This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li><li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening.">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li><li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells:+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways.">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li><li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line.">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li><li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress.">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li><li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells.">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li><li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity.">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li><li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function.">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).</li><li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents.">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li><li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines.">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li><li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse.">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li><li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis:+in+vitro+and+in+vivo+evidence.">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance.">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+pyroptosis,+and+necrosis:+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells.">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li><li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+necrosis:+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways.">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li><li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+kind+of+cell+suicide:+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis.">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li><li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation.">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li><li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+signaling+of+the+Fas+receptor:+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways.">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li><li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+cellular+senescence,+and+cancer.">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li><li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin's+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events.">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse.">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li><li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat.">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li><li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+Oxygen+Tension:+Relation+to+Blood+Flow+and+Function.">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li></ol>

The authors declare no existing or potential conflict of interest.

In diesem Bericht beschreiben wir, wie sie zur Kultur HEI-OC1-Zellen und verwenden Mechanismen der medikamenteninduzierten Zytotoxizität zu bewerten und funktionellen Eigenschaften von Prestin, der molekulare Motor der Cochlea-OHC zu untersuchen. Die technischen Verfahren sind jedoch allgemein genug, um leicht an verschiedene Studien anzupassen. Alle Protokolle hier beschrieben sind, erfordern die korrekte Verwendung von gut etablierten Zellkulturtechniken 10. Genau wie bei jedem anderen Zelllinie, die Arbeit mit HEI-OC1-Zellen erfordert einen entsprechend ausgerüsteten Zellkultur-Anlage, mit einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank, einer gekühlten Zentrifuge, ein Wasserbad, und ein inverses Mikroskop zur Untersuchung von Zellkulturen und zum Zählen von Zellen bei Verwendung von