Name: a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

CACW bir Tıbbi Araştırma Konseyi doktora öğrencisi tarafından desteklenmektedir. GMF kısmen Tıbbi Araştırma Konseyi Yeni Araştırmacı Ödülü (MR / N000609 / 1) ve Tenovus İskoçya araştırma ödeneği tarafından desteklenmektedir.

1. Küçük Molekül Kinaz İnhibitör Kütüphanelerinin Harmanlanması <ol><li> Herkes tarafından erişilebilen kinaz inhibitör koleksiyonlarından elde edilen harmanlama inhibitörü kütüphaneleri, örneğin 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörlerinden (http://lincs.hms.harvard.edu) oluşan bir koleksiyon olan Harvard Medical School&#39;tan Entegre Ağa Dayalı Hücresel İmzalar Kütüphanesi (LINCS) Ve endüstriyel araştırmacılar tarafından bir araya getirilen 376 bileşik koleksiyonu olan Protein Kinaz İnhibitör Seti (PKIS) (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 bulunmaktadır. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen bileşiklerden bir ısmarlama kinaz önleyici koleksiyonu monte edin. NOT: Laboratuarımızda, hepsi ticari kaynaklardan temin edilebilen 51 primer hedef kinazı kapsayan 72 güçlü ve seçici takım kinaz inhibitörü topluluğunu bir araya getirdik. </li><li> Birden fazla konsantrasyonda optimum yüksek verimli işleme için kinaz inhibitörlerini 96 oyuklu plakalar halinde bir araya getirin (kullanım 1, 0.1 aNd 0.01 mM). Her bir plakaya sırasıyla saf DMSO içeren referans plakaları ve sırasıyla naif ve primer pluripotent durumu teşvik ettiği bilinen referans kontrol inhibitörleri PD173074 (FGFRi) ve Ruxolitinib&#39;i (JAKi) ekleyin. Elektronik tablo veya benzeri bir yazılımda açıklama yapın. </li></ol> 2. MESC Kültür Hazırlama Şartları ve Prosedürleri <ol><li> 10 cm tabaklara% 0.1 (w / v) jelatin 5 ml ekleyerek% 0.1 jelatin kaplı 10 cm yemekleri hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Jelatı alın ve 2 dakika boyunca tabağı kurumaya bırakın. </li><li> 100 ng / mL GST-LIF,% 10 Fetal Buzağı Serum ve% 5 Nakavt Serumu içeren standart mESC ortamında (bkz. Malzeme Tablosu )% 0.1 jelatin kaplı 10 cm bulaşıkların 37 ° C&#39;lik% 5 CO 2&#39;de herhangi bir standart mESC hattını kültürleyin Değiştirme. Her geçen gün medyayı değiştirin ve her iki günde bir% 80 konfluenasyondaki MESC&#39;leri 1: 5-1: 10&#39;luk bir seyreltme ile geçirin. </li><li> MESC&#39;leri geçmek için, ortamı aspire edin ve 5 mL o ile yıkayın.F fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır. </li><li> MESC plakası başına 1 mL tripsin-EDTA (% 0.05 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA) ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 4 mL&#39;lik mESC medyumunda tripsinize edilmiş hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 5 dakika süreyle 1,200 rpm&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu üretmek için yukarı ve aşağı pipetleme, 5 mL&#39;lik mESC ortamı içinde hücre topağını iyice süspanse edin. </li><li> 10 mcL hücre süspansiyonu ve 10 mcL Trypan Mavisi (% 0.4) birleştirerek hücreleri sayın. Bir hücre sayma odasına yerleştirin veya bir hemositometre ve ışık mikroskopu kullanın. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanarak% 0.1 jelatin kaplı 96 gözlü plakalara, son hacimde 100 uL medyaya 3 x 10 3 mESC tohumlayın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak kinaz inhibitörlerini 1: 100 seyreltmede (1 uL inhibitör 100 uL medyaya ilave edilir) uygulayın. İnhibitör ve hücre süspansiyonunu karıştırmak için hafifçe pipetle sıkıştırın, daha sonra eşit dağılımı sağlamak için 1 saat boyunca hücrelerin bir doku kültürü kapağına yerleşmesine izin verin.Kaplama yüzeyi. Medyayı değiştirmeden 48 saat boyunca kültür hücreleri. NOT: 1 / 0.1 / 0.01 mM stok plakaları, sırasıyla 10/1 / 0.1 μM son bir inhibitör konsantrasyonu verecektir. Hedef dışı etkileri en aza indirirken birincil hedef kinazların etkin bir şekilde inhibe edilmesini sağlamak için, ekranı 1 μM son konsantrasyonda başlatmanızı öneririz. </li></ol> 3. Kinaz İnhibitör Tarama Analizi <ol><li> Çok kanallı aspiratör ve pipetleri kullanarak 200 mcL PBS&#39;de 96 oyuklu mESC