This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.

<ol>
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The authors declare no existing or potential conflict of interest.

このレポートでは、どのように文化HEI-OC1細胞をに説明し、薬剤誘発性細胞毒性のメカニズムを評価するためにそれらを使用し、プレスチン、蝸牛OHCSの分子モーターの機能特性を調査します。技術的手順は、しかしながら、容易に別の試験に適合することが十分に一般的です。 ここで説明するすべてのプロトコルは、十分に確立された細胞培養技術10の正しい使用を必要とします。ただ、他の細胞株と同様に、HEI-OC1細胞での作業は認定生物学的安全キャビネット、冷却遠心機、水浴、および細胞培養物の検査のための1つの倒立顕微鏡を用いてカウントを細胞について適切に装備した細胞培養施設を必要とし、 hemocytometric技術を使用している場合。固有の要件は、しかしながら、NP-HEI-OC1細胞39℃/ 5％CO 2でのP-HEI-OC1細胞を33℃/ 10％CO 2で2加湿インキュベータ、一組の利用可能性およびその他であります秒。計画された研究のみがP-HEI-OC1細胞を含む場合、第二のインキュベータを37℃/ 5異なるアッセイについての％CO 2に設定することができます。 プラスチック細胞培養皿の使用はHEI-OC1細胞を操作するための重要な追加必須です。実際には、HEI-OC1細胞は非常に堅牢であり、彼らは別の面で、非常に異なる条件下での増殖ます。しかし、それらの表現型と薬物および他の刺激に対する反応が強く培養パラメータ（G Kalinec＆F Kalinec、未発表）に依存します。我々は以前の紙8で論じたように、HEI-OC1細胞のこの可塑性は、有利には、新規の実験を設計するために使用されてもよいです。例えば、よく蝸牛外リンパ中の酸素圧は海面（〜21.3キロパスカル）27に典型的なインキュベーター中でより（約2キロパスカル）はるかに低いことが知られています。低いO 2濃度でインキュベートHEI-OC1細胞は、おそらくそれらを監査するためのより良いモデルを作り、その応答を変更しますORY感覚細胞。 HEI-OC1細胞の培養および継代培養のために記載されたプロトコルは、このようなコルチ11,12とSVの臓器からOC-K3と同じトランスジェニックマウスから我々の研究室で開発された他の聴覚の細胞株でも使用することができることを強調すべきです-k1線条から13,14 vascularis。また、これらの細胞株は、選択された実験でHEI-OC1細胞のためのコントロールとして有用であり得ます。例えば、我々は最近、反比例免疫反応性がプレスチンするとHEI-OC1の細胞の細胞膜でのNa + K + ATPアーゼ抗体は、細胞型依存性応答ではなく、トランスジェニックマウスから関連付けられていたことを実証するためにSV-K1細胞を使用していましたこれは、これらの細胞が9を得ました。 HEI-OC1細胞を操作するための他の重要な要件は、70％eで安全キャビネット内のすべての作業面を洗浄するなどの適切な無菌技術の練習ですthanolまたはイソプロパノールと手続きに必要な物質の除染。他の哺乳動物細胞株は、しばしばペニシリン - ストレプトマイシンまたは他の類似の組み合わせを使用して、不注意な細菌汚染から保護されている間しかし、抗生物質は研究の目的は、その効果を調べることである場合を除き、HEI-OC1細胞を使用してはなりません。 HEI-OC1細胞を、抗生物質を含まない条件下で生成された、と彼らは抗生物質耐性細胞の出現を減らすために避けなければなりません。 最後に、我々はすでにポイントを再強調し、この報告書で何度か言及したい：表現型および薬物および他の刺激にHEI-OC1細胞の応答は強く培養パラメータに依存します。したがって、HEI-OC1細胞を扱う研究室は、他のグループによって提供されるとの結果が真に同等にするために同様のプロトコルおよび細胞培養条件を使用することが非常に重要です。また、それはHEI-OC1細胞株は、モデルが持っているすべての制限付きで、唯一のモデルであることを覚えておくことが非常に重要。 HEI-OC1細胞を用いたin vitro実験を正確に実際の聴覚感覚細胞のin vivoでの応答を表すデータを提供することを期待することは非現実的です。しかし、我々は強くHEI-OC1細胞株は、聴覚感覚細胞および薬理学的薬剤の潜在的な耳毒性のスクリーニングの機能的応答を調査するための有用なモデルであると考えています。