hemocytometric Techniken. Eine einzigartige Voraussetzung ist jedoch die Verfügbarkeit von zwei befeuchteten Inkubatoren, ein Satz bei 33 ° C / 10% CO 2 für P-HEI-OC1 - Zellen und anderen bei 39 ° C / 5% CO 2 für NP-HEI-OC1 Zelles. Wenn die geplanten Studien nur P-HEI-OC1 - Zellen beteiligt sind , können die zweite Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 für verschiedene Tests eingestellt werden. Die Verwendung von Kunststoff-Zellkulturschalen ist eine wichtige zusätzliche Voraussetzung für die mit HEI-OC1-Zellen arbeiten. In der Tat sind HEI-OC1-Zellen sehr robust, und sie werden das Wachstum in verschiedenen Oberflächen und unter sehr unterschiedlichen Bedingungen. Allerdings ist ihr Phänotyp und ihre Reaktion auf Medikamente und andere Stimuli wird stark abhängig von den Kulturparameter (G Kalinec &amp; F Kalinec, nicht veröffentlicht). Wie wir in einer früheren Arbeit 8 diese Plastizität von HEI-OC1 - Zellen argumentiert vorteilhaft neuartige Experimente verwendet werden können , zu entwickeln. Beispielsweise ist es gut bekannt , dass die Sauerstoffspannung in der Cochlea Perilymphe ist viel geringer (~ 2 kPa) als in einem typischen Brutschrank auf Meereshöhe (~ 21,3 kPa) 27. Bebrütung von HEI-OC1 - Zellen bei niedrigeren O 2 -Konzentrationen ihre Antworten ändern, vielleicht um ihnen ein besseres Modell für die Prüfung zu machenory Sinneszellen. Es sollte betont werden , dass die beschriebenen Protokolle und Subkultur von HEI-OC1 - Zellen können auch mit anderen auditory Zelllinien entwickelt , in unserem Labor aus der gleichen transgenen Maus, wie OC-k3 von Corti - Organ und 11,12 SV verwendet werden -k1 von Stria vascularis 13,14. Darüber hinaus könnten diese Zelllinien als Kontrolle für HEI-OC1-Zellen in ausgewählten Experimenten nützlich sein. Zum Beispiel haben wir SV-K1 - Zellen zeigen , dass die umgekehrt proportional Immunreaktivität prestin und Na + K + ATPase - Antikörper an der Plasmamembran von HEI-OC1 - Zellen war zelltypabhängige Reaktion statt , die mit der transgenen Maus kürzlich verwendet , um aus welche diese Zellen wurden 9 abgeleitet. Andere wichtige Voraussetzung für das Arbeiten mit HEI-OC1-Zellen ist die Praxis der entsprechenden aseptischen Techniken wie alle Arbeitsflächen innerhalb der Sicherheitswerkbank mit 70% e Reinigungthanol oder Isopropanol und die Dekontamination von Materialien für die Verfahren erforderlich. Während jedoch andere Säugerzelllinien häufig gegen unbeabsichtigtes bakterielle Kontamination geschützt werden unter Verwendung von Penicillin-Streptomycin oder andere ähnliche Kombinationen, Antibiotika darf niemals mit HEI-OC1-Zellen mit Ausnahme verwendet werden, wenn der Zweck der Studie ist, deren Auswirkungen zu untersuchen. HEI-OC1-Zellen wurden in antibiotikafreien Bedingungen erzeugt wird, und sie müssen vermieden werden, um die Entstehung von Antibiotika-resistenten Zellen zu reduzieren. Schließlich wollen wir einen Punkt nochmals zu betonen, bereits mehrmals in diesem Bericht erwähnt: der Phänotyp und die Antwort von HEI-OC1-Zellen auf Medikamente und andere Reize stark von den Kulturparametern abhängen. Daher ist es sehr wichtig, dass die Laboratorien arbeiten mit HEI-OC1-Zellen verwenden ähnliche Protokolle und Zellkulturbedingungen, um ihre Ergebnisse wirklich mit den von anderen Gruppen zur Verfügung gestellt vergleichbar zu machen. Darüber hinaus ist essehr wichtig, dass der HEI-OC1-Zelllinie ist nur ein Modell, mit allen Einschränkungen zu bedenken, dass ein Modell hat. Erwartung , dass in - vitro - Experimente mit HEI-OC1 - Zellen werden Daten , die die In - vivo - Antworten von realen Gehörsinneszellen genau liefern darstellen unrealistisch ist. Wir glauben jedoch, stark die HEI-OC1-Zelllinie für die Untersuchung von funktionellen Antworten von Gehörsinneszellen und das Screening der potenziellen ototoxicity pharmakologischer Wirkstoffe ein nützliches Modell ist.