plakalarını yıkayın. </li><li> 150 μL liziz tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40 (v / v),% 0.5 sodyum deoksikolat (w / v), 10 mM β-gliserofosfat , 10 mM sodyum pirofosfat, 1 mM NaF, 2 mM Na3V04, Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri). </li><li> Özleri, V-tabanlı 96 oyuklu plakalarda 30 dakika 1,500 xg&#39;de santrifüjle açıklayın. </li><li> Bir nitrol üzerine 100 μL süpernatantları hareketsiz hale getirinLüloz membran kullanılarak 96 oyuklu vakum nokta leke manifoldu kullanıldı. </li><li> Membranı kurutun ve tutarlı transferi sağlamak için 40 mL Ponceau S ile leke uygulayın. </li><li> Membranı TBST ile yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte bloke edin. </li><li> Nanog ve Dnmt3b antikorlarında TBST /% 3 (ağırlık / hacim) süt tozu içinde gece boyunca 1: 1000 (v / v) seyreltme ile inkübe edin. </li><li> Membranları TBST içinde 3 x 10 dakika yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte 1: 10,000 (v / v) seyreltilmiş 30 mL ikincil antikor içerisinde inkübe edin. </li><li> Dijital immünobotlama görüntüleme sistemi kullanarak geliştirin. NOT: Mümkünse, Nanog ve Dnmt3b&#39;yi tespit etmek için kantitatif floresans immünoblotlama kullanın. Bununla birlikte, floresans immünoblotlama ile Dnmt3b için arka plan sinyali çok yüksektir. Bu nedenle, 800 nm floresans anti-tavşan (Nanog) ve anti-fare-HRP (Dnmt3b) sekonder antikorlar kullanılır. </li></ol> 4. Ekran Verilerinin Analizi ve Bona Fide Pluripens Regülatörleri Olarak İnhibitörlerin Validasyonu <p class="jove_content"&gt; NOT: Bu sadece iyi niyetli pluripotens modülatörlerinin tanımlanmasını sağlamak için kritik bir adımdır. Hem Nanog: Dnmt3b oranına, hem de genel sinyal temelli inhibitörlerin, mESC sağkalımını olumsuz yönde etkileyen kinaz inhibitörlerinin daha ileri analiz için seçilmemesini sağlamak için ayrılması zorunludur. <ol><li> İmmünoblot analizi yazılımı kullanarak Nanog ve Dnmt3b sinyalini nicelleştirin ve değerleri bir elektronik tabloya veya benzer bir yazılıma aktarın. DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında tüm numuneler için Nanog: Dnmt3b oranını hesaplayın. Ayrıca, kinaz inhibitörlerinin, mESC canlılığını değiştirerek Nanog: Dnmt3b oranını etkilemediğinden emin olmak için toplam Nanog ve Dnmt3b sinyalini belirleyin. </li><li> Saf bulleşikliği (Nanog: Kontrolten daha yüksek olan Dnmt3b oranı) ve başlatılmış pluripotansı (Nanog: Dnmt3b oranı kontrolden düşük) teşvik eden inhibitörleri tanımlamak için sıralı Nanog: Dnmt3b oranlarını kullanın. Kontrol değerlerinden 2x sapma değerinde kesme değerini ayarlayın ve toplam Nanog + Dnmt3b sinyali üreten kinaz inhibitörlerini filtreleyinNaif (yüksek Nanog: Dnmt3b oranı) ve astarlanmış (düşük Nanog: Dnmt3b oranı) pluripotent durumları stabilize eden kinaz inhibitörlerinin yüksek bir güven listesinin üretilmesi için DMSO kontrol değerinin% 50&#39;si. </li><li> 2 mL&#39;lik ortamda 6 kuyucukta 2 x 105 hücreye mESC&#39;leri ekleyerek kinaz inhibitörlerini doğrulayın ve ortam değiştirmeden 48 saat boyunca 1 uM&#39;de kinaz inhibitörleri ekleyin. </li><li> MESC&#39;leri liziz tamponunda Lyse edin ve geleneksel SDS-PAGE imünoblotlama ile Nanog ve Dnmt3b ekspresyonunu analiz edin. </li><li> Çabukluğun, 48 saatlik inhibitör tedavisinin ardından muhafaza edildiğinden emin olmak için, Naif pluripotik belirteçler Klf2 ve Klf4 ve Oct4&#39;ün SDS-PAGE immünoblotlaması ile isabetlerini doğrulayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li><li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li><li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells.">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency.">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li><li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+domains+of+Sos1/Grb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate.">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li><li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

Yazarlar bu çalışmadan doğan herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ettiler.

