This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.

1. 세포 배양 주 : 모든 세포 배양 프로토콜 적절한 세포 배양 기술을 이용하여 수행되어야한다 (: 실험실 편람, 볼륨 I 10 참조 용으로 세포 생물학의 제 3 장을 참조). HEI-OC1 세포는 적절한 부착 및 성장에 대한 세포 배양 접시의 추가 코팅 또는 치료를 필요로하지 않는다. 아주 중요한 : 세포 배양을 위해 유리 접시를 사용하지 않는; 표현형 및 약리학 적 약물로 세포의 생물학적 반응은 (게시되지 않은 G Kalinec &amp; F Kalinec)을 변경한다; 기존의 플라스틱 세포 배양 요리 (재료 / 장비의 표 참조)을 권장합니다. 오염을 방지하기 위해 무균 기술에 특별한주의를 지불하지만, HEI-OC1 세포와 항생제 (예를 들어, 암피실린 또는 스트렙토 마이신)를 사용하지 않습니다. 필요한 경우 인 HeLa 및 HEK-293 세포 HEI OC1-8, 다른 세포주 수와 이전 시험에서 대조군으로 사용되었지만, 암포 테리 신 B를 사용이 목적을 위해 허용합니다. <ol><li> 냉동 HEI-OC1 세포의 소생 참고 맥리는 13,14 vascularis에서이 프로토콜은, 동일한 유전자 도입 11,12 코르티 기관에서의 이러한 OC-K3, 우리 실험실에서 개발 된 마우스 및 SV-K1에서 다른 세포주와 함께 사용될 수있다. <ol><li> 액체 N 2에서 냉동 보관 HEI-OC1 세포의 병을 제거하고 37 ℃의 물을 욕조에 넣습니다. 바이알의 하반부 잠수함과 얼음의 소량 만이 병에 남아 때까지 해동 할 수있다. 70 % 알코올로 유리 병의 외부를 닦습니다. </li><li> (둘 베코 변형 이글 배지와 같은 예열 성장 배지 10 ㎖를 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 천천히 전체 부피 (~ 1.5 × 105 세포 / ㎖)을 적가 방식으로, 바이알로부터 세포를 피펫 및 배달 DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. </li><li> t를 버리고, 5 분간 300-500 XG에서 튜브를 원심 분리하여 DMSO를 제거그 상층 액을 다시 현탁 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS)의 9 ml의 세포. 매질과 반대로, 튜브의 바닥을 터치 피펫의 팁 서너 번 피펫에서 부유 세포의 광속 환류 덩어리 또는 세포를 해리하는 시트. </li><li> 100mm 직경의 비 처리 플라스틱 세포 배양 접시에서 배양 배지에 현탁하고 세포의 총 부피를 놓는다. </li><li> 10 % CO 2 (허용 조건)와 33 ° C에서 세포를 품어. </li></ol></li><li> HEI-OC1 세포의 계대 주 : 합류하기 전 (~ 80 %) 세포가 죽어 배양을 방지하기 위해 정지하고 계대 배양하게한다. 이 프로토콜은 또한 맥리에서 13, 14을 vascularis, 코르티 11, 12, 및 SV-K1의 기관에서 이러한 OC-K3와 같은 형질 전환 마우스에서 우리 실험실에서 개발 된 다른 세포주, 사용할 수 있습니다. <ol><li> PBS 2 ㎖로 세포를 오래된 매체를 제거하고 씻는다. &lt;/ 리&gt; <li> 표면적이 25cm 당 1 mL로하여, 0.25 % 트립신 용액으로 세포 단층을 커버. 세포의 40 % 이상이 분리되어야 다음 단계로 이동한다. 필요한 경우, 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 검사하고, &quot;때리고 또는 탭&quot;나머지 부착 세포를 분리 부드럽게 문화 요리를. 참고 : 세포 사망에이를 수 있습니다 오랜 기간 동안 트립신으로주의; 충분한 및 전송 된 셀 것 계획된 연구 부족.하지 </li><li> 1.1.3에 설명 된 절차에 따라, 세포를 재현 탁하고, 15 ml의 원추형 튜브에 옮긴다. </li><li> 300-500 XG에서 5 분 동안 원심 분리, 배지를 버리고 새로운 성장 배지로 세포를 수집하고, 적어도 네 개의 100mm 직경의 세포 배양 접시 그들을 시드. 접시 당 셀의 수는 회수 된 세포의 양에 의존 할 것이다. 10 % CO 2 (P-HEI-OC1)와 33 ° C에서 세포를 품어을 위해 필요한 다시 여러 번 분할계획된 실험이나 새로운 주식을 생성. </li><li> 재고 준비를 들어, 250-550 ml의 세포 배양 플라스크으로 100mm 직경의 요리를 교체; 실험을 위해, 작은 접시 또는 멀티 웰 플레이트보다 적합 할 수있다. </li><li> 그들이 도달 할 때까지 차별화를 들어, ~ 허용 조건에서 80 %의 합류를 HEI-OC1 세포를 배양; 다음 2 ~ 3 주 동안 5 % CO 2 (NP-HEI-OC1)를 39 ° C로 요리를 이동합니다. 참고 : 세포가 점진적으로 확산 죽어 중지됩니다. 죽은 세포를 제거하기 위해 매일 매체를 변경합니다. 더 이상 세포가 실험에 사용할 수 없습니다 일반적으로 4 ~ 주 후, 세포의 원래의 수에 따라. 세포가 NP 조건에서 배치로 분화 빨리 시작되지만 모든 셀은 동일한 속도로 분화. 중요한 것은 정성을 제공, (그림 4를 대표 결과를 참조) 분화 과정에서 발현 및 막 지역화 증가 prestin분화의 정도를 정량적으로 표시. </li></ol></li></ol> 2. 약물 세포 독성 연구 참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 (그림 1을 대표 결과를 참조)을 권장합니다. <ol><li> 세포 생존율 (MTT 분석) <ol><li> 1.2에 기술 된 절차에 따라 P-HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다. </li><li> 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요! </li><li> 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 제조 업체의 프로토콜 다음 MTT 분석을 수행합니다. 대개이 분석을위한 프로토콜은 다음과 같은 단계를 가지고 : <ol><li> 각 웰에 MTT 시약의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 보라색 ​​염료가 보일 때까지 2 ~ 4 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 다음 각 웰에 MTT 세제 시약 100 μl를 추가합니다. 판을 흔들지 마십시오. </li><li> 접시를 덮고 37 ℃에서 2 시간 4의 어둠 속에서 그것을 둡니다. </li><li> 블랭크 (단독 성장 배지)을 포함하여, 각 웰에 570 nm에서 흡광도를 측정하기위한 마이크로 플레이트 리더를 사용. 