House Ear Institute-Corti - Organ 1 (HEI-OC1) Zellen werden aus dem Hörorgan einer transgenen Maus 1,2 abgeleitet. Inkubation einer beliebigen Zelle aus dieser transgenen Maus , bei 33 ° C / 10% CO 2 (permissive Bedingungen) induziert die Expression eines Gens , das Immortalisieren Entdifferenzierung und beschleunigter Proliferation auslöst; Bewegen der Zellen auf 39 ° C / 5% CO 2 (nicht-permissive Bedingungen) führen zu einer verminderten Proliferation, Differenzierung und zumindest im Fall von HEI-OC1, Zelltod 2,3. HEI-OC1-Zellen wurden in unserem Labor vor über einem Jahrzehnt kloniert und charakterisiert, und die anfängliche Studien gezeigt, dass sie spezifische Marker der Cochlea-Haarzellen, wie prestin, Myosin 7a, Atoh1, BDNF, Calbindin und Calmodulin exprimieren, sondern auch Marker der Stütz Zellen wie Connexin 26 und Fibroblasten - Wachstumsfaktor - Rezeptor (FGF-R) 2. Daher wurde vorgeschlagen, dass HEI-OC1 eine commo darstellen könnten Vorläufer für sensorische und Stützzellen des Corti - Organ 2. Parallel Studien lieferten starke Hinweise darauf , dass ototoxic Medikamente wie Cisplatin, Gentamicin und Streptomycin induzierte Caspase-3 - Aktivierung in diesen Zellen archetypischen, während Medikamente als nicht-ototoxische, wie Penicillin, nicht 2,3. Daher wurde diese Zelllinie als ein in vitro - System vorgeschlagen , um die zellulären und molekularen Mechanismen in Ototoxizität beteiligt zu untersuchen , und für das Screening des potentiellen Ototoxizität oder otoprotektiven Eigenschaften neuer pharmakologischer Wirkstoffe. Es wird geschätzt, dass HEI-OC1-Zellen wurden in mehr als einhundertfünfzig Untersuchungen in den letzten zehn Jahren veröffentlicht verwendet. Während der Suche das Hauptziel der meisten Studien war auf dem Potential pro-apoptotische Wirkung verschiedener Medikamente beteiligt diese Zelllinie, andere wichtige Zellprozesse wie Autophagie und Seneszenz haben gerade erst begonnen 4-7 in HEI-OC1 - Zellen untersucht werden. ichna aktuelle Studie aus unserem Labor 8 verwendeten wir HEI-OC1 - Zellen einen umfassenden Satz von Daten über den Zelltod, Überleben, Proliferation, Seneszenz und durch unterschiedliche pharmakologische Wirkstoffe in der Klinik verwendet häufig induzierten Autophagie zu sammeln. Wir verglichen auch einige der Antworten von HEI-OC1-Zellen mit denen aus HEK-293 (menschliche embryonale Nierenzellen) und HeLa (humane Epithelzellen) Empfangen identische Behandlung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass HEI-OC1 Zellen an die jedes Medikament in einer charakteristischen Art und Weise, mit einem unverwechselbaren dosis- und zeitabhängige Empfindlichkeit auf mindestens einer der Mechanismen zu untersuch reagieren. Wir betonten auch in dieser Studie , dass eine korrekte Interpretation der experimentellen Ergebnisse erfordern parallel Studien mit mehr als eine Technik 8 durchgeführt wird . In einer anderen Studie untersuchten wir die Verwendung von HEI-OC1 - Zellen die funktionelle Reaktion von Prestin, das Motorprotein von Cochlea äußeren Haarzellen (OHC) 9 zu bewerten </sup&gt;. Wir berichteten Durchflusszytometrie und der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie Studien über die Muster von Prestin Ausdruck, sowie nichtlineare Kapazität (NLC) und Ganzzell-Patch-Clamp-Untersuchungen in HEI-OC1-Zellen, die in permissiven (P-HEI-OC1) und nicht permissive (NP-HEI-OC1) Bedingungen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Gesamt prestin Expression und Plasmamembran-Lokalisations Anstieg in einer zeitabhängigen Weise in NP-HEI-OC1-Zellen. Interessanterweise fanden wir auch , dass der Anstieg in prestin Lokalisierung in der Plasmamembran von NP-HEI-OC1 - Zellen mit einer Abnahme korreliert in Na + K + ATPase, welche von der Plasmamembran zum Zytoplasma ohne wesentliche Änderungen in Gesamtzellexpressions transloziert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass P-HEI-OC1-Zellen haben eine robuste NLC Motorfunktion prestin verbunden, die abnimmt, wenn die Dichte der prestin Moleküle, die an der Plasmamembran erhöht. Insgesamt stark diese Ergebnisse die Nützlichkeit von HEI-OC unterstützen1-Zellen auditorischen Proteine ​​zu untersuchen. In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie HEI-OC1-Zellen zu Kultur, warum es bequem ist, Zellen zu verwenden, die an der permissiven Bedingungen (P-HEI-OC1) für Zytotoxizitätsuntersuchungen, wie der Mechanismus / s von arzneimittelinduzierten Zytotoxizität zu bewerten und wie elektro~~POS=TRUNC Untersuchungen (zB Patch-clamp, nicht-lineare Kapazität (NLC)) durchzuführen funktionellen Eigenschaften von prestin, der molekularen Motor Cochlea OHCs zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1 cells</td><td></td><td></td><td>ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Class II Biological Safety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>AND COMPANIES INDICATED IN THE</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PRODUCT COULD BE USED.</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Two (2) Cell incubators, one at 33 &amp;deg;C/10% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and other at 39 &amp;deg;C/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes , PS,&amp;nbsp; 60 mm x 15 mm with vents&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue culture flasks&amp;nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue cultur&amp;nbsp; flasks 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;6 well cell culture plate, with lid-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium, no phenol red</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25%&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay&amp;nbsp; kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8091&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU Cell Proliferation Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Non-enzymatic cell dissociation solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII instrument&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>&amp;nbsp;FACSAriaIII</td><td>With 488 nm excitation (blue laser)</td></tr><tr><td>Digital Blot Scanner</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis and Blotting Unit</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Puller for preparing patch electrodes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