Burada, naif başlangıçlı pluripotent geçişin düzenlenmesinde kinaz sinyal yollarının rolünü araştırmak için yaygın olarak erişilebilen bir metodolojiyi göstermektedir. Bu ESC alanında önemli bir soruyu ele alıyor. Yüksek verimli genomik ve transkriptomik yaklaşımlar, naif ve başlangıçlı pluripotent durumların anahtar transkripsiyonel regülatörlerini tanımlamak için rutin olarak kullanılır, ancak pluripotens sinyal şebekelerini aydınlatmanın zor olduğu kanıtlanmıştır. Şimdi, mESC&#39;lerde naif başlangıçlı pluripotent geçişini kontrol eden kinazları tanımlamak için kimyasal inhibitörleri kullanan esnek bir strateji sunuyoruz. Bu, hücrenin sinyal verme ve ESC biyolojisi üzerine çalışan çoğu laboratuarda bulunan basit ekipman, reaktifler ve malzemeler üzerine kuruludur. Bu platformun başarısı için kritik olan, naif ve başlatılmış pluripotent durumlar arasındaki geçişin nicelleştirilmesi için sağlam bir analiz geliştirmemizdir. Bu tahlilin oluşturulması, hücre platinde önemli iteratif değişiklikler gerektirdiYoğunluk, inhibitör inkubasyon zamanı ve immunoblotlama koşulları. Küçük molekül yaklaşımları, terapötik ESC uygulamalarında rasyonel kullanım için çekiş kazanmaktadır 15 , 16 . Küçük molekül taramalarının önemli bir gücü, araç bileşimlerinin etkin hücre alımı için tasarlanmış ve / veya modifiye edilmiş olmasıdır. Transfeksiyon etkinliği sınırlayıcı değildir ve lentivirüs gibi tehlikeli iletim sistemlerinin kullanılması gerekli değildir. Ayrıca, inhibitörler sıklıkla bir kinaz ailesi ( örn. , Fgfr1-4, Jak1-3) içindeki birden fazla izoformu inhibe eder ve RNAi ve CRISPR / Cas9 gibi genetik / genetik girişim tekniklerini engelleyen fonksiyonel fazlalığın üstesinden gelir. Hem akademik hem de farmasötik ilaç keşfi programlarından daha güçlü ve seçici araç bileşikleri elde edildiğinde, az öğrenilen ve iyi anlaşılmayan kinazlar ESC araştırmasının ön planına itilecektir. Bu nedenle, bu yüksekKaba yeme tarama yaklaşımı, temel ESC düzenleyici ağlarına yeni araştırma yolları açacaktır. Bu teknolojinin küçük bir kısıtlaması, en güçlü ve seçici küçük molekül inhibitörleri bile in vivo çoklu ilgisiz kinazlarla etkileşime girip engellemektir. Bununla birlikte, gittikçe genişleyen kinaz inhibitörü profil verisi, kinaz inhibitörlerinin işlevsel hedeflerinin kolayca tanımlanmasına izin verir (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). Son olarak, prensip olarak, platformumuz, yüksek kaliteli immünoblot antikorlarının bulunduğu herhangi bir küçük molekül toplama ve / veya hücresel tahlilin sorgulanması için uygulanabilir. Bu, pluripotens regülasyonunda çoklu düzenleyici sistemlerin incelenmesine ve çeşitli hücresel prosesleri değiştiren küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. Özellikle, epijen gibi ortaya çıkan küçük molekül koleksiyonlarınınYapısal Genomik Konsorsiyumu (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) tarafından geliştirilen tik problar, pluripotent geçişlerin daha yeni regülatörlerini ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir.

