחרו לניתוח נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ננוג האות Dnmt3b באמצעות תוכנת ניתוח immunoblotting, ואת ערכי ייבוא ​​לתוך גיליון אלקטרוני או תוכנה דומה. חישוב ננוג: יחס Dnmt3b עבור כל דגימות לעומת שליטה DMSO. כמו כן, לקבוע את סך Nanog ו Dnmt3b האות כדי להבטיח כי מעכבי kinase לא משפיעים על Nanog: Dnmt3b יחס ידי שינוי mESC הכדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש דירוג ננוג: יחסי Dnmt3b לזהות מעכבים אשר לקדם את pluripotency נאיבי (Nanog: Dnmt3b יחס גבוה יותר מאשר שליטה) ו ploripotency מתוחכם (Nanog: Dnmt3b יחס נמוך יותר מאשר שליטה). הגדר לחתוך סטייה 2x מערכי הבקרה, לסנן מעכבי kinase אשר מייצרים סך Nanog + Dnmt3b האות פחות מזה50% מערך הבקרה DMSO כדי ליצור רשימת אמון גבוהה של מעכבי קינאז אשר מייצב נאיבי (גבוה Nanog: Dnmt3b יחס) ו מתוחכם (נמוך Nanog: Dnmt3b יחס) pluripotent מדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימות מעכבי קינאז ידי זריעת mESCs ב 2 x 10 5 תאים לכל 6 היטב התקשורת 2 מ&quot;ל, ולהוסיף מעכבי קינאז ב 1 מיקרומטר במשך 48 שעות, ללא שינוי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse mESCs במאגר תמוגה ולנתח ביטוי Nanog ו Dnmt3b ידי immunoblotting SDS-PAGE קונבנציונאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוד לאמת את הלהיטים על ידי SDS-PAGE immunoblotting עבור סמנים pluripotency נאיבי Klf2 ו Klf4, ו Oct4 כדי להבטיח כי pluripotency נשמר לאחר טיפול 48 שעות מעכב. </li></ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li><li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li><li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells.">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency.">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li><li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+domains+of+Sos1/Grb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate.">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li><li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

המחברים אינם מכריזים על ניגודי אינטרסים הנובעים ממחקר זה.

כאן אנו מדגימים מתודולוגיה נגישה נרחב כדי לחקור את התפקיד של נתיבי איתות kinase ב ויסות המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם. זה מתייחס לשאלת מפתח בתחום ESC. למרות גישות גבוהות גנומיקה ו transcriptomics משמשים באופן שגרתי כדי לזהות הרגולטורים תמלול מפתח של מדינות pluripotent תמים ו מתוחכם, רשתות איתות איתות pluripotency הוכיחה להיות מאתגר. כעת אנו מספקים אסטרטגיה גמישה המעסיקים מעכבים כימיים כדי לזהות קינאזות השולטות המעבר pluripotent נאיבי תחולתי ב mESCs. זה מסתמך על ציוד פשוט, ריאגנטים וחומרים הזמינים ברוב המעבדות כי המחקר תא איתות ESC ביולוגיה. קריטי להצלחת פלטפורמה זו הוא הפיתוח שלנו assay חסון לכמת את המעבר בין מדינות pluripotent נאיבי מתוחכם. הקמת assay זה נדרש שינויים משמעותיים iterative כדי plat התאצפיפות ing, זמן הדגירה inhibitor ו immunoblotting תנאים. גישות מולקולות קטנות צוברים מתיחה לשימוש רציונלי ביישומים ESC טיפוליים 15 , 16 . כוח גדול של מולקולה קטנה ההקרנה היא כי תרכובות כלי מתוכננים ו / או שונה עבור ספיגת יעיל הסלולר. יעילות Transfection אינו מגביל, ושימוש במערכות מסירה מסוכנים כגון lentivirus אינו הכרחי. יתר על כן, מעכבים לעיתים קרובות לעכב מספר isoforms בתוך משפחה kinase ( למשל Fgfr1-4, Jak1-3), אשר מתגבר יתירות תפקודית כי מעכב גנטי / גנומי טכניקות הפרעה כגון RNAi ו CRISPR / Cas9. כמו תרכובות כלי חזק יותר סלקטיבי להיות זמין הן אקדמיות והן תרופות גילוי תרופות, מובחנים ולא מבינים קינאזות יהיה דחף לחזית המחקר ESC. לכן אנו מציעים כי זה גבוהגישת הקרנת הגלם תפתח אפיקים חדשים של מחקר לתוך רשתות הליבה ESC הליבה. מגבלה אחת קטנה של טכנולוגיה זו היא שאפילו המעכבים המולקולים הקטנים והסלקטיביים ביותר מעכבים ומעכבים קינאזות רבות שאינן קשורות ל- vivo . עם זאת, נתונים מקיפים יותר ויותר קינאז מעכב פרופיל מאפשר מטרות פונקציונליות של מעכבי קינאז להיות מזוהה בקלות (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase מעכבים). לבסוף, באופן עקרוני הפלטפורמה שלנו ניתן להחיל לחקור כל אוסף מולקולה קטנה ו / או assay הסלולר אשר באיכות גבוהה immunoblotting נוגדנים זמינים. זה יאפשר לימוד של מספר מערכות רגולטוריות ב ויסות pluripotency ולאפשר זיהוי של מעכבי מולקולה קטנה אשר לשנות תהליכים תאיים מגוונים. באופן ספציפי, אנו רואים כי יישום של אוספי מולקולה קטנה המתעוררים כגון האפיגאןבדיקות טיק המפותחות על ידי קונסורציום גנומי מבנית (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) יש פוטנציאל לחשוף רגולטורים רומן נוסף של מעברים pluripotent.