생존율 100 %의 대조군 세포의 평균 OD를 사용하여 데이터를 정규화한다. </li></ol></li></ol></li><li> 카스파 3/7 활성화 분석 참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다. <ol><li> 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다. </li><li> WH에 세포를 시드(100 μL 아니라 당) 96 웰 플레이트를 ITE 벽으로, 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요! </li><li> 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 각 제조 업체의 프로토콜 다음 카스파 분석을 수행합니다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고 <ol><li> , 시약을 준비들을 잘 혼합하고 실온에 평형 수 있습니다. </li><li> 배양기에서 세포를 제거하고, 플레이트를 실온으로 평형을 허용한다. </li><li> 같은 피펫 팁 다른 샘플을 포함 우물을 터치하지 않음으로써 교차 오염되지 않도록주의하면서 각 웰에 시약의 표시 금액을 추가합니다. </li><li> 접시를 덮고 300 ~ 500 rpm으로 접시 통을 사용하여 30 초 동안 혼합한다. </li><li> 적어도 30 분 동안 실온에서 플레이트를 인큐베이션. Determin경험적으로 최적의 잠복기를 전자. 실내 온도가 온도 변동이 발광 판독에 영향을 미칠 것이기 때문에, 항온 배양기를 사용하여 변동하는 경우. </li><li> 물론 각각의 발광을 측정하고 카스파 제 활성화의 100 %로 대조군 세포의 평균 발광을 사용하여 값을 정상화. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 분열 (증식) <ol><li> 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다. </li><li> 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 허용 조건에서 하룻밤 배양 한 다음 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요! </li><li> 처리 1 시간 후에는, 각각의 웰에 제조 100X BrdU의 1 μL를 추가 (5- 브로 모 -2&#39;- deoxyuri) 솔루션을 식사, 33 ° C에서 인큐베이터에 번호판을 반환합니다. </li><li> 12, 24, 48 시간 후, 해당 판에서 기존 매체를 제거하고 PBS 잘 한 번 각을 씻는다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따르는 세포 증식 분석을 수행한다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고 <ol><li> / 정착 포함 제조자의 프로토콜에 표시된 변성 용액을 세척 완충액, 일차 항체 검출 용액 이차 항체 검출 용액 및 BrdU의 솔루션 시약을 준비한다. </li><li> 제조자의 프로토콜에 명시된 양으로, 각 웰에 고정 / 변성 용액을 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 플레이트를 유지한다. </li><li> 고정 / 변성 용액을 제거하고 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도 차 항체를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 유지한다. </li><li> 기본 개미와 솔루션을 제거ibody, 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척 한 다음 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도에서 차 항체를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 이차 항체와 함께 플레이트를 유지한다. </li><li> 보조 항체 솔루션을 제거 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 기판을 추가합니다. 실온에서 10 분간 배양 한 후, 정지 액을 합한다. 주의 : 색상의 변화를 제어; 용액이 매우 어두운지면, 10 분의 표준 현상 시간 전에 반응을 정지. </li><li> 정지 솔루션을 추가 30 분 이내에 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 독성 참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다. <ol><li> 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어. </li><li> 치료 끝에PBS로 세포를 세 번 세척하고, 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 표면적이 25cm 당 1 ml의 분리를 사용. </li><li> 분리 후, 수집하고 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠릿, 상층 액을 제거하고 세포 독성 분석에 포함 된 시약으로 어둠 속에서 15 분 동안 세포를 염색. </li><li> 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 라이브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다. </li></ol></li><li> 노화 <ol><li> 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어. </li><li> 신뢰할 수있는 결과를 제공하는 것으로 알려져 Debacq-Chainiaux 외. (15) 또는 다른 방법에 의해 기재된 프로토콜 유세포하여 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 양성 세포의 수를 결정한다. 유동 세포 계수를위한 간단한 프로토콜은 다음이다 : <ol> &lt;리&gt; 실험 치료 끝에, PBS로 세포를 세 번 세척하고 허가 조건에서 1 시간 동안 세포 배양 배지에 100 nM의 Bafilomycin A1 그들을 부화. </li><li> ~ 33 μM의 최종 농도 C12FDG을 추가하고 1-2 시간 동안 세포를 배양 계속합니다. </li><li> 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 표면적이 25 cm2로 당 한 용액을 사용하여 수확 PBS로 두 번 세포를 씻어, 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여이를 펠릿. </li><li> 얼음 - 냉각 PBS로 세포를 재현 탁하고 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유세포 포지티브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다. </li></ol></li></ol></li><li> 자식 작용 <ol><li> HEI-OC1 셀 제어 결핍 1.2에 기재된 절차를 수행하여 (48 시간 동안 혈청을 박탈) 표준 프로토콜 다음 웨스턴 블롯 그들을 처리 모은다. 