年齢、感染症、耳毒性薬は内耳の有毛細胞の変性を引き起こす可能性があり、それは私たちの中で難聴につながります。ひよこなどの非哺乳類脊椎動物では、有毛細胞を再生することができます。ここで説明する技術は、ニワトリ胚に取り組むことの費用対効果、胚の入手の容易さ、および組織外植片の良好な外出発達を利用している。
鳥類の内耳毛の発達と再生を理解することは、難聴と潜在的な治療法に関する重要な洞察を提供することができ、外植片培養は、さまざまな薬物の耳毒性効果を評価するために重要になる可能性があります。実験を開始する前に、産みたての卵を調達し、汚染を防ぐために70%エタノールで洗浄してください。卵を摂氏37〜48度、湿度45%で3.5〜4日間インキュベートします。
孵卵後、卵を横に5分間置き、胚を卵黄の上に再配置します。次に、鉗子を使用して卵の上部に小さな穴を開け、21ゲージの針が通過するように卵の端を鈍くします。5ミリリットルの注射器と21ゲージの針を使用して、卵の鈍い端の穴から2ミリリットルのアルブミンを取り除きます。
透明なテープを使用して鈍い端の穴を覆います。卵窓を作るには、卵殻の上部に透明なテープを貼り付けます。垂直ピペットプーラーを使用して、標準的なガラス毛細血管からのマイクロインジェクションから針を保持します。
引っ張った後、細い鉗子を使用して毛細管先端を切り離し、先細りの端を持つ約50マイクロメートルの先端直径を得る。遺伝子ノックアウト実験では、ガイドプラスミドpcU6.1sgRNA、T2KeGFP、T2TPの3つのコンストラクトを1対1の比率で、1マイクログラムのSP Cas9タンパク質、30%スクロース、0.1%ファストグリーン色素と混合し、最終容量は10マイクロリットルです。複数のプラスミドをエレクトロポレーションする際に、DNAの最終濃度がマイクロリットルあたり少なくとも4マイクログラムであることを確認してください。
スプリングボウハサミの助けを借りて、長さ2センチ、幅1.5センチの窓の周りを切り開き、胚を露出させます。次に、鉗子を使用して胚の上にある絨毛膜を開き、胚にアクセスできるようにします。約200ナノリットルのDNA溶液混合物を注入して、耳小胞を満たします。
ガイドRNA効率を決定するために、T7エンドヌクレアーゼアッセイを行う。胚に0.719%生理食塩水滴を加えて電気抵抗を下げ、過熱を防ぎます。次に、卵の鈍い側に作られた穴に正極を通し、卵黄の下になるように電極を操作します。
満たされた耳嚢胞の上に負極を置きます。エレクトロポレーションでプラスミドを耳小胞にトランスフェクトするには、方形パルス発生器を使用し、25ボルトの5つのパルスをそれぞれ100ミリ秒、50ミリ秒間隔で印加します。個々のエレクトロポレーション設定に基づいて経験的に条件を決定します。
エレクトロポレーション後、0.719%生理食塩水を数滴加えて胚を水和させます。卵を透明なテープで再密封し、さらに孵卵するために摂氏37〜38度で加湿インキュベーターに戻します。手術台、顕微鏡ステージ、およびその周辺を70%エタノールと熱、またはアルコールを使用して消毒し、最小限のスプリングボウハサミ、マイクロキュレット、および2組の細かい鉗子を含むマイクロ解剖装置を滅菌します。
黒いシリコンベースのガラスペトリ皿、90ミリメートルのプラスチック製のペトリ皿、および60ミリメートルのペトリ皿を含む解剖プレートを準備します。冷やしたPBSまたはHBSSとしても知られるハンクスのバランスの取れた塩溶液を解剖の準備をしてください。卵を90ミリメートルのペトリ皿にそっと割る。
次に、ひよこの外耳を特定し、氷のように冷たいPBSで満たされた60ミリメートルのペトリ皿に頭を移します。次に、くちばしの上部を内側に向けて胚の向きを変え、5番の鉗子の1つを使用してくちばしを保持します。2番目の5番目の鉗子を使用して目をすくい取ります。
次に、吻側から尾側まで、正中線に沿って頭蓋骨に沿って切り、脳をすくい取ります。氷のように冷たいPBS(HBSS)を追加し、ラゲナの2つの耳石を光沢のある構造として蝸牛管の端と正中線の近くに配置します。2つの内耳を隔離するには、2つのラゲナの間、および領域の上下を切ります。