working with auditory hei-oc1 cells

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 &#176;C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 &#176;C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

In ein paar jüngsten Veröffentlichungen berichteten wir eine umfassende Reihe von Studien zur Bewertung der Reaktion von dem Ziel HEI-OC1 - Zellen auf mehrere häufig verwendete pharmakologische Wirkstoffe sowie die Untersuchung prestin Funktion 8,9. In diesen Studien haben wir die Verwendung aller Protokolle in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben. Eines der Ergebnisse dieser früheren Studien war , dass HEI-OC1 - Zellen bei nicht-permissiven Bedingungen kultiviert (39 ° C / 10% CO 2 = NP-HEI-OC1) eine hochsignifikante Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen zeigte, und einen ebenso signifikanten Anstieg in Zelltod Bezug auf Zellen bei permissiven Bedingungen (33 ° C / 10% CO 2 = P-HEI-OC1) (Abbildung 1) kultiviert. Daher erfolgt jede Zytotoxizität Studie über NP-HEI-OC1-Zellen sollten erhebliche Anstrengungen bei der Unterscheidung Arzneimittelwirkungen von den Auswirkungen der Kulturbedingungen widmen. in addition, da Arzneimittelwirkungen auf die Zellen sterben oder bereits mit einer verringerten Lebensfähigkeit könnte unterschiedlich sein, daß die Wirkungen desselben Arzneimittels auf gesunde Zellen, wir P-HEI-OC1-Zellen für Experimente empfehlen, die spezifisch nicht differenzierten Zellen erfordern. Unsere Untersuchungen über die Wirkung verschiedener pharmakologischer Wirkstoffe produzierte auch interessante Ergebnisse. Beispielsweise Cisplatin, ein chemotherapeutisches Mittel zur Behandlung von verschiedenen menschlichen Tumoren häufig verwendet, und Acetaminophen (APAP = N- eine Cetyl- pa ra-amino p henol), die am häufigsten verkauft over-the-counter Schmerzmittel in den USA, beide toxisch waren für HEI-OC1 - Zellen (Abbildung 2). Doch während APAP die Lebensfähigkeit der Zellen verringert und erhöhte Caspase 3/7 Aktivierung, es hat nicht den Zelltod auslösen. Cisplatin, dagegen deutlich stärker auf die drei Antworten (Abbildung 2). Interessanterweise waren Caspasen 3/7 Möstly aktiviert bei niedrigeren Konzentrationen Cisplatin, was darauf hindeutet, dass der Zelltod durch niedrige Dosen von Cisplatin induziert wahrscheinlich durch Apoptose vermittelt wurde, während hohe Dosen letalen Wirkungen mit Onkose / Nekroptose in Verbindung gebracht werden könnte. Während Onkose hat als Pre-lethal Weg führt zu ungeregelten Zelltod begleitet von zellulären und Organell Schwellung, blebbing und erhöhte Membranpermeabilität 17,18 definiert worden ist , ist eine geregelte Nekroptose nicht-apoptotischen Zelltod - Mechanismus durch die gleichen Stimuli aktiviert , die initiieren Apoptose , jedoch mit morphologischen Eigenschaften ähnlich denen von Onkose 19-22. Weitere Studien mit der Auswirkungen von APAP Untersuchung und Cisplatin auf P-HEI-OC1 - Zellen zeigten eine deutliche, dosisabhängige Wirkung von APAP auf die Zellproliferation, die die faszinierende Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen ohne den Zelltod im vorhergehenden Absatz beschriebenen erklären konnte (Abbildung 3A). Cisplatin als<html> o verminderte Zellproliferation, und seine Wirkung mit der Zeit der Belichtung verstärkt auch bei kleinen Dosen (3A), aber zusätzlich verringert Seneszenz bei allen Konzentrationen und Zeitpunkte in unserer Studie aufgenommen (3B). Die signifikante Abnahme der Zelle , die durch Cisplatin induzierte Seneszenz durch die Erhöhung der Zelltod erklärt werden könnte, vorausgesetzt , dass seneszenten Zellen wahrscheinlich wäre, anfällig schneller zu sterben , als gesunde Zellen 23. Wichtig ist, deuten diese Ergebnisse, dass die repräsentativen HEI-OC1-Zellen auf unterschiedliche pharmakologische Wirkstoffe mit ausgeprägtem dosis- und zeitabhängige Empfindlichkeit auf mindestens einer der Mechanismen zu untersuch reagieren. Daher wird eine korrekte Interpretation von jedem experimentellen Ergebnis ein klares Verständnis für die besonderen zellulären Prozesse untersucht erfordern und die durch jede der Techniken zur Verfügung gestellten