일반적으로 웨스턴 블롯을위한 프로토콜은 다음과 같은 일이분기 EPS : <ol><li> 1.0 × 105 세포 / ml의 농도로 6 웰 플레이트에 시드 HEI-OC1 세포. 24 및 / 또는 48 시간 후, 빙냉 PBS로 세포를 세척 하였다. </li><li> 를 Lyse와 TNESV 버퍼 (1 % NP40, 50 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 100 mM의 NaCl을, 2mM의 EDTA, 1 mM의 나 3 VO 4) 얼음에 5 분간 프로테아제 억제제 칵테일과 1 ㎜ PMSF 200 μL. </li><li> (각 웰의 바닥을 긁어) 세포를 모으고 4 ℃에서 5 분 동안 16,800 XG에서 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮긴다. </li><li> 상청액을 수집하고 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 정량화. </li><li> 단백질을 변성 5 분 동안 5 배 로딩 버퍼와 각 샘플에 1 mM의 DTT과 종기를 추가합니다. </li><li> 4-12 %의 겔에서 SDS-PAGE를 사용하여 샘​​플을 실행하고 PVDF 막에 전송할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 60 분 동안 트윈 20 0.1 %와 TBS-T에서 5 % 무 지방 건조 우유와 세포막을 차단합니다. </li><li> 주 개미와 4 ° C에서 하룻밤 멤브레인을 품어ibodies. </li><li> 다음 날, TBS-T로 광범위하게 막을 세척하고, 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) (1 : 1,500)에 접합 보조 IgG 항체와 함께 품어 1 시간 동안. </li><li> 강화 된 화학 발광 (ECL) 감지 시스템과 면역 반응을 감지합니다. 표준 : (10 %의 무 지방 건조 우유, TBS-T에서 000 일) GAPDH를 사용하여 단백질의 발현 수준을 정상화. </li></ol></li><li> 웨스턴 블롯에서의 발현을 조사하는 적어도 그러한 Beclin-1과 같은 LC3B 자식 작용의 두 가지 지표 (통상적으로 1 : 2.5 %의 BSA와 TBS-T 1000 희석). GAPDH 또는 액틴 등의 단백질 발현의 제어를 찾을 것을 잊지 마십시오. </li><li> 이러한 공개 도메인 NIH 이미지 또는 ImageJ에 (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)와 같은 디지털 오 스캐너 또는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 농도계 관심있는 단백질의 발현을 평가한다. </li></ol></li></ol> HEI-OC1 세포 3. 전기 생리학 실험 <ol><li>수확 세포 참고 : 사용 세포가 50 % -80 %의 포화 상태에서 100mm 직경 배양 접시에 성장합니다. 트립신, Accutase하는 cetic 산 (PBS-EDTA)를 ETRA thylene D iamine t uffered의 알린 + 전자 나 효소가없는 솔루션, 또는 P hosphate-는 gigaseals의 수와 질에 심각한 영향없이 세포를 해제 사용할 수있다 . 그러나 어떤 경우에는, 트립신 처리 세포가 더 약해한다. 이러한 경우에, 세포는 실험을 시작하기 전에 약 30 분 동안 회복 할 수있다. <ol><li> 10 ml의 칼슘없이 PBS 2 + Mg를 2 +로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 3 분 동안 요리를 같은 비 효소 세포 분리 솔루션으로 효소가없는 분리기 용액 2 ㎖를 추가하고 품어. </li><li> 세포의 분리를 확인하기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다. 필요한 경우, 이동 CELL 배양 접시 더 세포를 분리하지만 가볍게 할. 참고 : 접시를 흔들지 마십시오. </li><li> DMEM + 10 % FBS 10 ML을 추가하고 부드럽게 및 10 ml의 피펫 다섯 번 아래로 세포를 피펫. </li><li> 현미경으로 세포 봐. 셀&gt; 80 %가 이미 (싱글)을 분리하는 경우, 더 피펫 팅이 필요하지 않습니다. 세포 클러스터 여전히 경우 80 % 이상의 세포가 하나가 될 때까지, 부드럽게 피펫 팅을 반복한다. </li><li> 100 XG에 2 분, 15 ML 원뿔 튜브에 원심 분리기를 정지 세포의 ~ 10 ml에 배치하고 상층 액을 버린다. </li><li> 세포를 재현 탁하기 - 외부 기록 솔루션 ~ 200 μl를 사용 (증류수로 310 mOsm 라이 보 비츠의 L-15 배지는 305로 조정). 셀의 광 제어 부드러운 막 가장자리 많은 단일 라운드 셀을 표시해야합니다. </li></ol></li><li> 패치 클램프 및 NLC 측정 <ol><li> 패치 클램프와를 사용하여 전압 의존 비선형 용량의 측정 (NLC)을 수행dequate 증폭기 및 소프트웨어뿐만 아니라 표준 전기 생리 학적 방법. 내부 (intrapipette) 용액 사용 150 밀리미터의 KCl, 1 ㎜의 MgCl 2, 0.1 mM의 EGTA, 2 mM의 ATP-마그네슘으로서, 0.1 mM의 GTP-나트륨, 10 mM의 HEPES; 트리스와 7.2로 산도를 조정합니다. </li><li> 현미경, 라운드 부드러운 막 가장자리 하나, 건강한 셀을 선택합니다. 세포 표면에 유리 피펫의 끝을 첨부하여 막 저항을 확인한다. 이는 1 ~ 2 ㎛, 피펫 팁의 내경 (ID)에 대응하는 약 3-6 수 MΩ이어야한다. </li><li> 조심스럽게 세포의 세포막에 대한 마이크로 피펫 팁을 누른 다음 흡입을 적용합니다. 100 기가 옴 (기가 시일) - 세포막의 일부 (10)의 순서로 전기 저항을 발생 피펫으로 흡입한다. </li><li> 흡입 펄스와 세포막을 파괴하여 전체 셀 조건을 확립한다. </li><li> 제어 9로, 같은 HEK-293과 같은 prestin을 표현하지 않는 세포를 사용하여. 참고 : 현재 응답은 5 kHz에서 필터링해야하고, 수정 잔류 직렬 저항의 효과를했다. 모든 데이터 수집 및 분석은 가장 일반적으로 로크 증폭기가 포함 된 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. 용량 함수는 막 전압 16 비선형 전하 관한 두 상태 볼츠만 함수의 1 차 도함수에 장착 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no existing or potential conflict of interest.