次に、斜めの照明の下で内耳の輪郭を視覚化し、無関係な組織と前庭を取り除きます。単離した蝸牛を、氷冷PBSを備えた黒色のシリコンベースプレートに移します。5番鉗子を使用して軟骨性蝸牛カプセルを剥がし、蝸牛管を取得します。
次に、蝸牛管の起伏のある層または被蓋を見つけ、55番の鉗子を使用してそれを取り除き、脳底乳頭またはBPを露出させます。次に、55番の鉗子を使用して有毛細胞と支持細胞を露出させるために構造膜を取り外します。脳底乳頭の膜培養には、6ウェル組織培養プレートを取り、1ウェルにつき1つの培養膜インサートを配置します。200マイクロリットルのピペットで培地を作成し、解剖した脳底乳頭外植片を1つのX HBSSバッファーで吸引します。
外植体を膜に移し、脳底乳頭が上を向くように向きを変え、毛髪と支持細胞が上から見えるようにします。外植体が配置されたら、HBSS緩衝液を培養膜表面からゆっくりと吸引する。このプロセスでは、外植片は培養膜に付着します。
メンブレンインサートとウェル壁の間に1.2ミリリットルのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM培養培地)を加えて、6ウェルプレートのウェルを満たします。蝸牛管のコラーゲン培養物を調製するために、新たに調製したコラーゲン混合物を4ウェルプレートの各ウェルに3滴加え、解剖した蝸牛管を各コラーゲン滴に移す。プレートを摂氏37度で10分間インキュベートし、5%二酸化炭素でコラーゲンマトリックスを硬化させます。
培養物の低分子処理では、培養培地をペニシリンなどの薬理学的モジュレーターを添加した700マイクロリットルの培地に交換し、前述のようにプレートをインキュベートします。培養液の50%を毎日交換してください。適切なインキュベーション時間の後、培地を除去し、下流アッセイに外植片を使用します。
エレクトロポレーションのセットアップでは、正しい電極の位置により、両方の前庭器官の内耳でより高いGFP発現が得られ、聴覚脳底乳頭がトランスフェクションを確認しました。CRISPR Cas9は、内耳におけるAtoh1遺伝子ノックアウトを媒介し、有毛細胞の喪失をもたらした。OvoエレクトロポレーションによるAtoh1遺伝子ノックアウトとそれに続くE10までのインキュベーションは、空のプラスミドコントロールと比較して有毛細胞の発達の減少を示しました。
エレクトロポレーションはモザイクであるが、コントロールのエレクトロポレーション細胞は有毛細胞を形成することができた。Atoh1 gRNAエレクトロポレーションサンプルでは、緑色蛍光タンパク質陽性細胞は有毛細胞発生のマーカーを示さなかった。コラーゲンなどの3Dマトリックス中の脳底乳頭の臓器培養は、有毛細胞抗原に対する抗体による染色剤により、最大5日間組織形態の優れた保存を提供しました。
有毛細胞および支持細胞の組織は、これらの培養条件において維持された。膜上の臓器培養は、毛束の完全性を維持しながら最大5日間維持することができます。これは、先端リンクタンパク質であるプロトカドヘリン15の局在化によって代表像に見ることができる。
毛束の発達を調査するために、超解像顕微鏡や走査型電子顕微鏡などの高解像度イメージングは、より多くの情報を提供することができます。無菌状態は処置を通して維持されるべきです。エレクトロポレーション中は、胚が乾いていないことを確認してください。
薬理学的阻害剤を滴定する場合、致死性を克服するために濃度を下げることができます。胚と外植片の両方をイメージング実験のために採取することができます。プロトコルに示されているように、リアルタイムのビデオ顕微鏡、または静的光共焦点電子顕微鏡を実行するかのいずれか。
ニワトリ内耳外植片の使用の容易さとアクセスのしやすさを考えると、プルーフスクリーニングを通じて培地を使用して、有毛細胞の再生に不可欠な新しい分子を特定することができます。