תאי גזע עובריים (ESC) יש את היכולת עצמית לחדש או להבדיל לתוך כל סוג התא בגוף המבוגר, תופעה הידועה בשם pluripotency 1 . עדויות אחרונות מצביעות על כך שקיימות מצבים מובהקים מבחינה התפתחותית, הנקראים &quot;יכולת נאיבית&quot; ו&quot;מתוחכמת &quot;. ESCs נאיבי מייצגים מצב של התפתחות דומה לזו שנמצאה בעובר preimplantation 3 . לעומת זאת, ESCs pledipotent מתוחכם עומדים לצאת pluripotency ולהבדיל לשושלות עובריים מיוחדים 4 , 5 . מדינות נאיביות ופלומות מסומנות מסומנות על ידי רשתות רגולטוריות שונות. פלוריפוטיות נאיבית מאופיינת על ידי ביטוי של גורמי תעתיק גורמי מפתח כגון ננוג, גורמי תעתיק כמו Krueppel (Klfs), Rex1 2 ו Esrrb <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. ב ESCs העכבר (mESCs), pluripotency מתוחכם מאופיין בביטוי מופחת של סמנים נאיבי ביטוי ביטוי גנטי ספציפי הכולל את דה novo DNA methyltransferase Dnmt3b 7 . ב vivo , מתוחכם pluripotent שלאחר השתלת epiblast בתאי גזע (EpiSCs) 4 , 5 בנוסף לבטא את הסמן Epiglast Fgf5 ו סמנים של תחול השושלת כגון Brachyury 8 . MESCs לספק מודל tractable כדי לחקור מנגנונים השולטים נאיבי- primed מעברים pluripotent במבחנה . כאשר מתורבת גורם בלוקמיה מעכב (LIF) וסרום שור העובר (FBS), mESCs עוברים המעבר הדינמי בין מדינות pluripotent נאיבי ו מתוחכם 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3 פונקציות איתות כדי לקדם את רשת נאיבית רגולטורית רשת 11 </Sup&gt;, בעוד איתות אוטוקריני באמצעות גורם הצמיחה fibroblast 4 (Fgf4) Erk1 / 2 נתיבים המעבר למצב תחולתי 12 . עם זאת, זה נשאר אתגר כדי להעריך באופן שיטתי את התפקיד של קינאזות חלבון בקביעת מדינות pluripotent מובהק. כאן, אנו מתארים פלטפורמה כמותית ומדרגית שבאמצעותה ניתן לבצע מסכי מולקולה קטנים הממוקדים עבור הרגולטורים של קינאז של המעבר pluripotent נאיבי תחולתי. אנו משתמשים בתנאים פשוטים תרבות mESC ו ריאגנטים סטנדרטיים, חומרים וציוד לחשוף ולאמת מעכבי קינאז עם יכולת unrecreciated עד כה לייצב pluripotency נאיבי. יתר על כן, אנו דנים יישומים מורחבת פוטנציאליים עבור טכנולוגיה זו, כולל עבור הקרנה של אוספים מולקולה קטנה אחרים כגון ספריות מעכבי המתעוררים המכוונים הרגולטורים epigenetic.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;mESC media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESCs</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Final: 2 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Final: 50 U/ml</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td><td>MRC-PPU reagents and services</td><td></td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Thermo</td><td>PMC9484</td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Final: 1 mM</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Final: 5%</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher</td><td>10703464</td><td>Final: 10%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TC materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo</td><td>25300054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>Thermo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 well plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lysis Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyrophosphate</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Sigma</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Milk Powder</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Western Blotting&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &amp;micor;M&amp;nbsp; Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Laboratory Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I System</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc imager</td><td>BioRad</td><td>1708280&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Imager</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Nanog</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

תאי גזע עובריים (ESCs) יכולים לחדש את עצמם או לבדל אותם לכל סוגי התאים, תופעה הידועה בשם pluripotency. מדינות מובחנות מובחנות תוארו, מכנות &quot;יכולת נאיביות&quot; ו&quot;מתוחכמת &quot;. המנגנונים השולטים במעבר מתוחכם נאיבי אינם מובנים כלל. בפרט, אנו נשארים גרועים על קינאזות חלבון המציינות מדינות pluripotent נאיבי ו מתוחכם, למרות זמינות מוגברת של תרכובות כלי באיכות גבוהה כדי לחקור פונקציה קינאז. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מדרגית לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים kinase של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם ESCs העכבר. גישה זו מנצלת תנאים פשוטים תרבות התא ריאגנטים סטנדרטיים, חומרים וציוד לחשוף ולאמת מעכבי קינאז עם השפעות שטרם הוערכו עד כה על pluripotency. אנו דנים ביישומים פוטנציאליים לטכנולוגיה זו, כולל הקרנה של מולקולה קטנה אחרתאוספים כגון מעכבי קינאז מתוחכמים יותר ויותר וספריות מתפתחות של תרכובות כלי אפיגנטיות.