이 보고서에서 우리는 어떻게 문화 HEI-OC1 세포에 대해 설명하고 약물 유발 세포 독성의 메커니즘을 평가하기 위해 그들을 사용하고 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사. 기술적 방법은, 그러나, 다른 연구에 쉽게 적응 될 정도로 일반적이다. 여기에 설명 된 모든 프로토콜은 잘 확립 된 세포 배양 기술 (10)의 올바른 사용을 필요로한다. 그냥 다른 세포주와 마찬가지로, HEI-OC1 세포와 함께 작업하는 인증 된 생물 안전 캐비닛, 냉장 원심 분리기, 물 목욕, 세포 배양 검사에 대해 하나의 반전 현미경 및 계산 셀에 대한 제대로 갖추고 세포 배양 설비를 필요로 hemocytometric 기술을 사용하는 경우. 고유 한 요구 사항은, 그러나, NP-HEI-OC1 세포 39 ° C / 5 % CO 2에서 P-HEI-OC1 세포를 33 ° C / 10 % CO 2에서 두 가습 인큐베이터, 한 세트의 가용성 및 기타입니다에스. 계획된 연구는 단지 P-HEI-OC1 셀을 포함하는 경우, 상기 제 배양기는 37 ° C / 5 가지 분석법 때에는 % CO 2로 설정 될 수있다. 플라스틱 세포 배양 접시를 사용 HEI-OC1 셀로 작업에 중요한 추가 필수이다. 사실, HEI-OC1 세포는 매우 강력하고 다른면에서 매우 다른 조건에서 성장 그들은 것입니다. 그러나, 그들의 표현형 및 약물 및 기타 자극에 대한 반응이 강하게 문화 매개 변수 (G Kalinec &amp; F Kalinec, 미 출판)에 따라 달라집니다. 우리는 이전 용지 8 논의 된 바와 같이, 평 OC1 셀이 소성은 유리 신규 실험을 설계하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 잘 인공 외 림프 내의 산소 장력 해수면 (~ 21.3 kPa로) (27)의 전형적인 인큐베이터에서보다 (~ 2 kPa의) 매우 낮은 것으로 알려져있다. 아마,이 농도가 응답을 변경됩니다 낮은 O에서 HEI-OC1 세포를 배양 그들에게 감사를위한 더 나은 모델을 만들기모리 감각 세포. 문화 HEI-OC1 세포 배양 용 기재 프로토콜 또한 코르티 11,12 및 SV의 기관에서 OC-K3 같은 트랜스 제닉 마우스로부터 실험실에서 개발 된 다른 청각 세포주와 함께 사용될 수 있음을 강조해야 -K1 맥리에서 13, 14는 vascularis. 또한, 이러한 세포주를 선택 실험 HEI-OC1 세포 대조군으로서 유용하다. 예를 들어, 최근에 반비례 면역이 prestin하고 HEI-OC1 세포의 세포막에 나트륨 + K + ATPase의 항체가 세포 타입에 의존 응답보다는 형질 전환 마우스에서와 관련된 것을 증명하기 SV-K1 세포를 사용한 이는 이들 세포가 9 유도 하였다. HEI-OC1 세포 작업을위한 다른 중요한 요구 사항은 70 % 전자와 안전 캐비닛 내의 모든 작업 표면을 청소 적절한 무균 기술의 방법입니다thanol 또는 이소프로판올 및 절차에 필요한 물질의 오염 제거. 기타 포유류 세포주가 자주 페니실린 - 스트렙토 마이신 또는 다른 유사한 조합을 사용하여 부주의 세균 오염에 대해 보호하면서 그러나 항생제 연구의 목적은 그 영향을 조사하는 경우를 제외 HEI-OC1 세포를 사용해서는한다. HEI-OC1 세포는 항생제가없는 조건에서 발생하고, 그것들은 항생제 내성 세포의 출현을 감소시키기 위해 방지되어야한다. 마지막으로, 우리는 이미 점을 다시 강조하는이 보고서에서 여러 번 언급 할 : 표현형 및 약물 및 기타 자극에 HEI-OC1 세포의 반응이 강하게 문화 매개 변수에 따라 달라집니다. 따라서, 평 OC1 셀로 작업 실험실 다른 그룹에서 제공하는 것과 함께 그 결과 실제로 비교할 수 있도록하기 위해 유사한 프로토콜 및 세포 배양 조건을 사용하는 것이 매우 중요하다. 또한, 인매우 중요한 것은 HEI-OC1 세포 라인 만 모델이 모두 한계가있는 모델이라고 기억합니다. HEI-OC1 세포와 그 생체 외 실험을 기대하는 것은 정확하게 실제 청각 감각 세포의 생체 내 반응을 비현실적이다 나타내는 데이터를 제공합니다. 그러나, 우리는 강하게 HEI-OC1 세포 라인 기능 청각 감각 세포의 반응과 약물 약물의 가능성이 독성의 심사를 조사하기위한 유용한 모델입니다 생각합니다.