コルチ1のハウス耳研究所-臓器（HEI-OC1）細胞は、トランスジェニックマウスの1,2の聴覚器官に由来しています。 33℃/ 10％CO 2（許容条件）で、このトランスジェニックマウスからの任意の細胞のインキュベーションは、脱分化と加速増殖をトリガーする不死化遺伝子の発現を誘導します。 39℃/ 5％CO 2の少なくともHEI-OC1、細胞死2,3の場合には、増殖、分化を減少した（非許容条件）リードに対して細胞を移動させます。 HEI-OC1細胞をクローニングし、十年以上前に私たちの研究室で特徴付けられ、そして初期の研究は、彼らが特定のそのようなプレスチン、ミオシン7aと、のAtoh1、BDNF、カルビンジンおよびカルモジュリンなどの蝸牛有毛細胞のマーカーだけでなく、支援のマーカーを発現することが示されましたコネキシン26及び線維芽細胞増殖因子受容体（FGF-R）2のような細胞です。したがって、それはHEI-OC1はのCommoを表すことが示唆されましたコルチ2の器官の感覚と支持細胞のためのn個の前駆細胞。薬は、非耳毒性考えながら並列研究はペニシリンのように、2,3なかった、シスプラチン、ゲンタマイシンおよびストレプトマイシンのような典型的な耳毒性薬が誘発されることをこれらの細胞におけるカスパーゼ3活性化を強力な証拠を提供しました。従って、この細胞株は、耳毒性に関与する細胞および分子機構を調査し、新しい薬理学的薬剤の潜在的な耳毒性またはotoprotective特性のスクリーニングするためのインビトロ系として提案されました。 HEI-OC1細胞を、過去10年間に発表された百以上及び五十の研究において使用されていると推定されます。 異なる薬剤の潜在的なプロアポトーシス効果を見ているが、この細胞株を含む研究のほとんどの主要な目標であったが、オートファジーと老化のような他の重要な細胞プロセスはちょうどHEI-OC1細胞4-7で調査され始めています。私naが我々の研究室8からの最近の研究では、我々は頻繁に診療所で使用される異なる薬理学的薬剤によって誘導される細胞死、生存、増殖、老化およびオートファジーに関するデータの包括的なセットを収集するためにHEI-OC1の細胞を使用しました。我々はまた、同一の治療を受けてHEK-293（ヒト胎児腎臓細胞）およびHeLa細胞由来のもの（ヒト上皮細胞）でHEI-OC1細胞の応答の一部を比較しました。我々の結果は、HEI-OC1細胞を、試験下のメカニズムの少なくとも1つに特有の用量及び時間依存性の感度で、特性ようにザ各薬物に応答することが示されました。また、実験結果の正しい解釈は、複数の技術8と平行した研究を行う必要がありますことをその研究に強調しました。 別の研究では、プレスチンの機能的応答を評価するためのHEI-OC1細胞の使用、蝸牛外有毛細胞のモータータンパク質（OHCS）9を調査しました</s&gt;アップ。私たちは、許容（P-HEI-OC1）および非で培養HEI-OC1細胞におけるプレスチン発現パターンと同様に、非線形容量（NLC）および全細胞パッチクランプ研究にフローサイトメトリーおよび共焦点レーザー走査顕微鏡研究報告しました許容（NP-HEI-OC1）条件。我々の結果は、NP-HEI-OC1細胞で時間依存的に総プレスチン発現および原形質膜局在化の増加の両方。興味深いことに、我々はまた、全細胞発現の有意な変化なしに細胞質への形質膜からトランスロケーションのNa + K + ATPアーゼの減少と相関NP-HEI-OC1の細胞の細胞膜でのプレスチンの局在の増加ことがわかりました。また、我々は、P-HEI-OC1細胞は原形質膜に存在するプレスチン分子の密度が増加したときに減少し、運動機能を、プレスチンに関連付け堅牢なNLCを有することを実証しました。要するに、これらの結果は、HEI-OCの有用性をサポート1細胞は、聴覚タンパク質を調査します。 このビデオの記事では、我々は文化HEI-OC1細胞に、なぜ薬剤誘発性細胞毒性のメカニズム/秒を評価する方法、細胞毒性研究のために許容条件（P-HEI-OC1）で増殖する細胞を使用するのが便利であるとどのように方法について説明します電気生理学的研究を行うために（ 例えば 、パッチクランプ、非線形キャパシタンス（NLC））はプレスチン、蝸牛OHCSの分子モーターの機能的特性を調べました。