Embriyonik kök hücreler (ESC&#39;ler), pluripotens 1 olarak bilinen bir fenomen olan yetişkin vücuttaki herhangi bir hücre türüne kendi kendine yenilenme veya ayırma kapasitesine sahiptir. Yeni kanıtlar, &quot;naif&quot; ve &quot;astarlanmış&quot; pluripotency olarak adlandırılan, gelişimsel olarak farklı pluripotent durumların var olduğunu ortaya koymaktadır. Naif ESCler, preimplantasyon embriyo 3&#39;dekine benzer bir gelişim halini temsil eder. Buna karşın, başlatılmış pluripotent ESC&#39;ler pluripotency&#39;den çıkmak ve özelleştirilmiş embriyonik soylara ayırmak için hazırlanırlar 4 , 5 . Naive ve primer pluripotent devletler ayrı gen düzenleyici ağlarla işaretlenir. Naif pluripotik, Nanog, Krueppel benzeri transkripsiyon faktörleri (Klfs), Rex1 2 ve Esrrb gibi anahtar pluripotens transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonuyla karakterizedir <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Fare ESC&#39;lerde (mESC&#39;ler), başlangıçtaki pluripotens, naif belirteçlerin azaltılmış ifadesi ve de novo DNA metil transferaz Dnmt3b&#39;yi içeren spesifik bir gen ekspresyon imza ile karakterize edilir 7 . In vivo , primer pluripotent implant sonrası epiblast kök hücreleri (EpiSCs) 4 , 5 ek olarak Epiblast markörü Fgf5&#39;i ve Brachyury 8 gibi soy primingin belirteçlerini ifade eder. MESC&#39;ler , in vitro saf ön provizyonlu pluripotent geçişleri kontrol eden prob mekanizmalarına uygulanabilir bir model sağlar. Lösemi inhibitör faktör (LIF) ve fetal sığır serumu (FBS) ile kültürlendiğinde, mESC&#39;ler saf ve başlangıçlı pluripotent durumlar arasında dinamik geçiş yapar 9 , 10 . Naif bir gen düzenleyici ağı teşvik etmek için LIF-Jak-Stat3 sinyalizasyon işlevleri 11 </Fibroblast büyüme faktörü 4 (Fgf4) Erk1 / 2 yolak yoluyla otokrin sinyalizasyon, astar hal 12&#39;ye geçişi sağlar. Bununla birlikte, protein kinazların farklı pluripotent durumların belirlenmesindeki rolünü sistematik olarak değerlendirmek de bir meydan okuma olmaya devam etmektedir. Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük moleküler elekleri gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Basit parazit mukavemeti stabilize etme yeteneği ile kinaz inhibitörlerini ortaya çıkarmak ve doğrulamak için basit mESC kültür koşullarını ve standart reaktifleri, malzemeleri ve ekipmanları kullanırız. Ayrıca, epigenetik düzenleyicileri hedef alan gelişmekte olan inhibitör kütüphaneleri gibi diğer küçük molekül koleksiyonlarının taranması da dahil olmak üzere, bu teknoloji için potansiyel genişletilmiş uygulamaları tartışıyoruz.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;mESC media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESCs</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Final: 2 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Final: 50 U/ml</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td><td>MRC-PPU reagents and services</td><td></td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Thermo</td><td>PMC9484</td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Final: 1 mM</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Final: 5%</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher</td><td>10703464</td><td>Final: 10%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TC materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo</td><td>25300054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>Thermo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 well plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lysis Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyrophosphate</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Sigma</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Milk Powder</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Western Blotting&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &amp;micor;M&amp;nbsp; Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Laboratory Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I System</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc imager</td><td>BioRad</td><td>1708280&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Imager</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Nanog</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

Embriyonik kök hücreler (ESC&#39;ler), kendi kendini yenileyebilir veya pluripotency olarak bilinen bir fenomen olan tüm hücre tiplerine farklılaşabilir. Belirgin pluripotent durumlar &quot;naif&quot; ve &quot;astarlanmış&quot; pluripotency olarak adlandırılmıştır. Saf önlemli geçişi kontrol altına alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle, kinetik fonksiyonu araştırmak için yüksek kaliteli alet bileşiklerinin mevcudiyetinin artmasına rağmen, naif ve başlangıçlı pluripotent durumları belirten protein kinazlar hakkında kötü bilgi sahibiyiz. Burada, fare ESC&#39;lerindeki naif başlatılmış pluripotent geçişin kinaz düzenleyicileri için hedeflenmiş küçük moleküler ekranlar gerçekleştirmek için ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, basit hücre kültürü koşullarını ve standart reaktifleri, materyalleri ve ekipmanı kullanarak, pluripotens üzerine şimdiye dek değinilmemiş etkileri olan kinaz inhibitörlerini açığa çıkarır ve onaylar. Bu teknolojinin potansiyel uygulamalarını tartışıyoruz, diğer küçük moleküllerin taranması da dahilGiderek sofistike kinaz inhibitörleri ve ortaya çıkan epigenetik araç bileşiklerinin kütüphaneleri gibi koleksiyonlar.