코르티 1의 하우스 귀 연구소 - 오르간은 (HEI-OC1) 세포를 형질 전환 마우스 1, 2의 청각 기관에서 파생됩니다. 33 ° C / 10 % CO 2 (허용 조건)에서이 형질 전환 마우스에서 어떤 세포의 배양은 역 분화 가속 확산을 트리거하는 불멸화 유전자의 발현을 유도; 39 ° C / 5 % CO 2 이상의 HEI-OC1, 세포사 2,3의 경우에, 증식, 분화를 감소하고 (비 허가 조건) 리드 세포 이동. HEI-OC1 세포를 복제하고, 10 년 전을 통해 우리의 실험실에있어서, 초기 연구는 특정 같은 prestin, 마이 오신 7A, Atoh1, BDNF, calbindin 및 칼 모듈 린 등의 인공 와우 유모 세포의 마커뿐만 아니라, 지원의 마커를 표현하는 지적했다 넥신 (26) 및 섬유 모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 등이 세포. 따라서, 평 OC1이 commo을 나타낼 수 있음을 시사되었다코르티 2의 기관의 감각과지지 세포 n 개의 전구. 페니실린과 같은 비 ototoxic 간주 약물, 2,3하지 않았다 동안 병렬 연구는 이러한 세포에서 카스파 제 -3 활성화 유도 시스플라틴 (cisplatin), 겐타 마이신과 스트렙토 마이신과 같은 ototoxic 약물을 원형 강력한 증거를 제공했다. 따라서,이 세포주는이 독성과 가능성이 독성하거나 새로운 pharmacological 약물 otoprotective 특성 선별 과정에도 세포 및 분자 메커니즘을 조사하기 시험 관내 시스템이 제안되었다. HEI-OC1 세포는 지난 10 년에 출판 이상의 백오십 연구에 사용 된 것으로 추정된다. 다른 약물의 잠재적 프로 - 세포 사멸 효과를보고하는 것은,이 세포주를 포함하는 대부분의 연구의 중요한 목표 이었지만, 자식 작용 및 노화와 같은 다른 중요한 세포 공정은 단지 HEI-OC1 세포 4-7 조사하기 시작했다. 나는NA는 우리의 실험실 (8)의 최근 연구는, 우리는 자주 병원에서 사용되는 다른 약물 약물에 의해 유도 된 세포 죽음, 생존, 증식, 노화와 자식 작용에 대한 데이터의 포괄적 인 세트를 수집하는 HEI-OC1 세포를 사용했다. 또한 동일한 처리를 수신하는 HEK-293 (인간 배아 신장 세포)와 헬라에서 해당 (인간 상피 세포)와 HEI-OC1 세포의 응답의 일부를 비교 하​​였다. 우리의 결과는 HEI-OC1 세포 연구중인 메커니즘 중 적어도 하나에 특유의 투여 량 및 시간 의존적 감도 특징적인 방식으로 각각의 약물에 반응 것으로 나타났다. 또한 실험 결과의 정확한 해석은 하나 이상의 기술 8과 평행 연구를 수행 할 필요하다고 그 연구에서 강조 하였다. 다른 연구에서는 prestin의 기능적 응답하여, 인공 모발 외부 셀 모터 단백질 (OHCs) 9를 평가 HEI-OC1 세포의 사용을 검토 </s&gt;입니다. 우리는 허용 (P-HEI-OC1) 및 비 - 배양 HEI-OC1 셀 내의 prestin 발현 패턴뿐만 아니라 비선형 커패시턴스 (NLC) 및 전체 셀 패치 클램프 실험을 유동 세포 계측법 및 공 초점 레이저 주사 현미경 연구보고 허용 (NP-HEI-OC1) 조건. 우리의 결과는 표기된 NP-HEI-OC1 세포에서 시간 의존적으로 총 prestin 발현 세포막 파악 증가 모두. 흥미롭게도 또한 발견 총 세포 발현에 상당한 변화없이 세포질로 세포막에서 전좌 나 + K + ATPase의 감소와 상관 관계가 NP-HEI-OC1 세포의 세포막에 prestin 지역화 증가. 또, P-HEI-OC1 세포는 강력한 NLC는 세포막에 존재 prestin 분자의 밀도가 증가 할 때 감소 된 운동 기능을 prestin하는 관련 있다고 설명했다. 요컨대, 이러​​한 결과는 강하게 HEI-OC의 유용성을 지원1 세포는 청각 단백질을 조사합니다. 이 비디오 기사에서 우리는 어떻게 약물 유발 세포 독성 및 방법의 메커니즘 / S를 평가하는 방법은 세포 독성 연구에 대한 (P-HEI-OC1) 허용 조건에서 성장 세포를 사용하는 것이 편리하다 왜 문화 HEI-OC1 세포에 설명 전기 생리 연구를 수행하기 위해 (예를 들어, 패치 클램프, 비선형 커패시턴스 (NLC))는 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사한다.