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1 cells</td><td></td><td></td><td>ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Class II Biological Safety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>AND COMPANIES INDICATED IN THE</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PRODUCT COULD BE USED.</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Two (2) Cell incubators, one at 33 &amp;deg;C/10% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and other at 39 &amp;deg;C/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes , PS,&amp;nbsp; 60 mm x 15 mm with vents&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue culture flasks&amp;nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue cultur&amp;nbsp; flasks 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;6 well cell culture plate, with lid-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium, no phenol red</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25%&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay&amp;nbsp; kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8091&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU Cell Proliferation Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Non-enzymatic cell dissociation solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII instrument&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>&amp;nbsp;FACSAriaIII</td><td>With 488 nm excitation (blue laser)</td></tr><tr><td>Digital Blot Scanner</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis and Blotting Unit</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Puller for preparing patch electrodes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

working with auditory hei-oc1 cells

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 &#176;C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 &#176;C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

最近の出版物のカップルで、私たちはいくつかの一般的に使用される薬理学的薬剤へのHEI-OC1細胞の応答を評価するだけでなく、プレスチン機能8,9を調査することを目的とした研究の包括的なセットを報告しました。これらの研究において、我々は、前のセクションで説明したすべてのプロトコルを利用しました。 これらの先行研究の結果の一つは、非許容条件下で培養HEI-OC1細胞を、（39℃/ 10％CO 2 = NP-HEI-OC1）は細胞生存率の非常に有意な減少、および同様に有意な増加を示したことでした細胞死で、許容条件下で培養した細胞に対して、（33℃/ 10％のCO 2 = P-HEI-OC1）（ 図1）。したがって、任意の細胞毒性試験は、培養条件の影響から識別薬物効果にかなりの努力を捧げべきNP-HEI-OC1細胞上で行いました。 additioで細胞に対する薬物の効果はすでに死んまたはであるためnは、減少した生存率は、健康な細胞上の同じ薬剤の効果は、我々は分化した細胞を特異的に必要としない実験のためにP-HEI-OC1細胞を使用することをお勧めしますことを異なる可能性があります。 異なる薬理学的薬剤の効果に関する我々の研究はまた、興味深い結果が得られました。例えば、シスプラチン、化学療法剤は、しばしばいくつかのヒト悪性腫瘍の治療、及びアセトアミノフェン（APAP = N-セチルPA RA-アミノのp henol）に使用される、アメリカで最も広く販売されて店頭鎮痛剤、 HEI-OC1細胞（ 図2）のための毒性の両方でした。 APAPは、細胞生存率を減少し、カスパーゼ3/7活性を増加したが、それは、細胞死を誘導しませんでした。シスプラチンは、対照的に、大幅に3つの応答（ 図2）を増加させました。興味深いことに、カスパーゼ3/7 MOSTLました高用量致死効果は、腫瘍症/ネクロトーシスと関連することができながら、シスプラチンの低用量によって誘導される細胞死はおそらく、アポトーシスによって媒介されたことを示唆し、低いシスプラチン濃度で活性化のy。腫瘍症はブレブ形成、細胞およびオルガネラ腫脹を伴う無秩序な細胞死に至る前致死経路として定義され、膜透過性17,18が増加してきたが、ネクロトーシスが開始同じ刺激によって活性化規制非アポトーシス細胞死のメカニズムでありますアポトーシスが、腫瘍症19-22と同様の形態学的特徴を持ちます。 APAPおよびP-HEI-OC1細胞に対するシスプラチンの効果を調査することを目的としたさらなる研究は、前の段落で説明した細胞死なしで細胞生存率の魅力的な減少を説明することができる細胞増殖のAPAPの明確な用量依存性効果を示した（ 図図3（a））。シスプラチンのALS<html> O細胞増殖を減少させ、その効果は、少量（ 図3A）の露光時間で増大するが、加えて、我々の研究（ 図3B）に含まれる全ての濃度および時点で老化を減少させました。シスプラチンによって誘導される細胞老化の有意な減少は、老化細胞は、おそらく、健康な細胞23よりも早く死ぬしやすいだろうと仮定して、細胞死の増加によって説明することができます。 重要なことは、これらの代表的な結果は、HEI-OC1細胞は、研究中のメカニズムの少なくとも1つに独特の用量および時間依存感度で異なる薬理学的薬剤に応答することを示唆しています。