באמצעות הנוהל המוצג כאן ( איור 1 ), אנו המסך הספרייה LINCS של 228 מעכבי קינאז עוצמה סלקטיבית לזהות את אלה אשר לווסת את mESC pluripotency. הספרייה מוכנה בריכוז של 0.1 מ&quot;מ עבור דילול 1: 100 וריכוז ההקרנה הסופית של 1 מיקרומטר ב mESCs. 48 שעות מאוחר יותר, mESCs היו lysed ותמציות מוכן ניתוח כמותי כתם נקודה של הביטוי Nanog ו Dnmt3b ( איור 2 , למעלה). תוצאות מריכוזי הקרנה אחרים אינם מיוצגים כאן לקיצור. ננוג: יחס Dnmt3b נקבעת עבור כל מעכב קינאז ותרכובות מדורגות חתך 2x להחיל ( איור 2 , התחתון). סך הכל Nanog ו- Dnmt3b האות ביחס לשליטה הוא עלים על דירוג מעכבים ונתונה חתך 0.5x, כדי לאפשר triaging של מעכבים אשר מראים משמעותי mESC רעילות. בחר מעכבי קינאז אשר לייצב את sta נאיביTe מאומתים באמצעות immunoblotting רגיל Nanog / Dnmt3b ( איור 3 ). היעדים העיקריים של קינאז של מעכבים אלה מוצגים בטבלה 1 . כמו כן, אנו מדגימים את הישימות של המסך הזה כדי לזהות מעכבים אשר מייצבים את המדינה מכווצת 14 . <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> איור 1: זרימת עבודה להקרנת מעכבי קינאז המווסתים מעבר נאיבי. MESC טופלו עם ספריית מעכב Kinase 228 תרכובת בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. Lysates הוכנו הועברו על קרומי ניטרוצלולוז עבור ניתוח כתם נקודות החיסונית, ואת רמות Nanog ו Dnmt3b נקבע (איור מותאם וויליאמס ואח &#39;14 ). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג את אל</a><html> גרסת האפר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> איור מס &#39;2: נייף- primed pluripotency מסך ניתוח זיהוי מעכבי. (למעלה) נציג Nanog ו Dnmt3b אימונו כתם נקודות כתם. (תחתית) ערכי Nanog ו- Dnmt3b עבור כל מעכב קינאז נקבעו ביחס לבקרת DMSO, וננוג: יחסי Dnmt3b וסיגנל Nanog + Dnmt3b היחסי שנקבע והמעכבים מדורגים בהשוואה לשליטה ב- DMSO. מעכבים מצאו לשנות Nanog: יחס Dnmt3b מעבר סף פי 2 מעל או מתחת לשליטה DMSO זוהו כנהגים של pluripotency נאיבי או מתוחכם. סף של 2x מתחת DMSO שליטה נקבע מעכבי triage אשר להתפשר mES הישרדות. מעכבים שנבחרו לאימות נוסף מודגשים. (איור מותאם וויליאמס ואח &#39;14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> איור 3: אימות תרכובות התאמה שנבחרו מזוהות. MESCs טופלו גם עם 1 מיקרומטר AZD4547 (מעכב FGFR סלקטיבית) או מעכבי המצוין מזוהה מהמסך באיור 2. Nanog: רמות Dnmt3b שנקבעו על ידי תקן SDS-PAGE וניתוח immunoblot. ערכים נומריים של ננוג יחסית: Dnmt3b ו Nanog + Dnmt3b מצוינים בטבלה שלהלן, ומעכבים המייצבים את המצב המצויר המוטבע בירוק. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מתחם </td><td colspan="2"> יעדים עיקריים </td><td> מטרות אחרות </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, ערכת, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> Src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> סיק </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR ו TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1: תרכובות פגיעה נבחרות ויעדי קינאז ראשוניים.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

a-simple-method-to-identify-kinases-that-regulate-embryonic-stem-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K Views.  University of Dundee.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם. 

Video: A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

תאי גזע אנושיים pluripotent בהתבסס התפתחותית רעילות מבחני לביולוגיה הקרנה ומערכות בטיחות כימית נתונים דור

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Biochemistry

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Biology

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

זיהוי של מתווכים של קולטן תא T איתות באמצעות הקרנת הסרט מעכב כימי ספריות

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Immunology and Infection

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...