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1 cells</td><td></td><td></td><td>ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Class II Biological Safety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>AND COMPANIES INDICATED IN THE</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PRODUCT COULD BE USED.</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Two (2) Cell incubators, one at 33 &amp;deg;C/10% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and other at 39 &amp;deg;C/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes , PS,&amp;nbsp; 60 mm x 15 mm with vents&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue culture flasks&amp;nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue cultur&amp;nbsp; flasks 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;6 well cell culture plate, with lid-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium, no phenol red</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25%&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay&amp;nbsp; kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8091&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU Cell Proliferation Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Non-enzymatic cell dissociation solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII instrument&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>&amp;nbsp;FACSAriaIII</td><td>With 488 nm excitation (blue laser)</td></tr><tr><td>Digital Blot Scanner</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis and Blotting Unit</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Puller for preparing patch electrodes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

working with auditory hei-oc1 cells

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 &#176;C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 &#176;C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

최근 출판물의 몇에서 우리는 몇 가지 일반적으로 사용되는 약물 약물 HEI-OC1 세포의 반응을 평가뿐만 아니라 prestin 기능 8,9을 조사하기위한 연구의 포괄적 인 세트를보고했다. 이 연구에서 우리는 이전 섹션에 설명 된 모든 프로토콜을 사용했다. 이들 이전 연구의 결과들 중 하나는 HEI-OC1 세포가 비 - 허용 조건에서 배양하는 것이 있었다 (39 ° C / 10 % CO 2 = NP-HEI-OC1)가 세포 생존 능력에 매우 크게 감소하고 똑같이 현저한 증가를 보였다 세포 죽음, 허가 조건에서 배양 된 세포에 대해서 (33 ° C / 10 % CO 2 = P-HEI-OC1) (도 1). 따라서, 어떤 세포 독성 연구는 배양 조건의 영향에서 식별 약물 효과에 상당한 노력을 할애해야 NP-HEI-OC1 세포에서 수행. additio에서세포에 대한 약물의 효과는 이미 죽거나과 이후 N, 감소 된 생존이 건강한 세포에서 동일한 약물의 효과, 우리는 분화 된 세포를 특별히 필요하지 않은 실험을 위해 P-HEI-OC1 세포를 사용하는 것이 것이 다를 수있다. 다른 약물 약물의 효과에 대한 우리의 연구는 흥미로운 결과를 생산했다. 예를 들어, 시스플라틴, 화학 요법 제는 자주 여러 가지 인간의 악성 종양의 치료 및 아세트 아미노펜 (APAP = N- cetyl- 파 라 아미노 P는 henol)에 사용되는, 미국에서 가장 많이 판매 이상 - 더 - 카운터 진통제, (그림 2) HEI-OC1 세포에 대한 독성이 모두 있었다. APAP는 세포 생존을 감소 카스파 제를 활성화 3/7 증가하면서 그러나, 세포 사멸을 유도하지 않았다. 시스플라틴은 반대로 크게 세 가지 반응 (도 2) 증가 하였다. 