Burada sunulan prosedürü kullanarak ( Şekil 1 ), 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörünün LINCS kütüphanesini tarayarak mESC pluripotensini modüle edenleri belirledik. Kütüphane, 1: 100 seyreltme için 0.1 mM konsantrasyonda ve mESC&#39;lerde 1 uM son tarama konsantrasyonunda hazırlanır. 48 saat sonra, mESC&#39;ler parçalandı ve Nanog ve Dnmt3b ifadesinin kantitatif nokta leke analizi için ekstraktlar hazırlandı ( Şekil 2 , üstte). Diğer tarama konsantrasyonlarından elde edilen sonuçlar burada kısalık olarak gösterilmez. Nanog: Dnmt3b oranı her kinaz inhibitörü ve bileşenler için sıralanır ve 2x kesme uygulanır ( Şekil 2 , alt). Kontrolle ilgili toplam Nanog ve Dnmt3b sinyali, inhibitör sıralamasına bindirilir ve önemli mESC toksisitesini gösteren inhibitörlerin triazasyonuna izin vermek için 0.5x kesime tabi tutulur. Safevatı stabilize eden kinaz inhibitörlerini seçinGeleneksel Nanog / Dnmt3b immünoblotlama ( Şekil 3 ) kullanılarak doğrulanır. Bu inhibitörlerin primer kinaz hedefleri Tablo 1&#39;de sunulmuştur. Bu ekranın, astarlanmış hali stabilize eden inhibitörleri tanımlamak için uygulanabilirliğini de göstermekteyiz 14 . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Şekil 1: Saf başlangıçlı geçiş modüle eden kinaz inhibitörlerinin taranması için iş akışı. MESC, 1 uM&#39;lik nihai konsantrasyonda bir 228 bileşik kinaz inhibitör kütüphanesi ile muamele edildi. Lizatlar hazırlandı ve immüno nokta-leke analizi için nitroselüloz membranlara aktarıldı ve Nanog ve Dnmt3b seviyeleri belirlendi (Şekil 14 , Williams ve diğerleri 14&#39;den adapte edildi). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a><html> Bu rakamın daha yükseği yok. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Şekil 2: Naive ile hazırlanmış pluripotens ekran analizi ve inhibitör tanımlama. (Üstteki) Temsilci Nanog ve Dnmt3b immüno nokta-lekeli görüntüler. (Alt) Her kinaz inhibitörü için Nanog ve Dnm3b değerleri DMSO kontrolüne göre belirlendi ve Nanog: Dnmt3b oranları ve toplam nispi Nanog + Dnmt3b sinyali belirlendi ve inhibitörler DMSO kontrolüne kıyasla sıralandı. Nanog: Dnmt3b oranını, DMSO kontrolünün üstünde veya altındaki 2 misli eşiğin ötesinde değiştirenlerin, naif veya başlatılmış pluripotensin sürücüleri olduğu tespit edildi. DMSO kontrolünün 2x altında bir eşik değeri, mESC sağkalımını tehdit eden inhibitörlerin triaj edilmesi için ayarlandı. Daha ileri doğrulama için seçilen inhibitörler vurgulanır. (Şekil, Williams ve diğerleri 14&#39;den uyarlanmıştır ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Şekil 3: Belirlenen seçilmiş isabet bileşiklerinin doğrulanması. MESC&#39;ler ya 1 uM AZD4547 (seçici bir FGFR önleyicisi) ya da Şekil 2&#39;deki ekrandan belirlenen belirtilen inhibitörler ile muamele edildi. Nanog: Dnmt3b seviyeleri standart SDS-PAGE ve immünoblot analizi ile belirlendi. Göreceli Nanog: Dnmt3b ve Nanog + Dnmt3b&#39;nin sayısal değerleri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir ve naif pluripotent durumu stabilize eden inhibitörler yeşil renkte vurgulanmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> bileşik </td><td colspan="2"> Birincil Hedefler </td><td> Diğer Hedefler </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR ve TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1&#39;inin </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2&#39;dir </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1: Seçilen isabet bileşikleri ve bunların primer kinaz hedefleri.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

a-simple-method-to-identify-kinases-that-regulate-embryonic-stem-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K Görüntüleme.  University of Dundee.  Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz. 

Video: A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Gelişim Biyolojisi

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Biyokimya

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Biyoloji

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...