したがって、いずれの実験結果の正しい解釈を検討し、特定の細胞プロセスを明確に理解し、それらを評価するために使用される技術の一つ一つによって提供される情報が必要になります。 「FO：=-together.within-ページを保つ「jove_content 1 &quot;&gt;共焦点他方では、フローサイトメトリー実験は、プレスチンはで主にimmunolocalizingで、P-HEI-OC1およびNP-HEI-OC1細胞でプレスチン発現を確認しましたP-HEI-OC1細胞（ 図4A、矢印）の細胞質、およびNP-HEI-OC1細胞（ 図4B、矢印）での形質膜において、より濃縮した。フローサイトメトリーは、研究では、NP-HEIでプレスチン発現の明らかな増加を示しました-OC1細胞はP-HEI-OC1細胞（ 図 4Cおよび4D）に対する。NP-HEI-OC1細胞におけるプレスチンの発現および原形質膜局在化の時間依存的増加は、転座がよりプレスチン分子の合成を伴っていたことを示唆しています。しかし、これらの実験は、それらが細胞質にとどまるとのみ新しくシンセ場合、もともと細胞質の形質膜への移行、新しい分子に位置プレスチン分子は、それらを置き換えるかどうかを決定するための手がかりを提供していませんでしたプレスチンは、原形質膜、または両方のプロセスの組み合わせに移動esized。 細胞は1のために、非許容条件に移動されたときに電気生理学的研究は、減少したピーク値と、より脱分極の値にシフトしたピーク容量の電圧と、P-HEI-OC1細胞（ 図5B）で堅牢なNLCを示し、 2週間後（ 図5Cおよび5D）。なぜなら、細胞質から細胞膜へのプレスチンの進行転座、我々は当初NLCはP-HEI-OC1細胞よりもNP-HEI-OC1が高いであろうと、それはさらにNPインキュベーション時間と共に増加するという仮説を立て条件。驚くべきことに、我々の研究の結果は正反対の反応を示しました。我々は、原形質膜におけるプレスチン分子の密度の増加は、それらの運動機能を制限することができると推測しました。 HEI-OC1細胞のピーク容量で図5のヒンページ= &quot;1&quot;&gt;注電圧の脱分極はOHCSにし、トランスフェクトしたHEK293細胞24で報告された典型的な値に尊重します。また、脱分極シフトはNP条件で、時間とともに増加することを確認します。進行性の脱分極シフトは、マウスおよびラットの開発25,26間にOHCSで説明したものと同様であり、そしてOHCの原形質膜25、または内因性成熟過程に関連する他の細胞構造の開発に関連することが示唆されました24をプレスチンします。 私たちは、HEI-OC1細胞と少数の研究のこの簡単な再集計は、細胞および分子応答の広いスペクトルを調査するためのHEI-OC1細胞の潜在的有用性の十分な証拠を提供したいと考えています。 <html>広告/ 54425 / 54425fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：P-HEI-OC1 およびNP-HEI-OC1細胞における細胞生存率と細胞死 。 （A）細胞生存率はMTTアッセイにより評価しました。吸光度をプレートリーダーで測定し、コントロール細胞の平均ODは生存率を100％としました。 （B）細胞毒性アッセイで評価細胞死。 530 15nmの正（死）細胞の数は、488 nmの励起（青色レーザ）とFL1とフローサイトメトリーによって決定しました。非許容条件によって誘導される細胞死（B）において非常に有意な（P≤0.001）細胞生存率の減少（A）と増加に注意してください。バーは平均の標準誤差（SEM）を表します。参照8から修正された。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="&lt;/ htmlの">「図2」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：MTT、 カスパーゼ3/7および細胞毒性アッセイによって分析した場合にAPAP及びシスプラチンにさらさHEI-OC1細胞の応答 MTTアッセイで評価（A）細胞の生存率、および吸光度をプレートリーダーで測定しました。 （B）実行カスパーゼ3/7の活性化。 （C） 薬物-細胞毒性アッセイで評価し細胞死を誘導し;正（死）細胞の数をフローサイトメトリーによって決定しました。すべての実験データは、可能な同時の統計分析を行うために、それぞれの制御条件（コントロール= 1）に正規化しました。 * =コントロールにP≤0.05について。バーは平均の標準誤差（SEM）を表します。 fromreference 8変更された。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </A&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig3.jpg" /> 図3：HEI-OC1 細胞」分裂速度 ​​および老化にAPAP及びシスプラチンの影響。 （A） HEI-OC1細胞の有糸分裂の速度で薬物誘発性の変化は、24及び48時間でのBrdUアッセイを用いて評価した。HEI-OC1細胞における（B）薬物誘導性の老化フローサイトメトリーによって測定し、老化しました関連βガラクトシダーゼ（SA-Bgal）技術。すべての実験データは、可能な同時の統計分析を行うために、それぞれの制御条件（コントロール= 1）に正規化しました。 * =コントロールにP≤0.05について。バーは平均の標準誤差（SEM）を表します。修正されたfromreference 8。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig3large.jpg" target="_blank">トンの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>彼の姿。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig4.jpg" /> 図4：P-HEI-OC1およびNP-HEI-OC1細胞におけるプレスチン発現-細胞は、抗プレスチン抗体で標識し、共焦点顕微鏡とフローサイトメトリーによって観察された （A）P-HEI-OC1細胞ではで主に免疫局在プレスチン細胞質（矢印）。 NP-HEI-OC1細胞（B）は 、対照的に、プレスチン反応性は細胞膜（矢印）で濃縮しました。 （CおよびD）は、NP状態（D）で2週間培養HEI-OC1細胞におけるフローサイトメトリー研究フローP-HEI-OC1細胞（C）にプレスチン発現に関して明確な増加を示しました。 （C）挿入図は、二次的なものです ABのみ（陰性対照）。参照9から変更。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig5.jpg" /> 図5：P-HEI-OC1 およびNP-HEI-OC1細胞 （A）パッチクランプHEI-OC1セル内NLC研究 。 （B - D）NLC P-HEI-OC1およびNP-HEI-OC1細胞インチNLCのピークの減少とよりNP-HEI-OC1のセルの値を脱分極する曲線の漸進的シフトに注意してください。参照9から修正された。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Working with Auditory HEI-OC1 Cells