Informationen verwendet, um sie zu bewerten. jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Die konfokale und Durchflusszytometrie Experimente, auf der anderen Seite bestätigt Prestin-Expression in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1-Zellen, mit prestin immunolocalizing meist bei der Zytoplasma von P-HEI-OC1 - Zellen (4A, Pfeile), und konzentrierter an der Plasmamembran in NP-HEI-OC1 - Zellen (4B, Pfeile). die Durchflusszytometrie Studien zeigten einen deutlichen Anstieg der Prestin - Expression in NP-HEI -OC1 Zellen bezüglich P-HEI-OC1 - Zellen (4C und 4D). Die zeitabhängige Erhöhung der Expression und Plasmamembran Lokalisierung von Prestin in NP-HEI-OC1 - Zellen legt nahe , dass die Translokation durch die Synthese von mehr prestin Molekülen begleitet wurde. Allerdings bieten diese Experimente Hinweise nicht zu entscheiden, ob prestin Moleküle ursprünglich im Zytoplasma Bewegung zu der Plasmamembran befindet und neue Moleküle ersetzt sie, wenn sie im Cytoplasma verbleiben und nur der neu synthesized prestin bewegt sich in die Plasmamembran oder eine Kombination beider Verfahren. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten eine robuste NLC in P-HEI-OC1 - Zellen (5B), mit einem Spitzenwert, verringert und eine Spannung bei Spitzenkapazität, die zu mehr depolarisierten Werten verschoben, wenn die Zellen auf nicht-permissiven Bedingungen für 1 verschoben wurden , und 2 Wochen (5C und 5D). Aufgrund der fortschreitenden Translokation von prestin aus dem Zytoplasma in die Plasmamembran, die Hypothese aufgestellt ursprünglich dass NLC höher in NP-HEI-OC1 wäre als in P-HEI-OC1-Zellen, und dass es weiter mit der Zeit der Inkubation bei NP erhöhen Bedingungen. Überraschenderweise zeigten die Ergebnisse unserer Studien genau die entgegengesetzte Reaktion. Wir spekulierten, dass die Erhöhung der Dichte von prestin Moleküle in der Plasmamembran ihrer Motorik werden beschränken könnte. Hin-page = &quot;1&quot;&gt; Hinweis in Abbildung 5 die Depolarisation der Spannung bei Spitzenkapazität in HEI-OC1 - Zellen zu den typischen Werten in OHC und in HEK293 Zellen 24 berichtet , achten; Darüber hinaus beobachten, dass die depolarisierende Verschiebung mit der Zeit zunimmt bei NP Bedingungen. Die progressive depolarisierenden Verschiebung ist ähnlich der in OHCs bei Maus und Ratte Entwicklung 25,26 beschrieben ist , und es war vorgeschlagen worden , dass es mit der OHC der Plasmamembran 25 oder einem Reifungsprozess assoziiert mit der Entwicklung anderer zellulärer Strukturen in Beziehung gesetzt werden könnte intrinsische zu Prestin 24. Wir hoffen, dass diese kurze Neuauszählung der wenigen Studien mit HEI-OC1-Zellen genügend Beweise für die potentielle Nützlichkeit von HEI-OC1-Zellen bieten ein breites Spektrum von Zell- und Molekularreaktionen zur Untersuchung. <html> ad / 54425 / 54425fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Zelllebensfähigkeit und Zelltod in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1 - Zellen. (A) Die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem MTT - Test bewertet. Die Extinktion wurde mit einem Plattenleser gemessen und die mittlere OD in Kontrollzellen wurde als 100% der Lebensfähigkeit genommen. (B) Der Zelltod mit einem Cytotoxicity Assay ausgewertet. 530 15 nm: Die Anzahl der positiven (toten) Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie mit 488 nm Anregung (blauer Laser) und FL1 bestimmt. Beachten Sie die hochsignifikant (P ≤0.001) Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen (A) und der Erhöhung der Zelltod (B) , induziert durch nicht-permissiven Bedingungen. Die Balken stellen Standardfehler der Mittelwerte (SEM). Geändert von Referenz 8. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="&lt;/ Html">&quot;2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2:. Antworten von HEI-OC1 Zellen Exposed APAP und Cisplatin bei Analysiert von MTT, Caspasen 3/7 und Zytotoxizitätstests (A) Lebensfähigkeit Zelle mit dem MTT - Test ausgewertet, und die Absorption mit einem Plattenlesegerät gemessen. (B) Aktivierung von Caspasen Henkers 07.03. (C) Drug - induzierte Zelltod mit einem Zytotoxizitätstest ausgewertet; die Zahl der positiven (toten) Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Daten in jedem Experiment wurde an die jeweiligen Steuerbedingungen normalisiert (Kontrolle = 1) möglich gleichzeitige statistische Analyse zu machen. * = P ≤0.05 Bezug auf Kontrolle. Die Balken stellen Standardfehler der Mittelwerte (SEM). Modifizierte fromreference 8. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </a&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig3.jpg" /> Abbildung 3: Auswirkungen von APAP und Cisplatin auf HEI-OC1 Cells Mitoserate und Seneszenz. (A) Arzneimittelinduzierte Veränderungen auf die Geschwindigkeit der mitotischen Teilung von HEI-OC1 - Zellen nach 24 und 48 h wurde mit einem BrdU - Assay ausgewertet. (B) Arzneimittel-induzierter Seneszenz in HEI-OC1 - Zellen durch Durchfluss - Zytometrie gemessen wurde , und dem senescence- assoziierten β-Galactosidase (SA-bGal) -Technik. Daten in jedem Experiment wurde an die jeweiligen Steuerbedingungen normalisiert (Kontrolle = 1) möglich gleichzeitige statistische Analyse zu machen. * = P ≤0.05 Bezug auf Kontrolle. Die Balken stellen Standardfehler der Mittelwerte (SEM). Modifizierte fromreference 8. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version von t anzuzeigen</a>seine Figur. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Prestin Expression in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1 Zellen - Zellen wurden Beschriftet mit Anti-Prestin Antikörper und Beobachtet von konfokale Mikroskopie und Durchflusszytometrie (A) In P-HEI-OC1 - Zellen Prestin immunolocalized meist an das Zytoplasma (Pfeile). (B) In NP-HEI-OC1 - Zellen wurde im Gegensatz dazu prestin Reaktivität an der Plasmamembran (Pfeile) konzentriert. (C und D) Durchflusszytometrie Studien in HEI-OC1 - Zellen, die für 2 Wochen bei NP Bedingungen (D) zeigte eine deutliche Steigerung der prestin Ausdruck in Bezug auf P-HEI-OC1 - Zellen (C). (C) Inset ist zweitrangig ab allein (negative Kontrolle). Geändert von Referenz 9.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54425/54425fig5.jpg" /> Abbildung 5: NLC Studien in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1 - Zellen (A) Patch-geklemmt HEI-OC1 Zelle.. (B - D) NLC in P-HEI-OC1 und NP-HEI-OC1 - Zellen. Man beachte die Abnahme in der Spitze der NLC und die schrittweise Verschiebung der Kurven zu mehr depolarisiert Werte in NP-HEI-OC1-Zellen. Geändert von Referenz 9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54425/54425fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Working with Auditory HEI-OC1 Cells

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

Arbeiten mit Auditory HEI-OC1-Zellen

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

Serie: Working with Auditory HEI-OC1 Cells

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Neurowissenschaften

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Effiziente In-vitro-Kultivierung von Cochlea-Haarzellen der Maus

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der Kultivierung von Haarzellen von Mäusen für die auditive Forschung 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

Biologie

Preparing Wedge Brain Slices to Visualize Auditory Neurons

Source: Fischl, M. J. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61664">In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the process of preparing wedge-shaped brain slices in a laboratory setting. Using a vibratome, a wedge-shaped slice from a mouse&#39;s brain is crafted with varying thickness. This slice contains the auditory nerve root positioned on the thicker end, while the hearing-related neurons are located on the thinner end.

Vorbereiten von Keilhirnschnitten zur Visualisierung auditiver Neuronen

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Brain ...

Arbeiten mit Auditory HEI-OC1-Zellen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von

Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis

Optogenetische Stimulation des Hörnervs

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

Vorbereiten von Keilhirnschnitten zur Visualisierung auditiver Neuronen