흥미롭게도, 카스파 3/7은 mostl했다Y는 고용량 치명적인 효과를 oncosis / necroptosis과 연관 될 수있는 반면 시스플라틴의 낮은 복용량에 의해 유도하는 세포 사멸 아마, 세포 사멸에 의해 매개 된 제안, 낮은 시스플라틴의 농도에서 활성. oncosis는 세포 및 소기관 종창,에 blebbing 및 증가 된 세포막 투과 17,18 함께 비 조절 된 세포 사멸을 유도하는 프리 치명적인 경로로서 정의하였으나, necroptosis가 개시 동일한 자극에 의해 활성화 된 조절 된 비 - 아폽토시스 세포 사멸 메카니즘은 세포 사멸하지만 oncosis 19 ~ 22과 유사한 형태 학적 기능. APAP 및 P-HEI-OC1 세포에 대한 시스플라틴 (cisplatin)의 영향을 조사 할 목적으로 추가적인 연구는 이전 단락에 설명 된 세포 죽음없이 세포 생존에 흥미 감소를 설명 할 수있는 세포 증식 APAP의 명확한 용량 의존적 효과를 나타냈다 (도 3A). 시스플라틴 루게릭 병<html> O 세포 증식을 감소하고, 그 결과 심지어 소량 (도 3A)에 대한 노출 시간에 따라 증대하지만, 추가로 연구 (도 3B)에 포함 된 모든 농도 및 시간 지점에서 노화를 감소시켰다. 시스플라틴에 의해 유도 된 세포 노화의 유의 한 감소가 노화 세포가 될 것이라고 가정하고, 세포 사멸의 증가에 의해 설명 될 수있다, 아마 경향은 건강한 세포 (23)보다 더 빨리 죽을 수 있습니다. 중요한 것은, 이러한 대표적인 결과 평 OC1 세포 연구중인 메커니즘 중 적어도 하나에 특유의 투여 량 및 시간 의존적 감도 다른 약리학 적 약물에 반응 제안. 따라서, 모든 실험 결과의 정확한 해석을 조사 특정 세포 과정을 명확하게 이해하고 평가하기 위해 사용되는 기술의 각각에 의해 제공되는 정보를 필요로한다. &quot;FO =-together.within 페이지를 유지&quot;jove_content 1 &quot;&gt; 공 촛점과 다른 한편으로는, 실험 유동 세포 계측법은 prestin가에서 대부분 immunolocalizing으로, P-HEI-OC1 및 NP-HEI-OC1 세포에서 prestin 발현을 확인 P-HEI-OC1 세포 (도 4a의 화살표)의 세포질 및 NP-HEI-OC1 세포 (도 4b의 화살표)에서 원형질막 더 농축시켰다. 계측법 흐름 연구 NP-HEI에서 prestin 발현의 명확한 증가를 나타내었다 -OC1 세포가 P-HEI-OC1 세포 (도 4C와 4D)을 존중합니다. NP-HEI-OC1 세포에서 prestin의 발현 및 플라즈마 멤브레인 지역화의 시간에 따른 증가는 전위가 더 prestin 분자의 합성을 수반되었음을 시사한다. 그러나,이 실험들은 단지 새롭게 신디 세포질에 남아있는 경우 원래 세포막 새로운 분자 세포질 이동 위치한 prestin 분자가 교체 여부를 결정하는 데 단서를 제공하지 않았다세포막 또는 두 프로세스의 조합 esized prestin 이동한다. 전기 생리학 연구 세포가 1 비 허용 상태로 이동 한 감소 피크 값보다 탈 분극 값으로 시프트 최대 용량의 전압과 P-HEI-OC1 세포에서 강력한 NLC (도 5B)을 보였다 이주 (도 5C 및 5D). 때문에 세포막을 세포질에서 prestin 진보 전좌, 우리는 원래 NLC는 P-HEI-OC1 세포보다 NP-HEI-OC1 높은 것이라고하고 더 NP에서 배양 시간에 따라 증가한다고 가정 정황. 놀랍게도, 우리의 연구 결과는 정반대 반응을 보였다. 우리는 세포막에 prestin 분자의 밀도의 증가가 자신의 운동 기능을 제한 할 수 있음을 추측했다. 힌 페이지 = &quot;1&quot;&gt;도 5 OHCs 및 형질 HEK293 세포 (24)에보고 된 통상적 인 값에 대하여 HEI-OC1 세포에서 최대 용량에서 전압의 탈분극 참고; 또한, 탈분극 시프트 NP 조건에서 시간에 따라 증가하는 것이 관찰한다. 누진 탈분극 시프트 마우스 및 래트 개발 25,26 동안 OHCs에 기재된 것과 유사하며, 이는 그것이 OHC의 세포막 25 또는 극한 성숙 과정과 관련된 다른 셀룰러 구조의 발달과 관련이있을 수 있다고 제안했다 24 prestin합니다. 우리는 HEI-OC1 세포와 몇 가지 연구의이 짧은 재검 세포 및 분자 응답의 넓은 스펙트럼을 조사하는 HEI-OC1 세포의 잠재적 유용성의 충분한 증거를 제공 바랍니다. <html> 광고 / 54425 / 54425fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : P-HEI-OC1 및 NP-HEI-OC1 세포의 세포 생존 및 세포 죽음. (A) 세포 생존율은 MTT 분석법으로 평가 하였다. 흡광도를 플레이트 판독기로 측정하고, 대조군 세포의 평균 OD가 생존을 100 %로 하였다. 세포 독성 분석과 평가 (B) 세포 죽음. 530 15 나노 : 양 (죽은) 세포의 수는 세포 계측법 488 nm의 여기 (블루 레이저) 및 FL1과 흐름에 의해 결정되었다. 비 허가 조건에 의해 유도되는 세포 사멸 (B)에서 고도로 유의 (P ≤0.001) 세포 생존율의 감소 (A) 및 증가합니다. 바 수단 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 참조 8에서 수정. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="&lt;/ HTML">&quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 :. MTT, 카스파 3/7 및 세포 독성 분석 실험에 의해 분석 할 때 APAP 및 시스플라틴에 노출 HEI-OC1 세포의 응답 MTT 분석과 평가 (A) 세포 생존 능력, 흡광도는 플레이트 리더로 측정. 사형 집행의 카스파 3/7의 (B) 활성화. (C) 약물 - 세포 독성 분석과 평가에 의한 세포 사멸; 양극 (죽은) 세포의 수는 유동 세포 계측법으로 측정 하였다. 모든 실험 데이터는 가능한 동시 통계 분석을 위해 각각의 제어 조건 (제어 = 1)로 정규화 하였다. * = 제어 P ≤0.05 대해. 바 수단 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. fromreference 8 수정. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </A&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig3.jpg" /> 그림 3 : HEI-OC1 세포 &#39;유사 분열 속도와 노화에 APAP와 시스플라틴의 효과. (A) 24 및 48 시간에서 HEI-OC1 세포의 유사 분열 분열 속도의 약물 유발 변화는하는 BrdU의 분석으로 평가 하였다. HEI-OC1 세포 (B) 약물 - 유도 노화를 유세포 및 senescence-으로 측정했다 관련 β - 갈 락토시다 제 (SA-Bgal) 기술. 모든 실험 데이터는 가능한 동시 통계 분석을 위해 각각의 제어 조건 (제어 = 1)로 정규화 하였다. * = 제어 P ≤0.05 대해. 바 수단 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 수정 fromreference 8. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig3large.jpg" target="_blank">t의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>그의 그림. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig4.jpg" /> 그림 4 :. P-HEI-OC1 및 NP-HEI-OC1 세포의 Prestin의 표현 - 세포 안티 Prestin 항체로 표기하고 공 촛점 현미경 및 유동 세포 계측법에 의해 관찰되었다 (A) P-HEI-OC1 세포에서는에 대부분 immunolocalized prestin 세포질 (화살표). NP-HEI-OC1 셀 (B)은, 대조적으로, prestin 반응성 플라즈마 막 (화살표)로 농축시켰다. (C 및 D) NP 상태 (D)에서 2 주 동안 배양 HEI-OC1 세포 연구 유동 세포 계측법 P-HEI-OC1 세포 prestin 발현에 대하여 (C)에서 명확한 증가를 나타내었다. (C) 삽입 된 보조입니다 AB 만 (대조군). 참조 9에서 수정.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig5.jpg" /> 그림 5 :. P-HEI-OC1 및 NP-HEI-OC1 세포 (A) 패치 클램프 HEI-OC1 세포에서 NLC 연구. P-HEI-OC1에서 - (B D) NLC와 NP-HEI-OC1 세포. NLC의 피크의 감소와 더 NP-HEI-OC1 세포에서 값을 탈 분극 할 수있는 곡선의 점진적 변화를합니다. 참조 9에서 수정. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Working with Auditory HEI-OC1 Cells

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

청각 HEI-OC1 세포를 사용한 작업

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K 조회수.  University of California, Los Angeles. House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

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Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

연구

발생학

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

신경과학

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

청각 신경의 자극 Optogenetic

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

쥐 달팽이관 유모 세포의 효율적인 In vitro 배양

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

저자 스포트라이트: 청각 연구를 위한 쥐 유모 세포 배양의 발전 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

생물학

Preparing Wedge Brain Slices to Visualize Auditory Neurons

Source: Fischl, M. J. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61664">In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the process of preparing wedge-shaped brain slices in a laboratory setting. Using a vibratome, a wedge-shaped slice from a mouse&#39;s brain is crafted with varying thickness. This slice contains the auditory nerve root positioned on the thicker end, while the hearing-related neurons are located on the thinner end.

청각 뉴런을 시각화하기 위한 쐐기 뇌 슬라이스 준비하기

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Brain ...

청각 HEI-OC1 세포를 사용한 작업

요약

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신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

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