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

聴覚HEI-OC1細胞を使用した作業

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K ビュー.  University of California, Los Angeles. House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

ビデオ: Working with Auditory HEI-OC1 Cells

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

発生生物学

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

神経科学

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

聴覚神経の光遺伝学的刺激

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

マウス蝸牛有毛細胞の効率的なIn vitro培養

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

著者スポットライト:聴覚研究のためのマウス有毛細胞の培養における進歩 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

生物学

Preparing Wedge Brain Slices to Visualize Auditory Neurons

Source: Fischl, M. J. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61664">In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the process of preparing wedge-shaped brain slices in a laboratory setting. Using a vibratome, a wedge-shaped slice from a mouse&#39;s brain is crafted with varying thickness. This slice contains the auditory nerve root positioned on the thicker end, while the hearing-related neurons are located on the thinner end.

聴覚ニューロンを可視化するためのくさび脳スライスの準備

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Brain ...

聴覚HEI-OC1細胞を使用した作業

要約

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この動画の章

不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、

外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

聴覚神経の光遺伝学的刺激

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ・クランプ記録

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

聴覚ニューロンを可視化するためのくさび脳スライスの準備

聴覚HEI-OC1細胞を使用した作業

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不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、

外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

聴覚神経の光遺伝学的刺激

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

聴覚ニューロンを可視化するためのくさび脳スライスの準備

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ・クランプ記録